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复合酶法辅助提取短梗五加叶中金丝桃苷*
蔡恩博，许京，郑小曼，王亚楠，王大龙，郑曼玲，刘享享，赵岩
(吉林农业大学中药材学院，长春 130118)
摘 要 目的 通过复合酶法辅助提取短梗五加叶中金丝桃苷，以优化其提取工艺。方法 采用高效液相色谱法
测定金丝桃苷;采用正交实验法考察温度、α-淀粉酶、中性蛋白酶、纤维素酶对提取率的影响，确定复合酶法提取短梗五
加叶中金丝桃苷的最佳条件。结果 各因素主次依次为温度、α-淀粉酶、中性蛋白酶、纤维素酶。最佳条件为:纤维素酶
加酶量为 2%，中性蛋白酶加酶量为 0．5%，α-淀粉酶加酶量为 3%，温度 30 ℃，时间 10 min。短梗五加叶中金丝桃苷的提
取率为 0．52%。结论 经复合酶处理，金丝桃苷产率较传统工艺提高，为更好开发短梗五加提供参考。
关键词 短梗五加叶;金丝桃苷;复合酶;正交实验法
中图分类号 Ｒ284．2 文献标识码 B 文章编号 1004－0781(2016)06－0636－04
DOI 10．3870 / j．issn．1004－0781．2016．06．020
Study on Composite Enzyme Assisted Extraction of Hyperoside from Acanthopanax
sessiflorus
CAI Enbo，XU Jing，ZHENG Xiaoman，WANG Yanan，WANG Dalong，ZHENG Manling，LIU Xiangxiang，
ZHAO Yan(College of Chinese Medicinal Material，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China)
ABSTＲACT Objective To extract hyperoside from the leaves of Acanthopanax sessiliflorus by complex enzyme method，
and optimize the extraction process by orthogonal experiment． Methods Hyperoside was determined by HPLC． Effects of
temperature，α-amylase，neutral protease and cellulase on extraction rate were detected by the orthogonal tests，and the optimum
extraction condition of hyperoside from the leaves of Acanthopanax sessiliflorus was determined by complex enzyme method．
Ｒesults The main influence factor was temperature，follows by α-amylase，neutral protease and cellulase according to orthogonal
analysis．The best condition was as follows:dose of cellulase，neutral protease and α-amylase was 2%，0． 5% and 3%，
respectively，extract at temperature of 30 ℃ for 10 min．Under this condition，the extraction rate of hyperoside in the leaves of
Acanthopanax senticosus was 0．52%． Conclusion As compared with the traditional technics，compound enzyme increases the
productivity of hyperoside．
KEY WOＲDS Leaves of Acanthopanax sessiflorus;Hyperoside;Compound enzyme;Orthogonal test
短 梗 五 加［Acanthopanax sessiliflorus (Ｒupr． Et
Maxim．)］为五加科落叶灌木或小乔木［1-2］，也称无梗五
加，具有祛风除湿、活血通络等作用［3-4］。金丝桃苷属于
黄酮类化合物，具有抗氧化［5］、抗抑郁［6］等药理作用。
JUNG等［7］确定金丝桃苷为短梗五加中的活性成分，是
一种具有有前途的防癌活性替代物。陆珞等［8］采用星
·636· Herald of Medicine Vol. 35 No. 6 June 2016
点设计-效应面法优选短梗五加叶中金丝桃苷的提取工
艺，宋宏新等［9］采用超声波辅助乙醇提取金丝桃苷，但
金丝桃苷提取率均较低。酶是具有强大生物活性的催
化剂，酶法辅助提取植物中天然化合物是低能耗技
术［10］，具有操作简单，效率高和不污染环境，以及经济
价值高等特点，因此近年来被广泛的研究。笔者在本研
究以复合酶对短梗五加中金丝桃苷提取工艺进行优化。
报道如下。
1 材料与方法
1．1 仪器 高效奥泰 26-201 型液相色谱仪(美国奥
泰公司);AL-104 电子天平(梅特勒-托利多仪器有限
公司，感量:0．1 mg);鼓风干燥箱 DHG-9140A(上海阳
光实验有限公司);实验室常规仪器等。
1．2 药品与试剂 短梗五加叶采集于吉林省临江市
老岭基地，经吉林大学中药学院丛登立副教授鉴定为
五加科植物短梗五加 Acanthopanax sessiliflorus (Ｒupr．
Et Maxim．)Harms 的干燥叶。金丝桃苷对照品(中国
食品药品检定研究院，批号:111521-201004);甲醇(色
谱纯，Fisher公司);娃哈哈纯净水。
2 方法与结果
2．1 色谱条件 色谱柱:Agilent TC-C18(4． 6 mm ×
250 mm，5 μm);流动相:甲醇∶水(45∶55);柱温:室
温;检测波长:360 nm;流速:1 mL·min－1;灵敏度:
1 AUFS;按金丝桃苷峰计算，理论板数≥2 000。
2．2 溶液的制备
2．2．1 供试品溶液的制备 将短梗五加叶干燥并粉
碎，过筛孔内径为 0．250 mm(60 目)筛。恒重后，精确
称取粉末样品 0．500 0 g，置于 50 mL三角瓶中，精密加
入一定量的酶，加入纯化水 15 mL，称定质量，记录质
量，在 30 ℃恒温水浴锅中反应 10 min，补足质量，再加
入无水乙醇 15 mL，在超声波发生器中提取 30 min，静
置并冷却至室温，补足质量，然后滤过并取滤液备用。
2．2．2 传统方法制备金丝桃苷对照溶液 精密称取
短梗五加叶 0．500 0 g置于 50 mL三角瓶中，用移液器
精确吸取 50%乙醇 30 mL，浸泡 12 h，超声 30 min，作
收稿日期 2015－01－20 修回日期 2015－05－23
基金项目 * 国家级大学生创新创业训练计划项目
(201410193020)
作者简介 蔡恩博(1982－)，男，吉林长春人，讲师，在读博
士，主要从事天然产物化学成分研究。E-mail:caienbo8251@
163．com。
通信作者 赵岩(1979－)，男，吉林长春人，副教授，博士，
主要从事天然产物化学成分研究。E-mail:191234902@ qq．
com。
为金丝桃苷对照溶液［8］。
2．2．3 对照品溶液的制备 精密称取金丝桃苷对照
品 0．004 0 g，置于 10 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀，作为
金丝桃苷对照品溶液，其浓度为 0．4 mg·mL－1。
2．3 方法学验证
2．3．1 线性关系考察 吸取“2．2．3”项金丝桃苷对照
品溶液，分别进样 2，4，6，8，10，12 μL，按上述色谱条
件进行高效液相色谱(HPLC)分析，以峰面积(Y)和进
样量(X)进行线性回归，回归方程为:Y = 1 200 000X－
64 804，r = 0． 999 8。结果金丝桃苷进样量在 0． 8 ～
4．8 μg范围内线性关系良好，
2．3．2 稳定性实验 按“2．2．1”项方法制备供试品溶
液，在 0，1，2，3，4，5 h 进样进行测定，结果金丝桃苷峰
面积的 ＲSD为 1．3%(n= 6)。
2．3．3 精密度实验 按“2．2．1”项方法制备供试品溶
液，并连续进样 5 次，结果金丝桃苷峰面积 ＲSD 为
1．1%(n= 5)。
2．3．4 重复性实验 按“2．2．1”项方法平行制备供试
品溶液 6份，分别测定，ＲSD为 0．98%(n= 6)。
2．3．5 回收率实验 取短梗五加叶粉末 0．2 g，平行 6
份，加入“2．2．3”项金丝桃苷对照品溶液 2．5 mL，按“2．
2．1”项方法制备供试溶液测定，计算金丝桃苷平均回
收率 99．33%，ＲSD为 0．04%。见表 1。
表 1 金丝桃苷的加样回收率实验结果
Tab．1 Ｒesults of recovery test on hyperoside
取样量 /
g
原有量 加入量 测得量
mg
回收率 /
%
0．202 0 1．00 1．0 1．98 98．00
0．200 0 0．98 1．0 2．02 104．00
0．201 0 1．00 1．0 1．96 96．00
0．203 0 1．02 1．0 2．06 104．00
0．203 0 1．02 1．0 1．98 96．00
0．200 0 0．98 1．0 1．96 98．00
2．4 样品测定 精密吸取供试品溶液 10 μL，按“2．1”
项色谱条件进样测定，将其峰面积代入上述回归方程。
提取率(%)= 提取液中金丝桃苷质量 /药材质量 ×
100%。按照“2．2． 2”项中操作要求进行 3 次平行实
验，得到传统工艺提取金丝桃苷的平均提取率为
0．48%。
2．5 单因素实验 选取 β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、甘
露聚糖酶、中性蛋白酶、果胶酶、α-淀粉酶、木聚糖酶、
中温淀粉酶、木瓜蛋白酶、漆酶 10种酶，在各自酶适宜
的条件下对短梗五加叶进行提取，分别考虑各单酶的
·736·医药导报 2016年 6月第 35卷第 6期
最适提取条件。
2．5．1 不同加酶量的各种酶对短梗五加叶中金丝桃苷
的提取率的影响 各种酶在不同加酶量下，酶解时间均
为 10 min，温度分别为 30 ℃，在不同加酶量(质量分数:
0．5%～5．0%)的条件下金丝桃苷的提取结果，结果见表
2。根据表 2，与传统法提取率 0．48%比较，在误差允许
范围内，通过数据对比，选出提取率提高较大的酶，分别
是纤维素酶、中性蛋白酶和 α-淀粉酶。
表 2 各种酶在不同加酶量条件下的提取率
Tab．2 Extraction rate of various enzymes at different
dosages %
加酶量
纤维
素酶
中性
蛋白酶
果胶酶
木聚
糖酶
木瓜
蛋白酶
0．5 0．53 0．49 0．49 0．48 0．50
1．0 0．53 0．48 0．48 0．48 0．46
2．0 0．51 0．50 0．49 0．49 0．48
3．0 0．52 0．52 0．50 0．49 0．48
4．0 0．51 0．51 0．52 0．50 0．49
5．0 0．43 0．51 0．49 0．50 0．47
加酶量
甘露
聚糖酶
中温
淀粉酶
漆酶 α-淀粉酶
β-葡萄糖
苷酶
0．5 0．49 0．50 0．48 0．49 0．48
1．0 0．49 0．51 0．49 0．49 0．48
2．0 0．46 0．49 0．49 0．52 0．52
3．0 0．49 0．49 0．47 0．52 0．47
4．0 0．49 0．50 0．48 0．51 0．52
5．0 0．53 0．48 0．49 0．48 0．49
2．5．2 加酶量对短梗五加叶中金丝桃苷提取率的影
响 选取“2．5．1”项中的纤维素酶、中性蛋白酶和 α-淀
粉酶，再进行一次考察，酶解时间均为 10 min，温度均
为 30 ℃，在不同加酶量(质量分数)的条件下金丝桃
苷的提取结果，见图 1。
图 1 不同加酶量的短梗五加叶中金丝桃苷提取率
Fig．1 Extraction rate of hyperoside from the leaves of
Acanthopanax sessiliflorus by various enzymes at different
dosages
纤维素酶在加酶量为 0．5% ～ 2%时，金丝桃苷提
取率较高，随后较平稳，在 4%加酶量以后呈下降的趋
势。中性蛋白酶和 α-淀粉酶在加酶量为 2% ～ 4%时，
金丝桃苷提取率较高。
2．5．3 反应时间对短梗五加叶中金丝桃苷提取率的
影响 保持其他条件不变，分别考察纤维素酶、中性蛋
白酶和 α-淀粉酶在不同酶解时间下，加酶量为 1%时
金丝桃苷提取结果，见图 2。由图 2 可知，随着时间的
延长，金丝桃苷的提取率均呈下降的趋势，在酶解时间
为 10～20 min时，短梗五加中金丝桃苷的提取率在各
种酶的作用下相对达到最高。
图 2 不同酶解反应时间金丝桃苷的提取率
Fig． 2 Extraction rate of hyperoside with different
enzymatic time
2．5．4 反应温度对短梗五加叶中金丝桃苷提取率的
影响 纤维素酶、中性蛋白酶和 α-淀粉酶酶解时间均
为 10 min，其他条件不变，在不同酶解温度的作用下金
丝桃苷的提取结果，见图 3。
图 3 不同温度的金丝桃苷提取率
Fig． 3 Extraction rate of hyperoside with different
temperature
由图 3可知，随着温度的不同，纤维素酶对短梗五
加叶中金丝桃苷提取率的影响较大，金丝桃苷的提取
率在其他两种酶的作用下也有一定变化。在 30 ℃时
和 55 ℃时，3种酶对金丝桃苷的提取率影响较大。
2．6 金丝桃苷提取的正交实验 为了优化提取工艺，
选取纤维素酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶、温度 4 个因素
对金丝桃苷提取影响较大的因素，设计 L9(3
4)正交表
进行正交实验。正交实验因素表见表 3，复合酶法提
·836· Herald of Medicine Vol. 35 No. 6 June 2016
取短梗五加金丝桃苷正交实验设计及结果如表 4。
表 3 金丝桃苷提取工艺正交实验因素
Tab．3 Factors of orthogonal experiment on extraction
process of hyperin
水平
纤维素酶
(A)/%
中性蛋白酶
(B)/%
α-淀粉酶
(C)/%
温度
(D)/℃
1 0．5 3．0 2 30
2 1．0 4．0 3 40
3 2．0 0．5 4 55
表 4 复合酶法提取短梗五加金丝桃苷正交实验设计及结
果
Tab． 4 Orthogonal design and results of extraction
process of hyperin from Acanthopanax sessiflorus by complex
enzyme method
实验号 A B C D
金丝桃苷
得率 /%
1 1 1 1 1 0．525 1
2 1 2 2 2 0．519 6
3 1 3 3 3 0．449 2
4 2 1 2 3 0．522 7
5 2 2 3 1 0．529 7
6 2 3 1 2 0．509 8
7 3 1 3 2 0．491 9
8 3 2 1 3 0．453 3
9 3 3 2 1 0．527 4
K1 0．498 0．513 0．496 0．527
K2 0．521 0．501 0．523 0．507
K3 0．491 0．495 0．490 0．475
Ｒ 0．030 0．018 0．033 0．052
A．纤维素酶;B．中性蛋白酶;C．α-淀粉酶;D．温度
A．cellulase;B．neutral protease;C．α－amylase;D．temperature
由表 4经过简单的直观分析，可知各因素对实验
结果均有一定的影响，因素的主次为 D＞C＞A＞B，即影
响的大小顺序为温度、α-淀粉酶、纤维素酶、中性蛋白
酶;对各因素和水平进行直观分析，确定各因素的最优
水平，即酶对短梗五加叶前处理的最优工艺为纤维素
酶加酶量为 2%，中性蛋白酶的加酶量为 0．5%，α-淀粉
酶的加酶量为 3%，温度 30 ℃，时间 10 min。
2．7 验证实验 按照最优工艺:纤维素酶加酶量为
2%，中性蛋白酶的加酶量为 0．5%，α-淀粉酶的加酶量
为 3%，温度 30 ℃，时间 10 min，进行 3次实验，金丝桃
苷得率为 0．52%。
3 讨论
实验采用复合酶法辅助提取短梗五加叶中的金丝
桃苷，此方法具有缩短提取时间、提高提取效率的特
点。在此期间，除了考虑各因素之间的相互作用外，还
采用正交实验方法确保实验结果的科学性和准确性。
目前，国内有关短梗五加叶的提取工艺很少，此实
验采用新的提取工艺，并提高短梗五加金丝桃苷的提
取率，不仅丰富提取工艺，而且测出金丝桃苷的提取
率，为金丝桃苷作为短梗五加叶评价指标提供了重要
参考依据。
短梗五加药食两用，深受广大人民喜爱，并开发成
特色野蔬和茶的保健品。且金丝桃苷具有很好的药理
作用，而复合酶法辅助提取短梗五加叶中的金丝桃苷
有效的提高了其提取率，同时提取方法健康环保。为
短梗五加叶的食品药品以及金丝桃苷的进一步开发和
利用提供一定的参考。
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