全 文 ： 药理学化
收稿日期:2006-12-21;　修订日期:2007-05-16
作者简介:孙贺英(1966-),女(汉族),河北保定人 ,现任河北大学医学部
主管药师 ,学士学位 ,主要从事药剂工作.
反相高效液相色谱法测定
照山白中金丝桃苷的含量
孙贺英 1 , 付萍萍2 , 郝　娜 3
(1.河北大学医学部 ,河北 保定　071000;　2.河北省保定市药品检验所 ,河北 保定　071051;
3. 保定三九济世生物药业有限公司 ,河北 保定　072656)
摘要:目的 建立照山白中金丝桃苷的高效液相色谱法。方法 采用 D iam onsilTM C18(4. 6 mm ×250 mm, 5μm)色谱柱 , 以
甲醇 - 5%磷酸溶液 -三乙胺(44∶56∶0. 37)为流动相 ,检测波长为 360 nm , 流速为 1. 0 m l /m in。结果 金丝桃苷在 0. 05
～ 0. 28 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0. 999 8, n=6),平均回收率为 99. 83%(n =5), RSD为 0. 90%。结论
该方法快速 、简便 ,结果准确 , 可用于照山白中金丝桃苷的质量控制。
关键词:反相高效液相色谱;　金丝桃苷;　照山白
中图分类号:R284. 2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2007)10-2433-02
RP-HPLC Determ ination ofHyperin inManchur ian rhododendron Leaf
SUN H e-ying1 , FU P ing-p ing2 , HAO N a3
(1. School ofMed icine, HebeiUniversity , Baoding , Hebei 071000, China;2. B aod ing Institu te for Drug Con-
trol, Baoding ,Hebei 071051, China;3. B aod ing Sanjiu B iopharmaceutics Co. , Ltd. ,Baod ing 072656, Ch ina)
Abstract:Objective To estab lish an RP-HPLC m e thod fo r the determ ination of Hyperin inManchurian rhododendron Lea.f
M ethods The D iamonsilTM C18(4. 6 mm ×250 mm , 5 μm) was used. The mobile phase wasm ethanol - 5%pho spho ric - trie thy l-
am ine(44∶56∶0. 37). The flow ra te wa s 1. 0m l /m in, the de tective wave leng th a t360nm. 20μl samp le r and ex ternalm e thod w ere
used. Resu lts A sa tisfactory separation w as obta ined. The calibration curve was linea r ove r the range of 0. 05 ～ 0. 28μg fo r ribav i-
rin(r=0. 999 8, n =6). The ave rage recove ry o f ribav irin w as 99. 83%(n =5)w ith RSD of 0. 90%. C onclusion The me thod is
qu ick and sim ple w ith good rep roducib ility. It can be used fo r the qua lity control o fH ype rin inManchurian rhododendron Lea.f
Key words:RP-H PLC;　Content de te rm ina tion;　Hyperin;　 Manchurian rhododendron Leaf
　　照山白为双子叶植物药杜鹃花科植物小花杜鹃的枝叶或花 ,
具有祛痰止咳 、通络止痛等功效 , 可用于治疗急慢性气管炎 、哮
喘 、痛经 、产后周身疼痛等病症 ,其主要成分为各种黄酮类成分 ,
如金丝桃苷及多种皂苷及多糖类等 [ 1] 。 有报道应用高效液相色
谱法 , 以甲醇 - 3%醋酸溶液等为流动相 ,测定山楂等不同药材中
金丝桃苷的含量 [ 2 ～ 4] 。本实验采用 RP-HPLC法 , 以甲醇-5%磷
酸溶液-三乙胺为流动相 ,实现了对照山白中金丝桃苷的准确分
析。现报道如下。
1　仪器与试药
W aters高效液相色谱仪 , 515泵 , 2487紫外检测器 , plus717
自动进样器 , 浙江大学色谱工作站;Sa rto rius BP211D电子天平。
金丝桃苷对照品 (中国药品生物制品检定所提供 , 批号:
1521-200202);照山白(保定医药药材公司提供);甲醇为色谱纯 ,
其它试剂为分析纯。
2　方法与结果
2. 1　色谱条件 色谱柱为 D iam onsilTM C
18
色谱柱 (4. 6 mm ×250
mm , 5 μm);流动相为甲醇 - 5%磷酸 -三乙胺(44∶56∶0. 37);
检测波长为 360 nm;流速 1. 0 m l /m in;进样量 20 μl;室温进样。
在上述色谱条件下 , 金丝桃苷峰形良好 , 无杂质峰干扰 ,以金丝桃
苷计算的理论塔板数大于 5 000, 保留时间约为 15 m in,与相邻色
谱峰的分离度均大于 1. 5, 见 H PLC图。
2. 2　实验溶液的制备
2. 2. 1　对照品溶液的制备 精密称取金丝桃苷对照品 11. 60
m g,置 50 m l量瓶中 ,加流动相溶解并稀释至刻度 , 摇匀 , 制成浓
度为 0. 232 m g /m l的溶液;分别精密量取 0. 10, 0. 20, 0. 30, 0. 40,
0. 50, 0. 60 m l,置 10 m l量瓶中 ,加流动相稀释至刻度 , 摇匀 ,作为
对照品溶液。
2. 2. 2　供试品溶液的制备 取照山白药材适量 , 粉碎 , 过 20目
筛 , 取约 0. 2 g,置 50 m l圆底烧瓶中 , 精密加入 90%乙醇 20 m l,
称定总重量 ,加热回流 1 h。精密称定 , 加 90%乙醇补足损失量 ,
摇匀 , 滤过 ,弃去初滤液 ,精密量取续滤液 2 m l, 置 10 m l量瓶中 ,
加 90%乙醇稀释至刻度 ,摇匀 , 用 0. 45 μm微孔滤膜滤过 , 作为
供试品溶液。
2. 3　方法学考察
2. 3. 1　线性关系考察 精密量取对照品溶液各 20 μl, 注入液相
色谱仪 , 记录峰面积。以进样量(μg)为横坐标 ,相应峰面积为纵
坐标 , 进行线性回归。结果在 0. 05 ～ 0. 28 μg范围内 , 金丝桃苷
进样量与峰面积呈良好的线性关系 , 回归方程为 Y =8. 753 1X -
0. 015 2, r=0. 999 8。
2. 3. 2　精密度实验 取照山白药材适量 , 粉碎 , 过 20目筛 ,取约
0. 2 g,精密称定 , 按 2. 2. 2项下方法制备供试品溶液。精密量取
20 μl,注入液相色谱仪 , 重复进样 5次 , 所得峰面积的 RSD 为
0. 23%(n=5),表明本方法的精密度较好。
2. 3. 3　稳定性实验 取同一供试品溶液 ,分别于 0, 1, 2, 4, 8, 12
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LISH IZH EN MEDIC INE AND MATERIA MED ICA RESEARCH 2007 VOL. 18 NO. 10 时珍国医国药 2007年第 18卷第 10期
h,进样 20μl,记录峰面积 , 结果峰面积基本不变 , RSD 为 0. 39%
(n=6),表明供试液至少在 12 h内稳定。
a -金丝桃苷对照品　 b -样品　1.金丝桃苷
图 1　 HPLC图
2. 3. 4　重复性实验 精密称取同一批号的样品 5份 , 分别按样
品测定项下方法进行测定 , 取照山白药材细粉 , 精密称取 5份 ,每
份约 0. 2 g, 按 2. 2. 2项下方法制备供试品溶液 。精密量取 20
μl,注入液相色谱仪 , 按峰面积计算。求得平均含量为 0. 49%,
计算 RSD 为 1. 1%(n=5),说明本方法的重复性较好。
2. 3. 5　回收率实验 取已测定含量的照山白药材适量 ,粉碎 ,过
20目筛 , 取约 0. 1 g(5份), 分别精密量取金丝桃苷对照品溶液
(精密称取金丝桃苷对照品 3. 18 mg, 置 5 m l量瓶中 , 用 90%乙
醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀)0. 8 m l, 依次加入上述 5份药材中 ,
按 2. 2. 2项下方法制备供试品溶液。吸取上述供试品溶液各 20
μl,注入液相色谱仪 , 记录色谱图 ,按峰面积计算。结果见表 1。
2. 4　样品含量测定 取 3批照山白药材 , 粉碎 , 过 20目筛 , 取约
0. 2 g,精密称定 , 按 2. 2. 2项下方法 , 各平行制备 5份供试品溶
液。精密量取 20μl,注入液相色谱仪 , 记录色谱图 , 按外标法以
峰面积计算含量。结果见表 2。
3　讨论
3. 1 　流动相的选择 黄酮苷类成分在用 HPLC测定时易拖尾 ,
流动相中加入三乙胺可抑制其拖尾 [ 3] 。 曾使用了低浓度
(0. 05%, 0. 1%, 0. 5%)的醋酸溶液和 0. 05%磷酸溶液 , 峰形对
称性不好 ,后用甲醇 - 0. 5%磷酸溶液 (44∶ 56)得到较好的效
果。但实验中发现仍有轻微的拖尾现象 , 经反复实验发现在 1 L
上述流动相中加入 3. 7 m l三乙胺时分离效果最佳 , 系统具有良
好的重复性和稳定性。
表 1　回收率实验结果
编号 金丝桃苷含量 m /μg
加入量
m /μg
测得量
m /μg
回收率
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
1 492. 45 508. 80 1 000. 25 99. 80
2 492. 94 508. 80 1 002. 36 100. 10
3 496. 37 508. 80 1 003. 90 99. 74 99. 83 0. 90
4 494. 41 508. 80 995. 81 98. 50
5 498. 82 508. 80 1 012. 50 101. 00
　　n =5
表 2　样品测定结果 %
样品编号 样品中金丝桃苷的平均含量 RSD
1 0. 51 1. 5
2 0. 49 1. 2
3 0. 48 0. 9
　　n=3
3. 2　检测波长的确定 据报道 , 金丝桃苷分别在 256 nm 和 360
nm波长处有最大吸收 [ 4] 。 经紫外扫描和液相色谱测定表明 , 在
360 nm波长处测定干扰较少 , 且分离效果良好 , 故选用 360 nm
作为检测波长。
3. 3　提取方法 、提取时间及溶剂的选择 本实验曾分别使用超
声振荡提取和热乙醇回流提取法 ,结果证明热乙醇回流法提取效
率高;亦就不同提取时间 (1, 2, 3, 4 h)和不同乙醇浓度 (50%,
60%, 70%, 80%, 90%)进行了比较实验 , 最后确定了提取效率高
的 90%乙醇回流 1h作为供试品溶液的制备方法。
本法简便快速 ,准确可靠 , 灵敏度高 ,可作为照山白中金丝桃
苷的含量测定方法 , 为照山白药材的质量控制提供有效的分析
手段。
参考文献:
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