全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 November 2009, 28(6): 797-801

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2009 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






基金项目：国家科技支撑计划课题（No. 2007BAD89B13）
*Corresponding author. E-mail: mushroom@public.fz.fj.cn
收稿日期: 2008-10-10, 接受日期: 2009-01-21

双孢蘑菇耐热相关基因的表达载体构建及转化研究
陈美元 廖剑华 郭仲杰 李洪荣 卢政辉 蔡丹凤 王泽生*
福建省农科院食用菌研究所 福建省蘑菇菌种研究推广站 福州 350014



摘 要：构建了双孢蘑菇 Agaricus bisporus 耐热相关基因 028-1 全长 cDNA 序列的双元表达载体，通过农杆菌介导转化双孢
蘑菇非耐热菌株 8213，经潮霉素抗性筛选和 PCR 鉴定，获得了一批双孢蘑菇转基因菌株。对 10 株转基因菌株进行了不同
温度下的草管走菌试验，结果显示大部分转基因菌株的耐热性能有较为明显的提高。
关键词：食用菌，耐热性状，转基因，潮霉素抗性，农杆菌

The expression vector construction and transformation
of thermotolerance-related gene of Agaricus bisporus
CHEN Mei-Yuan LIAO Jian-Hua GUO Zhong-Jie LI Hong-Rong LU Zheng-Hui CAI Dan-Feng
WANG Ze-Sheng*
Edible Fungi Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fujian Mushroom Research and Development Station, Fuzhou 350014, China
Abstract: A binary expression vector of thermotolerance-related gene 028-1 of Agaricus bisporus was constructed and transferred
into non-thermotolerance strain 8213 of A. bisporus by Agrobacterium-mediated transformation. After hygromycin resistance
selection and PCR identification, dozens of transgenic strains of A. bisporus were obtained. 10 of them were put into compost
running test under different temperatures, and the results showed that the thermotolerance of most of the transgenic strains increase
obviously.
Key words: edible fungi, thermotolerance, transgene, hygromycin resistance, Agrobacterium


双孢蘑菇 Agaricus bisporus (Lange) Singer 由
于没有严格意义上的质粒，所以在外源基因转化中
难以得到合适的载体。在应用农杆菌 Agrobacterium
tumefaciens 介导转化之前，一般只能用基因枪法或
原生质体电击法等转化外源基因，转化效率低，工
作量大。农杆菌介导转化外源基因方法已在植物特
别是一些经济作物的转基因研究中得到广泛的应
用，但是将该方法应用于食用菌的转基因研究却是
DOI:10.13346/j.mycosystema.2009.06.003
798 Mycosystema
近年新发展起来的技术。近来有人建立了一套高效
农杆菌介导转化双孢蘑菇子实体的方法（Chen et al.
2000），使得双孢蘑菇外源基因转化效率大幅度提
高，甚至高达 100%。美国 Sylvan 公司已将多个功
能基因分别转入双孢蘑菇并得到成功表达（私人通
讯）。可以预见该技术将极大推进双孢蘑菇乃至整
个食用菌领域的基因工程研究。
在选育耐高温的双孢蘑菇转基因菌株的前期
研究中，我们通过mRNA差异显示技术从双孢蘑菇
耐热菌株02中获得三个耐热相关基因片段（王泽生
等 2003；Wang et al. 2004），继而获得了其中一个
片段所在基因的全长cDNA序列028-1（Chen et al.
2005）。在本研究中我们试验并改进了这套包括外
源基因表达质粒构建和农杆菌介导转化双孢蘑菇
的基因转化系统，将该基因转入双孢蘑菇非耐热菌
株，获得一批双孢蘑菇转基因菌株，并对其菌丝体
的耐热性能进行测定，以期研究该基因与双孢蘑菇
耐热的相关性，探讨通过转基因手段提高双孢蘑菇
耐热能力的可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株：双孢蘑菇非耐热菌株 8213 由福建省蘑
菇菌种研究推广站提供；农杆菌菌株 AGL-1 由美国
Sylvan 公司赠送；大肠杆菌 Escherichia coli DH5α
购自 Promega 公司。
1.1.2 载体：pGEM-T Easy 克隆载体购自上海
Promega 公司；含蘑菇启动子 gpd 的克隆载体
pGEM-gpd（图 1）为本实验室自行构建；二元载体
pBHg（图 2）由美国宾州大学构建（Chen et al.
2000），由美国 Sylvan 公司 M.P. Wach 博士赠送，
它具有卡那霉素（Kanamycin）抗性基因 Kan(R)和
潮霉素（Hygromycin）抗性基因 hph（Hygromycin B
phosphotransferase），可分别在细菌和真菌中表达。
1.1.3 试剂：内切酶、T4 连接酶、CIAP、Klenow
为 NEB 产品；PCR 试剂盒、培养基、抗生素及其
他试剂均购自上海生工公司。
1.1.4 基因及引物：1369bp 的 DNA 片段 028-1 是双
孢蘑菇耐热相关全长 cDNA 序列（Chen et al.
2005），为本实验室克隆保存，其鉴定用 PCR 引物
分别为 028-1F 和 028-1RK，可特异扩增其 900bp
部分片段。转基因蘑菇菌株的 PCR 鉴定使用引物
gpd-FH 和 hph-R（Chen et al. 2000），它们可扩增
出一段包含 gpd 启动子和 hph 基因的全长 970bp 序
列。以上引物均由华大基因上海鼎安生物科技有限
公司合成，序列见表 1。

图 1 克隆载体 pGEM-gpd 物理图谱
Fig. 1 Physical map of cloning vector pGEM-gpd.

图 2 双元载体 pBHg 物理图谱
Fig. 2 Physical map of binary plasmid vector pBHg.
表 1 本研究所用的 PCR 引物及其序列
Table 1 PCR primers used in this study and their sequences
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
028-1F
028-1RK
gpd-FH
hph-R
5′-TCTTCACGTGCTGCCACCAA-3′
5′-ATCGCACTTGGCTTTGTCAG-3′
5′-GAAGAAGCTTTAAGAGGTCCGC-3′
5′-GGCGACCTCGTATTGGGAATC-3′

Vol.28 No.6 799
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1.2 方法
1.2.1 质粒的构建：酶切、去磷酸化、末端补平、
纯化、连接、转化、筛选等常规操作按《分子克隆
实验指南》（萨姆布鲁克等 1995）。
1.2.2 双孢蘑菇的农杆菌介导转化：基本按照 Chen
et al.（2000）和 Romaine et al.（2004，2005）的方
法并作些改进。包括以下步骤（均需无菌操作）：（1）
构建好的表达质粒转入农杆菌并进行诱导培养；
（2）采摘菌膜未破的蘑菇子实体，清洁表面后收
集幼嫩菌褶组织并切成细块；（3）把组织块加入经
诱导的农杆菌悬浮液中，抽真空至大部分组织块沉
到瓶底；（4）将组织块转移到共培养平板上，21℃
培养 4d；（5）将组织块转移到初筛培养基（含
30µg/mL 潮霉素）平板上，24℃培养 2 周；（6）切
下新生长的菌丝块移植到复筛培养基（含 50µg/mL
潮霉素）平板上，24℃培养 2 周；（7）能够正常生
长的即为转化子，接种到常规 PDA 斜面进行培养
和保存。
1.2.3 转化子的 PCR 鉴定：质粒 DNA 提取按《分
子克隆实验指南》（萨姆布鲁克等 1995）；基因组
DNA 提取、PCR 分析基本按以前的方法（陈美元
等 1998），只把 PCR 的退火温度提高到 58－60℃。
1.2.4 转基因菌株草管走菌试验：将各菌株接种于
发酵棉籽壳试管，先 24℃培养 2 周，用记号笔划出
菌落边缘位置，分别置 24℃、28℃、32℃、34℃培
养 3 周，在每种温度下对每个菌株设置 3 个重复，
测量各菌株平均走菌距离。
2 结果与分析
2.1 双孢蘑菇耐热相关基因 028-1 表达载体的构建
已克隆入 pGEM-T Easy 载体的 1369bp 双孢蘑
菇耐热相关基因 028-1 全长 cDNA 序列用内切酶
NotI 切出，与用 KpnI 消化的 pGEM-gpd 载体进行
平末端连接后转化大肠杆菌 DH5α，可疑克隆子质
粒经 PCR 鉴定及酶切确定基因插入方向后，获得目
标克隆子 pGEM-gpd/028-1。用 NotI 切下带有蘑菇
gpd 启动子和 CAMV 35S 终止子的目的基因片段，
补平末端后与用 SmaI 酶切并去磷酸化的双元载体
pBHg 连接转化 DH5α。用 PstI 和 SacI 双酶切 4 个
可疑阳性克隆子质粒 DNA，结果均切出约 1.95kb
目标片段。用片段 028-1900 的两端特异引物 028-1F
和 028-1RK 对克隆子进行 PCR 鉴定，均扩出了
900bp 目标条带，而空白质粒 pBHg 无条带扩出。
以上结果表明我们已获得目标克隆子 pBHg/028-1，
是 028-1 基因的双元表达载体。
2.2 双孢蘑菇的农杆菌介导转化
提取克隆子 pBHg/028-1 的质粒 DNA，转入农
杆菌 AGL-1，挑取单克隆菌落扩大培养。阴性对照
采用无质粒的空白农杆菌进行转化。将上述空白及
带有二元表达质粒的农杆菌分别转化双孢蘑菇非
耐热菌株 8213 的新鲜菌褶组织块，经潮霉素平板
初筛和复筛（图 3），结果阴性对照无转化子，
8213/028-1 获得 17 个转化子。

图 3 双孢蘑菇潮霉素抗性转化子的平板筛选
Fig. 3 Selection of hygromycin-resistant transformants of Agaricus
bisporus.

2.3 双孢蘑菇转化子的 PCR 鉴定
随机挑取 10 株上述 8213/028-1 转化子菌株转
入常规 PDA 斜面培养，转管 2 代后，提取其基因
组 DNA，用引物 gpd-FH 和 hph-R 进行 PCR 鉴定。
结果显示 10株 8213/028-1转化子均扩增出了 970bp
的目标条带（图 4），未转化的对照亲本菌株 8213
无目标条带扩出。该结果表明我们已获得一批具有
潮霉素抗性的转基因双孢蘑菇菌株。根据农杆菌介
导转化的原理，与潮霉素抗性基因相邻的外源
DNA，即带有蘑菇 gpd 启动子和 CAMV 35S 终止
子的基因片段 028-1 也已转入这些转化子中。
2.4 双孢蘑菇转基因菌株草管走菌试验
表 2 显示了亲本菌株和转基因菌株在不同温度
下的走菌速度。从表中可以看出，各菌株在草管中
的生长情况有所差异。有的菌株在 24℃生长速度比
800 Mycosystema
28℃快得多，有的菌株则较为接近或在 28℃更快
些，前者最终的耐热性表现一般较差，如转化子
8213/028-1(8)、8213/028-1(10)及亲本 8213 等，而
后者一般耐热性较好，如转化子 8213/028-1(2)、
8213/028-1(5)及耐热菌株 02 等。在 32℃下所有菌
株均有不同程度生长，而在 34℃下，非耐热亲本菌
株 8213 无生长，但其 10 个耐热相关基因的转化菌
株有 8 个均有明显生长，生长幅度接近耐热相关基
因 028-1 的来源菌株 02，表现出耐热性能明显提高。

图 4 双孢蘑菇 8213 转化子的 PCR 鉴定
M：Lambda DNA/EcoRI + HindIII 分子量标记；1：pBHg 质粒；2：
8213 菌株；3-12：8213/028-1 转化子.
Fig. 4 PCR identification of the transformants of Agaricus bisporus
8213. M: Lambda DNA/EcoRI + HindIII markers; 1: Plasmid pBHg; 2:
Strain 8213; 3-12: 8213/028-1 transformants.
3 讨论
在转化试验中，我们发现有的批次转化率较
低，究其原因是不少组织块感染了酵母菌，这是在
清洁子实体表面时，有的菌膜较薄或有破损，污水
渗入菌褶且未发觉所致。因此应尽量选用菌盖直径
2－3cm，菌膜厚实无破损，菇体较结实的未成熟蘑
菇子实体进行菌褶组织的收集工作。
质粒 pBHg 的潮霉素抗性基因用的是蘑菇启动
子 gpd，而本研究获得了大量潮霉素抗性转化子，
因此也验证了该启动子在双孢蘑菇基因表达中的
有效性。只要保证外源基因的完整性，就很有希望
通过本套转化系统在双孢蘑菇中得到表达。
本研究结果显示，从双孢蘑菇耐热菌株 02 中
获得的耐热相关基因 028-1 转入非耐热菌株 8213
中，获得的大部分转基因菌株的耐热性能比亲本菌
株有了明显的提高。虽然目前还没有直接确定转入
的耐热相关基因是否得以正确表达并起作用，但至
少表明在基因转化的整个过程中，某种因子（也包
括转化的基因及其表达产物）诱导、刺激或直接作
用于转化菌株的耐热机制，使得其耐热性能提高。
在下一步的工作中，我们拟在精确控温的试验
菇房内对这批转基因菌株进行栽培试验，以评价其
表 2 双孢蘑菇转基因菌株在不同温度下的草管走菌试验
Table 2 Mycelial growth of Agaricus bisporus transgenic strains under different temperatures
不同温度下 22d 草管菌丝延伸距离（cm）
The mycelial growth length (cm) of Agaricus bisporus transgenic strains under different temperatures for 22 days
菌株
Strains
24±0.5℃ 28±0.5℃ 32±0.5℃ 34±0.5℃
02
8213
8213/028-1 (1)
8213/028-1 (2)
8213/028-1 (3)
8213/028-1 (4)
8213/028-1 (5)
8213/028-1 (6)
8213/028-1 (7)
8213/028-1 (8)
8213/028-1 (9)
8213/028-1 (10)
3.4
4.2
4.0
3.0
4.0
3.3
3.9
4.0
3.8
4.3
4.1
5.0
3.8
3.1
4.0
3.5
3.5
3.3
4.0
3.9
3.9
3.2
4.2
3.8
1.8
1.9
1.8
1.8
1.6
1.8
1.7
1.8
1.5
2.1
1.4
1.0
0.9
0
1.0
0.7
0.8
0.8
0.7
0.9
0.8
0
0.7
0

Vol.28 No.6 801
http://journals.im.ac.cn/jwxtcn
产量、质量和耐热性能，并应用分子生物学技术对
该耐热相关基因的功能进行研究，对其在转基因菌
株中的表达情况及作用机制进行跟踪分析。

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王泽生，陈兰芬，陈美元，廖剑华，董进法，宋思扬，2003. 双孢蘑菇
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