全 文 ：Western Journal of Traditional Chinese Medicine,2013 Vol.26 No.12
中国科技 核心期刊
方 药·质量分析
植物内生菌(endophytic fungus)与宿主植物
在其演化过程中发生基因重组，能产生与宿主
相同或相似的生理活性。本实验选用甘肃乌拉尔
甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.，通过对野生与
栽培品甘草内生菌的分离、培养及其有效抑菌菌
株活性物质的考察，为研究甘草有效菌株与宿主
间活性物质的关系提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 供试品野生及栽培品甘草有效菌株
JTYB-001、JTYB-053、JTZB-001 分别低温保存于
NA试管斜面培养基中待用(甘草于2011年5月
采自甘肃省酒泉市金塔县，由甘肃中医学院中药
鉴定教研室李成义教授鉴定为正品)。
1.2 培养基PDA固体培养基(马铃薯200g、葡
萄糖20g、琼脂粉20g)、PDA液体培养基(马铃薯
200g、葡萄糖20g)、NA固体培养基(牛肉浸膏3g、蛋
白胨8g、琼脂粉20g)、NA液体培养基(牛肉浸膏
3g、蛋白胨8g)，水1000mL，pH自然，121℃灭菌
30分钟。
1.3 主要试剂与仪器3% Nacl(天津市净化材
料精细化工厂，批号：20100109)，牛肉浸膏(北京
奥博星生物技术有限责任公司，批号：090504)，青
霉素(宜昌人福药业有限责任公司，批号：110212)，
新生小牛血清(三利生物制品厂，批号：90436528)，
甘草苷标准品(批号：110820)、甘草酸单铵盐标准
品(批号：110301)购自中国药品生物制品检定所，
甘肃乌拉尔甘草
有效菌株内生细菌活性物质初步研究 *
邓 毅 1，2，丁仁伟 1，任鹏飞 1
1 甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000；2 甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室
［摘 要］目的：考察甘肃乌拉尔甘草具有抑菌作用的内生细菌的活性物质。方法：利用HPLC检测，以甘
草苷、甘草酸单铵盐标准品为参照，对甘草有效菌株内生细菌JTYB-001、JTYB-053、JTZB-001发酵液抑菌活性
成分进行分析。结果：三菌株代谢产物出峰时间分别为(RT=21.071分钟)、(RT=21.041)、(RT=21.067)，与甘草
酸单铵盐标准品的出峰时间(RT=21.031分钟)相近，采用面积法对其定量，产量分别约为0.033、0.005，0.013
mg/mL。结论：甘肃乌拉尔甘草野生与栽培品有效菌株内生细菌JTYB-001、JTYB-053、JTZB-001三菌株分别含
有与宿主相同药理活性的甘草酸类物质。
［关键词］甘肃乌拉尔甘草；内生菌；甘草酸；抑菌；活性物质
［中图分类号］R285.5［文献标识码］A ［文章编号］1004-6852(2013)12-0020-03
Preliminary Study on Active Substances of Endophytic Fungus
in Effective Strain of Gansu Ural Licorice
DENG Yi1, 2, DING Renwei1, REN Pengfei1
1 Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China;
2 Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province
Abstract Objective: To investigate active substance of endophytic fungus in Gansu ural licorice. Method:
Bacteriostatic active substance of endophytic fungus JTYB-001, JTYB-053 and JTZB-001 fermentation broth in ef-
fective strains of licorice were detected by HPLC and analyzed by taking glycyrrhizin and glycyrrhizic acid as the in-
dexes. Result: The peak times of three strains metabolite were respectively (RT=21.071min), (RT=21.041) and
(RT=21.067), they were closed to the peak time of mono-ammonium glycyrrhizinate standard substance (RT=21.031
minutes), their quantification and yields were respectively 0.033, 0.005 and 0.013mg/mL by area method. Conclu-
sion: Endophytic fungus JTYB-001, JTYB-053 and JTZB-001 of effective strain in wild and cultivated Gansu ural
licorice are found to contain glycyrrhizic acid identical with the host which owns pharmacological activity.
Keywords Gansu Ural Licorice; endophytic fungus; glycyrrhizic acid; bacteriostasis; active substance
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2013年第 26卷第 12期
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表2 供试品测定结果
菌株编号
甘草酸(GA)
进样量/μL 出峰时间/min 峰面积 含量/(mg·mL-1)
JTYB-001 10 21.071 2775861 0.033
JTYB-053 10 21.041 988335 0.005
JTZB-001 10 21.067 6611509 0.013
色谱纯乙腈(批号：80000618)、色谱纯甲醇(批号：
10014118)、色谱纯磷酸(批号：10015418)、色谱纯
冰醋酸(批号：10000218)、琼脂粉(批号：101103)、
营养琼脂(批号：20111012)购自国药集团化学试
剂有限公司，蛋白胨(天津市福辰化学试剂厂，批
号：20100911)。SW-1F-CJ无菌操作台、SPX-250-GB
光照培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)，
XS-213A显微镜(南京江南光电股份有限公司)，
Agilent1100 型高效液相色谱仪(江苏汉邦科技
有限公司)，KQ-500DE型数控超声清洗器(昆山市
超声仪器有限公司)，BS224S 电子分析天平、
PB-20标准型pH计(北京赛多利斯仪器系统有限
公司)。
1.4 方法
1.4.1 内生细菌分离［1-3］参照刘霞、宋素琴、
魏景超等方法，采用菌液涂抹分离法分离、纯化、
培养。野生与栽培甘草内生细菌编号(JTYB金塔
野生细菌、JTZB金塔栽培细菌)分别为JTYB-001、
JTYB-002、JTYB-003……和 JTZB-001、JTZB-002、
JTZB-003……将分离的内生细菌经体内外抑菌试
验筛选有效菌株，对具有抑金黄色葡萄球菌的有
效菌株进行成分分析。
1.4.2 样品处理标准品溶液制备：取甘草苷标
准品、甘草酸单铵盐标准品适量，精密称定，加70%
乙醇制成每1mL各含0.02、0. mg的溶液，即得。
各菌株发酵液制备：在无菌操作台上，将已纯化的
斜面培养基中的细菌菌株划线接入NA固体培养
基，28℃暗箱培养24小时活化，再将NA液体培养
基按每瓶100mL分装于250mL三角瓶中，121℃
灭菌30分钟。然后将活化的菌株用接种环各挑去
3 环菌种接种于以上 NA 液体培养基中，28℃，
200 r/min，摇床培养 4 天，发酵完成后，于 4℃、
3000r/min离心15分钟，取上清液烘干，根据需
要用无菌水稀释为相应浓度即为供试溶液。
1.4.3 紫外检测波长的选择精密称取标准品
溶液0.6mL于10mL量瓶中，用流动相定容。以流
动相为参比溶液，在200～400nm波长范围内进行
扫描测定，结果表明甘草酸单铵盐在254nm处出
现最大吸收峰，故检测波长为 250nm。甘草苷在
276 nm处出现最大吸收峰，故其检测波长为276nm。
1.4.4 HPLC 检测色谱条件：色谱柱-Hedera-
ODS-2-C18分析柱(4.5×200mm，5μ )，柱温：35℃，
流动相A为色谱纯乙腈，流动相B为0.05%磷酸
溶液，流动相浓度梯度变化(见表1)，进样10μL，
其中甘草苷检测波长为276nm，甘草酸单铵盐检
测波长为250nm，甘草苷0～10分钟出峰，甘草酸
10分钟以后出峰。
表1 流动相浓度梯度变化时间
时间/min 流动相A/% 流动相B/%
0～10 21 79
10～20 21～80 79～20
20～20.01 80～90 20～10
20.01～25 90～21 10～79
25～35 21 79
1.4.5 甘草苷的测定方法分别精密吸取各菌
株发酵液与甘草苷标准品溶液各10μL，注入液
相色谱仪，上述色谱条件下测定，采用面积法计算
发酵液中甘草苷的含量。
1.4.6 甘草酸的测定方法分别精密吸取各菌
株发酵液与甘草酸单铵盐标准品溶液各10μL，
注入液相色谱仪，上述色谱条件下测定，采用面积
法计算发酵液中甘草酸的含量(以甘草酸单铵盐
对照品0.2mg 折合甘草酸 0.195 9 mg 计算甘草
酸含量)。
2 结果
2.1 内生细菌分离及有效菌株筛选野生甘草
分离出65株内生细菌，栽培甘草分离出54株内
生细菌［4］。经体内外抑菌实验表明，JTYB-001、
JTYB-053、JTZB-001对金黄色葡萄球菌有抑制作
用，JTYB-001、JTZB-001 对肺炎链球菌有抑制作
用［5］。
2.2 各菌株发酵液测定结果甘草苷标准品的
RT 值为 8.394，JTYB-001、JTYB- 53、JTZB-001 的
出峰时间未接近8.394，因此可认定三种菌株发
酵液中不含甘草苷。甘草酸标准品的 RT 值为
21.031，JTYB-001、JTYB-053、JTZB-001 的出峰时
间分别为21.071、21.041、21.067，可以确定三种
菌株发酵液中可能含有甘草酸。见表2。
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3 讨论
诸多研究表明植物内生菌可产生与宿主相同
或相似的药用活性成分，并具有多种生理活性。如
Strobel GA［6］从锡兰肉桂(Cinnamomum zeylan－
icum B1.)的内生真菌(Muscodor albus)中得到 5
种挥发性化合物，对细菌和真菌具有不同程度的抑制
作用。饶小莉［7］从乌拉尔甘草的根茎叶中分离到
98株内生细菌，采用平板对峙法筛选的6株菌株
对植物病原菌有明显体外拮抗活性。李文军［8］从
甘草植株中分离到237株甘草内生菌，从中筛选出
1株可产甘草酸的菌株，产量为0.00022mg/mL。宋
素琴［9］从健康的胀果甘草中分离到的内生菌中
筛选到一株可能产甘草酸类似物的内生枯草芽胞
杆菌(Bacillussubtilis)。甘草酸为甘草抑菌抗炎主
要药效物质之一，甘草酸、甘草次酸及甘草黄酮类
化合物具有镇咳、祛痰、平喘等作用，甘草醇提取
物及甘草次酸钠在体外对金黄色葡萄球菌、结核
杆菌、大肠杆菌、阿米巴原虫及滴虫均有抑制作
用；有抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏、缓解胃肠平滑
肌痉挛等作用［10-11］。本实验结果表明甘肃乌拉尔
甘草野生与栽培品有效菌株内生细菌JTYB-001、
JTYB-053、JTZB-001三菌株分别含有与宿主相同
药理活性的甘草酸类物质，其含量分别为0.033，
0.005，0.013mg/mL。
参考文献
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432-433.
收稿日期：2013-06-26
*基金项目：甘肃省中医药科研项目(编号GZK-2010-9)
作者简介：邓毅(1964—)，男，博士研究生导师，教授，中药学
学科学术带头人。研究方向：中药及复方的应用研究。
方 药·质量分析
2.3 色谱图及出峰时间对菌株 JTYB-001、
JTYB-053、JTZB-001的发酵液进行HPLC分析，发
现三菌株代谢产物出峰时间为(RT=21.071)、
(RT=21.041)、(RT=21.067)，与甘草酸单铵盐标准
品的出峰时间(RT=21.031分钟)接近(见图1)，因
此可判断三菌株均可能含有甘草酸(GA)，采用面
积法对其定量，产量分别约为 0.033、0.005、
0.013mg/mL(图2—4)。
图1 甘草酸单铵盐标准品的色谱图(RT=21.031分钟) 图2 JTYB-001的色谱图(RT=21.071分钟)
图3 JTYB-053的色谱图(RT=21.041分钟) 图4 JTZB-001的色谱图(RT=21.067分钟)
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