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不同地区醉马草对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响



全 文 :西北农业学报 2014,23(12):33-37
Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica  doi:10.7606/j.issn.1004-1389.2014.12.006
网络出版日期:2014-12-31
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20141231.1039.014.html
不同地区醉马草对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响
收稿日期:2014-06-04  修回日期:2014-08-20
基金项目:教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-11-1071);国家自然科学基金(31260026);新疆生产建设兵团博士资金
(2009JC07)。
第一作者:任晓镤,男,讲师,硕士,研究方向为微生物学。E-mail:rxp_love@126.com
通信作者:陈 伟,教授,主要研究方向为病原微生物。E-mail:chenweialar@sina.com
任晓镤1,陈 伟1,2
(1.新疆兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室/塔里木大学 生命科学学院,
新疆阿拉尔 843300;2.新疆兵团塔里木畜牧科技重点实验室,新疆阿拉尔 843300)
摘 要 为了探索不同地区醉马草中活性物质的差异及对奶牛乳房炎性表皮葡萄球菌生物膜形成的影响,
通过微量板半定量法对1号采集点和2号采集点的醉马草所制备的水煎液及提取的总生物碱进行生物膜形
成影响的检测。结果显示,1号采集点的醉马草水煎液及提取的总生物碱在不影响表皮葡萄球菌生长的情况
下对生物膜形成有显著抑制作用(P<0.05),而相同处理的2号采集点样品对表皮葡萄球菌的生长及生物膜
形成均无明显影响(P>0.05)。该结果表明不同地区来源的醉马草中总生物碱的成分受地理环境因素影响
较大,与地域性密切相关。
关键词 生物膜;醉马草;生物碱;表皮葡萄球菌
中图分类号 S852.61   文献标志码 A     文章编号 1004-1389(2014)12-0033-05
Effects of Glabrous Crazyweed Herb from Different Regions
on Biofilm Formation of Staphylococcus epidermidis
REN Xiaopu1 and CHEN Wei 1,2
(1.Key Laboratory of Protection & Utilization of Biological Resources in Tarim Basin,Xinjiang Production &Construction
Group/Colege of Life Sciences,Tarim University,Alar Xinjiang 843300,China;2.Key Laboratory of Tarim Husbandry
Science and Technology,Xinjiang Production &Construction Group,Alar Xinjiang 843300,China)
Abstract To explore the differences of the active substances in glabrous crazyweed herb(GCH)of
different regions and the effects on biofilm formation by clinical Staphylococcus epidermidis isolated
from dairy cow mastitis cases,the semi-quantitative assay was used to examine the effect on biofilm
formation of the decoction of GCH and extraction of alkaloids from colection site 1and 2.The results
showed that the decoction and alkaloids from the site 1had significant inhibition on biofilm formation
(P<0.05)without affecting the bacterial growth.However,the samples from the colection site 2
had no effect(P>0.05)both on the biofilm formation and growth.It suggested that the alkaloids in
GCH from different regions were largely affected by geographical environment factors and had a close
relation with the growth region.
Key words Biofilm;Glabrous crazyweed herb;Alkaloid;Staphylococcus epidermidis
  奶牛乳房炎是奶牛的常发病之一,是严重影
响奶牛养殖业的三大疾病之一,又是最常见、最多
发及经济损失最大的疾病之一。致病的病原微生
物种类繁多,其中有学者指出葡萄球菌(Staphy-
lococcus)、链 球 菌 (Streptococci)及 大 肠 杆 菌
(Escherichia coli)所引起的奶牛乳房炎约占该病
发病总数的90%~95%,而葡萄球菌占50%以
上[1]。最常见的葡萄球菌有3种,金黄色葡萄球
菌 (Staphylococcus aureus)、表 皮 葡 萄 球 菌
(Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌
(Staphylococcus saparophytics);腐生葡萄球菌
几乎没有致病性,表皮葡萄球菌是条件致病菌,有
学者[2]认为表皮葡萄球菌是金黄色葡萄球菌耐药
基因的贮藏所,可将耐药基因同源传递给金黄色
葡萄球菌,导致金黄色葡萄球菌耐药。因此,由表
皮葡萄球菌引起的奶牛乳房炎逐渐受到人们的关
注。生物膜是表皮葡萄球菌重要的致病因素之
一,也是导致奶牛乳房炎反复发作难以治愈的根
本原因[3]。生物膜(Biofilm,BF)是指黏附于有生
命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的细
菌群体[4]。细菌生物膜的形成能够对细菌起到一
定的保护作用,使细菌能够在一些恶劣的环境存
活。微生物生物膜的形成受到多种因素的影响,
不同因素对不同微生物生物膜形成的影响也不相
同[5-6]。有文献[7]表明,生物膜的形成能够使膜内
细菌对抗生素的耐受性比浮游细菌增加10~
1 000倍。这给抗生素治疗奶牛乳房炎带来极大
困难。在人们逐渐追求“无抗奶”“绿色奶”“健康
奶”的今天,用中草药治疗奶牛乳房炎很快凸显出
优势。采用中草药治疗奶牛乳房炎,资源丰富、成
本低、治愈率高、不易产生耐药性、毒副作用小
等[8]。开展中草药防制奶牛乳房炎不但可以满足
可持续畜牧业发展的要求,还可以满足人们对提
高生活质量和绿色食品消费的要求。因此,中草
药在乳业发展中的应用具有极为广阔的前景。但
是不同的气候及地理条件等外界环境对中草药的
药用价值有很大影响。白雪媛等[9]对长白山区
15个不同产地人参中水溶性蛋白成分的质量浓
度进行比较研究,发现其在不同产地间存在差异,
与地域性密切相关;刘毅等[10]测定不同产地枸杞
中9种重金属及微量元素的质量分数,指出不同
产区的枸杞在某些元素的质量分数和元素质量分
数的比值上存在一定的特征,可能与环境因素(土
壤、大气、水源)和植物的固有生物学特性有关。
这些研究结果显示出外界环境条件对中草药某些
微量成分质量分数影响的重要性。
在前期研究中,任晓镤等[11]从发病奶样中分
离并获得生物膜阳性的表皮葡萄球菌,挑选生物
膜形成能力较强的2株表皮葡萄球菌应用于本试
验。醉马草作为哈萨克族医生的常用药材,应用
于本研究中,但是不同的地域环境条件对醉马草
中的活性成分有着重大影响。在本课题组其他成
员的前期研究中发现,1号和2号采集点所采集
的醉马草中苦马豆素质量分数存在较明显差异,
1号采集点的醉马草苦马豆素较为丰富,而2号
采集点的醉马草几乎不含有该种生物碱类物质。
为了深入研究醉马草中的活性成分对乳房炎性表
皮葡萄球菌生物膜形成能力的影响,本研究选择
这2个采集点的醉马草,探索不同地区的醉马草
对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响,为将醉马草
及其活性成分应用于防制奶牛乳房炎提供理论
依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 试验菌株 表皮葡萄球菌 ATCC 35984
(BF+、ica+)、ATCC 12228(BF-、ica-)均由上海
复旦大学医学院馈赠;表皮葡萄球菌5-65-1及
5-125-C从患有奶牛乳房炎的奶样中分离获得。
1.1.2 醉马草 醉马草分别采集自不同的地区,
一份来自于新疆南疆天山山麓(1号采集点),另
一份采自新疆南疆某市周边地区(2号采集点)。
1.1.3 仪器试剂 96孔细胞培养板,酶标仪
(Biolog),恒温培养箱,粉碎机,移液器,胰蛋白胨
大豆肉汤培养基(TSB),双蒸水,结晶紫等。
1.2 方 法
1.2.1 醉马草水煎液的制备 将不同地区所采
集的醉马草样品烘干、粉碎为直径约1mm的粉
末,称取100g粉末至瓷量杯中,并加入一定量的
双蒸水(水浸过药面2~3cm),浸泡30min,大火
煮开,文火熬煮20min,纱布过滤药液,滤渣再进
行同样处理,合并2次药液,115℃灭菌15min,
4℃ 保存,备用[12]。
1.2.2 微量板半定量法检测细菌生物膜的形成
 根据Christensen等[13]的方法并略做改动。按
照体积比为1∶100的比例接种生长至对数期的
菌液至TSB液体培养基中,混匀,再吸取200μL
混合液至96孔板的孔中,每孔5个重复组,3个
不加表皮葡萄球菌 ATCC 35984的醉马草水煎
液对照组,每个96孔板上设空白对照、阳性对照
和阴性对照组。置37℃恒温培养箱中培养24h,
取出后测定菌株生长浊度OD590nm值,拍出菌液,
无菌水洗涤4次,56℃烘干固定1h,w=0.5%
结晶紫染色5min,自来水冲去染液,室温晾干后
·43· 西 北 农 业 学 报 23卷
测定OD490nm值。将所得数据进行处理分析。每
个试验在不同的时间进行,重复3次。
1.2.3 总生物碱的提取  醉马草中总生物碱的
提取依照文献[14-15]并做略微改动,具体步骤
如下:
浸泡:无水乙醇浸泡醉马草粉末48h,料液
比为1∶10。
滤离 心:4 层 纱 布 过 滤 浸 液,弃 滤 渣,
5 000r/min离心10min。
浓缩:取上清,旋蒸法浓缩浸液,去除乙醇(旋
转蒸发仪浓缩)。
酸化:向浓缩后的浸液中加入φ=1% 硫酸
200mL进行酸化,pH至2。
碱化:一般用氨水,本试验用氢氧化钠将酸化
液pH调至8~9。
萃取:用氯仿萃取3次,每次加入氯仿体积为
碱化液体积的1/3。
浸膏制备:合并氯仿相,旋蒸法浓缩至少量,
并用少量氯仿冲洗蒸馏瓶内壁,合并后 (约
5~10mL)置室温通风处挥发氯仿,制备浸膏。
溶解浸膏:将浸膏溶于水,并加入φ=0.1%
吐温-80使用超声波清洗仪助溶,用于试验。
总生物碱的检测:采用3种生物碱检测方法
对所提取得到的生物碱进行检测,检测方法分别
为碘-碘化钾法、碘化汞钾法和碘化铋钾法。
以提取得到的总生物碱分别制备工作液。称
取1mg至无菌1.5mL离心管中,将其置紫外灯
下照射 0.5h 灭菌处理,向其中加入1mL
φ=0.1% 的无菌吐温-80水溶液,震荡混匀,
4℃ 保存,备用。
1.2.4 微量板半定量法检测总生物碱对细菌生
长及其生物膜形成的影响 分别将提取得到的不
同地区的总生物碱工作液(质量浓度为1g/L)稀
释至10mg/L及100mg/L后再上样至96孔细
胞培养板,具体操作同“1.2.2”。
2 结果与分析
2.1 不同地区醉马草水煎液对表皮葡萄球菌生
物膜形成的影响
前期研究结果表明,当醉马草水煎液体积分
数φ=7.5%时,表皮葡萄球菌生物膜的形成几乎
被完全抑制。在本研究中所采用的醉马草水煎液
体积分数即为φ=7.5%。
从图1可以看出,1号采集点的醉马草水煎
液能够极大地抑制表皮葡萄球菌 ATCC 35984
及2株临床分离表皮葡萄球菌5-65-1及5-125-C
生物膜的形成(P<0.05)。而同样条件下加入2
号采集点的醉马草水煎液后,3株表皮葡萄球菌
生物膜的形成并未受到太大影响(P>0.05),仍
显示为生物膜强阳性。2个采集点的醉马草水煎
液对于3株表皮葡萄球菌的生长均无抑制作用
(P>0.05),相反,在一定程度上还促进细菌的生
长,这可能是由于在水煎液中存在的一些多糖、蛋
白质等物质为细菌的生长繁殖提供更为全面的生
长条件。总体来说,该结果充分说明在2个地区
的醉马草水煎液中某种活性物质的质量分数存在
较大差异,导致对表皮葡萄球菌生物膜形成的影
响出现2种不同的结果。
图1 不同地区醉马草水煎液处理后表皮葡萄球菌生长及其生物膜的形成
Fig.1 Effects of GCHD from different regions on growth and biofilm formation of S.epidermidis
·53·12期 任晓镤等:不同地区醉马草对表皮葡萄球菌生物膜形成的影响
2.2 不同地区醉马草中总生物碱对表皮葡萄球
菌生物膜形成的影响
通过前期调查得知,所采集的2个地区醉马
草样品在某些生物碱方面的质量分数存在一些差
异,因此对这2个地区所采集的醉马草样品进行
总生物碱的提取,然后检测其对表皮葡萄球菌生
物膜形成的影响,结果见图2。从图2可以看出,
1号采集点的醉马草中所提取的总生物碱,质量
浓度为10mg/L时即对3株表皮葡萄球菌生物
膜的形成有明显的抑制作用(P<0.01);而在2号
采集点所采集的醉马草中所提取的总生物碱,质
量浓度达到100mg/L时仍对3株表皮葡萄球菌
生物膜的形成无明显影响(P>0.05);并且各地
区各质量浓度的总生物碱均对3株表皮葡萄球菌
的生长无任何影响(P>0.05)。从该结果可见,1
号采集点的醉马草中含有某种具有抑制表皮葡萄
球菌生物膜形成而不影响细菌生长的生物碱类物
质,而此物质在2号采集点的醉马草中质量分数
甚微或者不含有。
图2 不同地区醉马草总生物碱处理后表皮葡萄球菌生长及其生物膜的形成
Fig.2 Effects of alkaloid in GCH from different regions on growth and biofilm formation of S.epidermidis
3 讨 论
醉马草是新疆的特色中草药之一,一直以来,
它作为哈萨克医生的常用药材,具有消肿止痛、清
热解毒等功效,并用于腮腺炎和关节疼痛的治疗,
具有很好的效果。然而,不同地区的中草药,其所
含的化学成分、生物活性和毒性也有所差异。地
区环境、温度等各种外界因素对其影响非常大。
因此,不同产地、不同采收季节和不同加工方法都
会对中草药的质量产生很大影响。即使是同一品
种的中草药,若产地不同,其作用、安全性都有较
大差别;而同一品种的药材,若产地相同,采集季
节不同或用药部位不同,对其安全性也有较大的
影响。通过本研究结果可知,醉马草亦是如此:同
为新疆南疆地区,然而天山山麓(1号采集点)与
南疆某市周边地区(2号采集点)所采集的醉马草
制备的水煎液及提取的总生物碱对3株表皮葡萄
球菌生物膜形成的影响有显著差异(P<0.05)。
从中可以看出,出现这种差异的原因是在2个采
集点的醉马草中某种具有抑制生物膜形成活性的
生物碱类物质的质量分数有较大差异。其中苦马
豆素在1号采集点醉马草中的质量分数远高于2
号采集点。该物质质量分数的差异也有可能是本
研究中引起2个地区醉马草水煎液对表皮葡萄球
菌生物膜影响显著不同的原因。
苦马豆素属于属吲哚兹定生物碱,分子式为
C8H15NO3,相 对 分 子 质 量 173,熔 点 144~
145℃,纯品为白色针状晶体[16],是醉马草中已
经被明确鉴定的一种生物碱,它能够表现明显的
抗肿瘤作用,作为一种极强的α-甘露糖苷酶竞争
性抑制剂通过抑制肿瘤细胞表面糖蛋白的表达,
降低肿瘤细胞对内皮细胞的黏附,从而达到抑制
肿瘤细胞的生长与转移,是目前国内外研究的重
要抗肿瘤性物质[17]。生物膜的形成也是细菌通
过黏附于物体表面,进而呈现出强致病力。苦马
豆素可能通过抑制细菌的初始黏附而达到抑制生
物膜的形成,但是在所选择的2个地区的醉马草
中,其苦马豆素的质量分数存在较大差异。1号
采集点的醉马草中所含的苦马豆素质量分数明显
要高于2号采集点,新疆南疆天山地区属于高山
·63· 西 北 农 业 学 报 23卷
脚下,海拔较高,而某市周边地区地处塔里木盆
地,海拔相对较低,两地区醉马草的生长环境具有
较大差异,周围的微生物环境也不相同,而有报道
称醉马草内的活性物质的形成与其内生菌密切相
关,因此两地区醉马草出现不同试验结果也就理
所当然。
生物碱类物质一直是国内外学者研究的热
点,但由于在醉马草水煎液中生物碱的种类过多,
含量过少,因此在本研究中并未真正找到具有抑
制生物膜形成的具体活性生物碱类物质,只是推
测这种活性物质可能为苦马豆素。但是,本研究
为采用中草药醉马草治疗南疆奶牛乳房炎提供线
索,为开发利用这种资源丰富的南疆特色中草药
奠定基础。
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