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中国农学通报 2011,27(22):276-280
Chinese Agricultural Science Bulletin
基金项目：福建省科技重大专题“食用菌新品种选育及安全生产技术研究与示范”（2008SZ0002）；福建省科技厅2010年公益类科研计划项目“特色食
（药）用菌种质资源保藏与评价”（2010R1022-3）。
作者简介：李洪荣，女，1963年出生，河北人，工程师，主要从事食用菌菌种保藏研究。通信地址：350014福建省晋安区前横路95弄10号福建省农业
科学院食用菌研究所，Tel：0591-83334374，E-mail：lhr0213@sohu.com。
收稿日期：2011-04-15，修回日期：2011-07-04。
0 引言
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异
甚至死亡，因而常常造成种质资源的衰退，并有可能使
优良种质资源丢失。种质资源保藏的重要意义就在于
尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保种质资源
不死亡、不变异、不被污染以达到便于研究、交换和使
用等诸方面的需要。种质资源保藏对于基础研究和实
际生产具有特别重要的意义。在基础研究中，种质资
源保藏可以保证研究结果获得良好的重复性。对于实
际应用的生产菌种，可靠的保藏措施可以保证优良菌
种长期高产稳产。中国食用菌产业的持续发展与菌种
资源的收集、保藏和利用有密切的关系。菌种资源的
采集与保藏是开发自然界微生物资源的必要途径。许
多发达国家都把微生物资源的收集、保存和利用作为
产业竞争的一个重要举措。种质资源是开展食用菌研
究和开发工作的重要基础，品种改良依赖于遗传资源
的保护。因此，菌种保藏具有十分重要的意义。
食用菌种质资源的液氮保藏期一般可达到 15年
双孢蘑菇液氮保藏菌株的遗传稳定性分析
李洪荣
（福建省农业科学院食用菌研究所，福州 350014）
摘 要：双孢蘑菇As2796、As3003、As4607、As4580等4个菌株经4年的液氮保藏，菌种解冻后进行成活
率的测定，恢复生长的菌种在粪草培养基上进行不同温度、不同含水量及不同酸碱度的走菌试验，同时
进行纤维素酶活力的测定、同工酶谱检测、RAPD检测及出菇栽培等试验。试验结果表明双孢蘑菇菌种
在液氮中经过4年的保藏，液氮保藏菌种的菌丝生长速度、纤维素酶活力与对照菌株相同，同工酶电泳
酶谱和RAPD扩增条带保持不变，栽培出菇仍保持着原有的生长特性与产质量性状。液氮保藏方法可
以长期保持双孢蘑菇菌种的稳定性。
关键词：食用菌；保种；农艺性状；同工酶；RAPD
中图分类号：S646.1+1 文献标志码：A 论文编号：2011-1106
Analysis on the Genetic Stability of Agaricus bisporus Strains Preserved in Liquid Nitrogen
Li Hongrong
(Edible Fungi Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350014)
Abstract: After 4 years’preservation in liquid nitrogen, 4 Agaricus bisporus strains, i.e. As2796, As3003,
As4607 and As4580, were thawed and detected for the survival ratio. The survived cultures were put into
mycelia running test in compost with different water content, different pH value and under different
temperature. Moreover, their cellulase activity, isozyme patterns, RAPD patterns and fruiting ability were also
checked. The experimental results showed that after 4 years’liquid nitrogen preservation, the stock cultures of
A. bisporus had the same mycilia growth speed and cellulase activity as the control, and they kept the same
isozyme and RAPD patterns, as well as the original fruit-bodies growing characteristics, production and
quality. Therefore, the liquid nitrogen preservation could keep the stability of A. bisporus stock culture in a
long time.
Key words: edible fungus; stock culture preservation; agricultural characteristics; isozyme; RAPD
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李洪荣：双孢蘑菇液氮保藏菌株的遗传稳定性分析
以上，是目前被公认的最有效的菌种长期保藏技术之
一[1]。液氮超低温保藏技术是将菌种在-196℃的液态
氮，或在-150℃的气态氮中长期保藏的方法，其原理是
利用生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保
藏微生物。San、Sobieralski等报道双孢蘑菇菌种经过
液氮保藏后，蘑菇菌丝生长速度及产量均不会受到影
响[2-3]。
食用菌菌种保藏效果的鉴定，常用的指标是菌株
存活率[4]，但是对于栽培菌株来说，保藏效果的鉴定，
只测菌株成活率并不能反应其菌株特有的栽培特性及
其遗传特征是否得以完全保存。为了能系统评价菌种
的保藏效果，必须对菌株的遗传稳定性进行全面的分
析。传统的遗传特性分析主要包括生理生物学特性、
生化指标等方面。张金霞[5]在草菇菌种保藏效果鉴定
的研究中认为，酯酶同工酶谱和可溶性蛋白带是鉴别
草菇菌种保藏效果的可利用的生化标志。随着分子生
物学技术的发展，利用分子标记研究生物的系统进化、
遗传变异、基因定位、分离与克隆等已成为近年来研究
的热点。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列
变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传变异的直接
反映。由于分子标记与以往的遗传标记相比有着许多
优越性，因此它们在食用菌的亲本鉴定、菌株及杂合子
鉴定、遗传变异、基因分离与克隆等方面已得到了广泛
的应用[6-11]。Fani[12]在对Azospirillum菌的保藏研究过
程中也应用了RAPD技术，证实其是一种简单、快速、
安全、有效的菌种鉴别方法，并且可以作为评估菌种在
外界环境中遗传稳定性的有力工具。
双孢蘑菇菌种的液氮保藏效果尚未进行系统研
究，本文应用生理生化指标、分子生物学等技术对液氮
中保藏 4年的蘑菇菌种进行遗传稳定性系统分析，并
与菌种的生物学特性与栽培表现等农艺性状进行比
较，观察液氮保藏方法是否引起双孢蘑菇菌种的变异，
确定双孢蘑菇菌种液氮保藏方法的可行性。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
双孢蘑菇菌株 As2796，As3003，As4607，As4580
由福建省农科院食用菌研究所种质资源与遗传育种研
究室保藏提供。
1.2 方法
1.2.1 液氮保藏管 采用 3~5天菌龄的PDA菌丝块，以
10%甘油作为冷冻保护剂，装在聚丙烯安瓿管内，安瓿
管浸入液氮进行菌种保藏。
1.2.2 冷冻方法（慢速冷冻）即把装有菌种的安瓿管先
在液氮罐口预冷，缓慢地从上往下降，30 min后，安瓿
管温度降至-40℃时，再把安瓿管浸入液氮。
1.2.3 解冻方法（急速解冻）即从液氮中取出的安瓿管
放入38℃的温水中快速解冻。
1.2.4 存活率计算 经液氮保藏的菌种，取出解冻后移
接至PDA培养基上正常培养，计算正常萌发的接种块
占总移接接种块的比率。
1.2.5 菌落和菌丝形态观察 经液氮保藏的菌种取出
后，在 PDA培养基上继代培养 2次后，观察经液氮保
藏的菌种恢复生长后的菌落形态和菌丝形态。
1.2.6 菌丝体长速测
（1）PDA培养基中生长速率的测定：菌丝萌发5天
后，在菌丝前沿画1条线，继续培养5天，用直尺测量菌
丝生长长度。
（2）粪草培养基中生长速率的测定：把恢复生长的
菌丝块接种到装有粪草培养基的试管中，菌丝吃料 5
天后，做一记号，继续培养 10天用直尺测量菌丝生长
长度。
1.2.7 菌丝体纤维素酶活力的测定 按沈业寿等的方法
进行[13]。
1.2.8 酯酶同工酶谱的电泳分析 按Wang等的方法进
行[14]。
1.2.9 RAPD检测 [15] 引物分别为 H4、H5、U16、U18、
U20、B1。
1.2.10 出菇试验[16] 采用稻草和牛粪为主的二次发酵
培养料配方。
2 结果与分析
2.1 液氮保藏对菌种存活率的影响
对As2796等 4个菌株进行了液氮中保藏不同时
间菌种的存活率抽检，结果表明（表1），不同双孢蘑菇
菌种经过24和48个月的液氮保藏，存活率均达100%，
其中 As2796、As30032个品种萌发时间比 As4607，
As4580两个品种快1~2天。
菌株
As2796
As3003
As4607
As4580
保藏时间/月
24
48
24
48
24
48
24
48
萌发时间/d
3~4
3~4
3~4
3~4
4~5
4~5
4~5
4~5
萌发率/%
100
100
100
100
100
100
100
100
表1 在液氮中保藏不同时间菌种的存活率
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mm/d
2.2 液氮保藏对菌种的菌丝形态及生长速率影响
试验表明，As2796等4个不同的蘑菇菌种经过液
氮的 48个月保藏，仍保持着菌株的原有菌丝生长形
态，表现为菌丝生长旺盛，气生菌丝浓白，菌落圆整，生
长整齐。表 2数据表明，经过液氮保藏 48个月后
As2796等蘑菇菌株，其菌丝生长速率在PDA或草基培
养基上与对照菌株均无明显差异。
2.3 液氮保藏菌种对菌丝的纤维素酶活力的影响
应用透明圈法对As2796等蘑菇菌株经液氮保藏
后的纤维素酶活力进行测定，结果见表 3，As2796等 4
个蘑菇菌株经过液氮保藏后，纤维素酶活力与常规保
藏的菌种没有差异，说明液氮保藏不会导至纤维素酶
活力的下降，从而保证菌丝的正常生长。
2.4 液氮保藏菌种酯酶同工酶谱的差异分析
As2796等4个蘑菇菌株经液氮保藏不同时间进行
酯酶同工酶的电泳分析，结果见图 1。液氮保藏的菌
株与常规保藏的菌株的酯酶同工酶标志区带完全相
同，说明经过液氮保藏的菌株在蛋白质表达上没有发
生变异，即液氮保藏方法可以长期稳定地保持该菌株
的酶活力，菌种的生化变异降低至最低水平。
菌株
As2796
As3003
As4607
As4580
培养基
PDA
草基
PDA
草基
PDA
草基
PDA
草基
保藏方法
液氮
常规
液氮
常规
液氮
常规
液氮
常规
液氮
常规
液氮
常规
液氮
常规
液氮
常规
生长速率
Ⅰ
3.5
3.9
2.7
2.8
4.2
3.8
2.6
2.7
3.6
3.4
2.5
2.5
4.2
3.8
2.6
2.5
Ⅱ
3.7
3.8
2.5
2.6
3.6
4.0
2.7
2.6
3.4
3.4
2.7
2.8
3.9
3.6
2.7
2.9
Ⅲ
3.6
3.7
2.7
2.6
3.8
3.9
2.8
2.8
3.6
3.8
2.8
2.7
3.6
4.2
2.8
2.7
Ⅳ
3.8
3.4
2.7
2.7
3.8
3.7
2.6
2.8
3.7
3.6
2.6
2.8
3.5
3.8
2.8
2.7
平均
3.65
3.70
2.65
2.68
3.85
3.85
2.68
2.73
3.58
3.55
2.65
2.70
3.80
3.85
2.73
2.70
表2 菌株在液氮中保藏48个月后的菌丝生长速率比较
表3 在液氮中保藏48个月的菌株对菌丝纤维素酶活力的影响
菌株
As2796
As3003
As4607
As4580
保藏时间
48个月
48个月
48个月
48个月
保藏方法
液氮
常规
液氮
常规
液氮
常规
液氮
常规
透明圈大小
Ⅰ
0.9
1.1
1.2
1.0
0.9
1.1
1.1
1.1
Ⅱ
1.3
1.0
1.0
1.2
1.1
0.8
0.9
1.0
Ⅲ
1.0
1.1
1.0
1.0
1.0
1.0
0.9
1.2
Ⅳ
1.2
1.0
1.1
1.1
1.2
1.1
1.2
1.1
平均
1.10
1.05
1.08
1.05
1.05
1.00
1.03
1.10
注：*培养5天后测量透明圈大小，透明圈大小=整个透明圈直径-菌落直径。
cm
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李洪荣：双孢蘑菇液氮保藏菌株的遗传稳定性分析
2.5 液氮保藏菌种RAPD差异分析
As2796菌株 2种不同保藏方法的RAPD检测，结
果见图 2。液氮保藏的菌株与常规保藏的菌株的
RAPD扩增条带完全相同，说明经过液氮保藏的菌株
遗传物质在分子水平上没有发生变异，即液氮保藏方
法可以长期稳定地保持该菌株的遗传特性，使菌种的
突变、退化降低至最低水平，有利于菌种的长期保藏。
2.6 液氮保藏菌种对菌株的产质量影响
恢复正常生长的液氮菌种经过制备栽培种，进行
常规季节性栽培的出菇对比试验，观察各菌株的菌丝
生长速率、上土能力、出菇快慢以及产质量表现等农艺
性状，结果见表 4。液氮保藏菌种与常规保藏菌种在
产量和质量等主要农艺性状均无明显差异，仍然保持
1 2 3 4
1：As2796（常规）；2：As2796（液氮）；3：As4607（常规）；4：As4607（液氮）
图1 双孢蘑菇保藏菌种酯酶同工酶图谱
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
M 10 11 12 13 14 15 16 17 18
图谱1—3、4—6、7—9、10—12、13—15、16—18分别为引物H4、H5、
U16、U18、U20、B1扩增的条带，M为标准分子量。其中1、4、7、10、13、
16为As2796常规保藏菌株，2、5、8、11、14、17为液氮保藏菌株
（As2796N1），3、6、9、12、15、18为液氮保藏菌株（As2796N2）
图2 双孢蘑菇保藏菌种RAPD扩增图谱
菌株
2796
3003
4607
4580
保藏
方法
液氮
常规
液氮
常规
液氮
常规
液氮
常规
产量/(kg/m2)
Ⅰ
10.75
9.20
8.93
10.04
6.98
7.85
7.37
7.95
Ⅱ
9.85
9.95
9.02
7.95
7.38
7.42
7.83
8.02
Ⅲ
9.70
10.98
8.55
8.84
8.10
6.95
7.62
7.75
平均产量
/(kg/m2)
10.10
10.04
8.83
8.94
7.49
7.41
7.61
7.91
平均粒重
/g
12.5
11.7
14.8
14.0
14.2
13.9
14.4
13.6
表4 在液氮中保藏48个月后对菌株产质量的影响（采菇时间42天）
该菌株的高产优质特性。
3 结论
液氮保藏试验成活率与否与菌株冷冻方法和解冻
方法及所用保护剂关系很大，试验研究表明采用 10%
甘油作为冷冻保护剂，慢速冷冻，急速解冻的方法，液
氮保藏菌种的成活率可达到 100%。菌种的成活率只
能说明液氮可以长期保持菌种的活性，液氮保藏是否
对菌种产生不良的影响，需要通过遗传稳定分析加以
判断。本文对液氮保藏菌种的生物学特性、生理生化
及分子生物学等遗传稳定性进行分析，结果显示经过
液氮中保藏的菌种，菌丝生长速度与对照菌株相同，纤
维素酶活力保持不变，同工酶检测酶谱和RAPD图谱检
测没有差异。液氮保藏的菌种经过一段时间的恢复生
长，制备成栽培种进行了生产性对比试验，结果表明液
氮保藏的菌株仍保持原有的栽培特性与农艺性状。综
合上述的实验结果，经过 4年液氮保藏的双孢蘑菇菌
种，完全保持该菌株的遗传稳定性，证明了双孢蘑菇菌
种的液氮保藏方法是1种长期有效的菌种保藏方式。
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4 讨论
液氮保藏法是长期保藏食用菌菌种的最有效的保
藏方法[17-18]。蔡令仪[19]研究表明，液氮保藏的双孢蘑菇
菌种，其产量和单菇重比4℃冰箱保藏的略高，因此，液
氮是保藏双孢蘑菇菌种较理想的方法。目前菌种液氮
保藏技术的研究主要集中在保藏的防冻剂及处理技术
工艺等2方面，对液氮菌种保藏效果的鉴定，必须做出
菇实验才能确认，随着菌种遗传稳定性分析的建立，在
营养生长阶段对保藏效果进行鉴定成为可能。生化指
标中酯酶同工酶因受外界环境条件的影响小，稳定性
好，从而在生物分类以及鉴定中得到广泛应用。张金
霞[5]研究发现草菇菌种经过液氮保藏，酯酶同工酶类
型保持不变，与本研究的结果相似，因此通过酯酶同工
酶的分析可作为蘑菇液氮保藏菌种的遗传稳定性指标
之一。
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