全 文 ：菌 物 学 报 26（1）：128~134, 2007
Mycosystema

汤洪敏云南野生大白口蘑遗传多样性研究
汤洪敏 1，2 吴 刚 1 虞 泓 1
(1云南大学生命科学学院生态遗传学实验室, 昆明 650091; 2贵州民族学院化学系, 贵阳 550025)
摘 要：应用 DALP技术对云南野生大白口蘑遗传多样性进行分析。筛选的 5组引物在大白口蘑 6个菌塘
的 56朵子实体中检测到 202个位点，其中多态位点 151个，多态位点百分比 PPB为 74.75％。6个菌塘
总的观察等位基因数 Na为 1.7475；总的有效等位基因数 Ne为 1.4659；Nei’s基因多样性指数H为 0.2722；
总的Shannon多样性指数 I为 0.4053；菌塘总的基因多样度Ht为 0.2705，菌塘内基因多样性度Hs 为 0.012，
菌塘间基因分化系数 Gst 为 0.9556，菌塘的遗传一致度在 0.60 ~ 0.80之间。结果表明大白口蘑遗传变异
有 95.56％存在菌塘间，4.44％存在菌塘内，即大白口蘑遗传变异绝大多数存在于菌塘之间。
关键词：菌塘，直接扩增片断长度多态性
中图分类号：Q939.5 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2007）01-0128-0134
Genetic diversity of Tricholoma giganteum Massee in Yunnan
TANG Hong-Min 1, 2 WU Gang1 YU Hong 1*
( 1 Laboratory of Ecological Genetics, College of Life Science, Yunnan University, Kunming650091; 2Department of Chemistry,
Guizhou University for Nationalities, Guiyang 550025)
Abstract: Genetic diversity of Tricholoma giganteum in Yunnan was determined by using DALP analysis. Five
primer groups were screened in 6 shiroes of T. giganteum. Among 202 DNA fragments amplified 151 were
polymorphic, the percentage of polymorphic bands (PPB) was 74.75%. In the 6 shiroes, the total observed number
of alleles (Na) was 1.7475; the total effective number of alleles (Ne) was 1.4659; the total Nei’s gene diversity (H)
was 0.2722; the total Shannons Information index (I) was 0.4053; the total gene diversity (Ht) was 0.2705 while the
gene diversity within a shiro (Hs) was 0.012. The coefficient of gene differentiation (Gst) was 0.9556 among shiroes,
Neis genetic identity was at the range of 0.60 ~ 0.80. The result indicated that 95.56% genetic variation occurred
among shiroes and 4.44% within a shiro, it was suggested that most of genetic variation be among shiroes of T.
giganteum.
Key words: Shiro, Direct amplification of length polymorphism (DALP)
大白口蘑 Tricholoma giganteum Massee，是一种新近推出的珍稀栽培菌种，有较高的
食、药用价值，但其物种遗传多样性的研究尚未见报道。本研究运用 DALP分子标记技术，
以采自云南楚雄同一菌塘的松口蘑 Tricholoma matsutake (S. Ito & S. Imai) Singer（子实体
10朵）为比较，对采自云南省思茅、红河地区的六个野生大白口蘑菌塘（子实体共 56朵）
的遗传多样性进行了分析。从分子水平探讨了大白口蘑遗传多样性及其变异式样。为大白

基金项目：贵州省教育厅自然科学基金资助项目（No. 2004217）
?通讯作者：E-mail address: hongyu@ynu.edu.cn
收原稿日期：2006-03-14，收修改稿日期：2006-08-08
DOI:10.13346/j.mycosystema.2007.01.020
1期 汤洪敏等：云南野生大白口蘑遗传多样性研究 129

口蘑资源的可持续利用提供基础性资料，进而为蕈菌选育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料来源
大白口蘑子实体采自云南思茅、红河地区，由中国科学院昆明植物所杨祝良博士鉴定，
凭证标本现存放于昆明植物所。实验材料来源见表 1。
表 1 实验材料
Table 1 The materials used in this study
物种
Species
菌塘产地
Shiro locality
生境
Habitat
备注
Remark
思茅市曼连 (Tr1)
Manlian, Simao

腐竹根土壤，向阳
Humus soil with bamboo,
apricus
菌盖浅奶油色，菌柄较长基部膨大
Pileus surface pale cream. Stipe elongate,
cylindrical, swollen at base
思茅市大寨 (Tr2)
Dazhai, Simao
农舍牲畜圈旁空地上
Open land by farmhouse
菌盖浅奶油色，菌柄较长基部膨大
Pileus surface pale cream. Stipe elongate,
cylindrical, swollen at base
红 河 州 红 河 县 独 格
(Tr3)
Duge, Honghe
常绿阔叶林下，向阳斜坡
Under evergreen broad- lesved
forest ,apricus slope
菌盖浅棕色，菌柄基部膨大
Pileus surface pale brown. Stipe cylindrical,
swollen at base.
墨江县打东 (Tr4)
Dadong, Mojiang
常绿阔叶林下，阴坡 Under
evergreen broad- lesved forest,
shade slope
菌盖浅棕色，菌柄基部膨大
Pileus surface pale brown. Stipe cylindrical,
swollen at base.
思茅市三棵桩 (Tr5)
Sankezhuang, Simao
枯树桩旁裸地，向阳
Open land by exarid stub,
apricus
菌盖浅棕色，菌柄基部膨大
Pileus surface pale brown. Stipe cylindrical,
swollen at base.
大白口蘑
T. giganteum
思茅市整碗 (Tr6)
Zhengwan, Simao
公路边常绿阔叶林缘灌丛
Under scrub by evergreen
broad- lesved forest
菌盖浅棕色，菌柄基部膨大
Pileus surface pale brown. Stipe cylindrical,
swollen at base.
松口蘑
T. matsutake
楚雄州双柏县团山田
(Tm)
Tuanshantian, Chuxiong
松树林阴湿地
Dank soil under pine forest
菌盖具深红褐色鳞片，菌柄上下近等粗
Pileus surface reddish-brown covered scales.
Stipe cylindrical, rearly equal.
1.2 方法
1.2.1 总 DNA提取：每菌塘分别取 8~10朵子实体的菌柄、菌盖交界处组织，总 DNA提取
参照 Lee & Taylor（1990）的方法。总 DNA用 1%的琼脂糖凝胶（agarose gel）电泳，0.5 µg/mL
溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色，用 25 ng/µL，50 ng/µL，75 ng/µL，100 ng/µL
的 ?DNA标定。利用 Kodak 1D分析软件分析并标定到 30 ng/µL备用。
1.2.2 引物筛选：引物序列见表 2。从 10 组引物中筛选条带清晰、反应稳定的 5个组合：
选择性引物 DALP221、231、232、234、235与反向引物 R1，进行扩增。
1.2.3 反应体系与扩增程序
采用20µL反应体系，其中模板DNA 2µL (60 ng), 10×Buffer with MgCl2 2 µL（Taq
130 菌 物 学 报 26卷

酶配套）, 2.5 mmol/L dNTP Mixture（Promega ,上海生工进口分装）2 µL，0.5 U/µL Taq
酶 (Promega ，上海生工进口分装) 5 µL，5 pmol/L选择性引物（上海生工合成）3 µL，5
pmol/L反向引物（上海生工合成）1 µL，灭菌超纯水 5 µL。
表 2 引物序列
Table 2 Sequences of the primers used in this study
引物
Primer
名称
Name
序列
Sequence
反向引物
Reverse Primer
DALPR1 TTTCACACAGGAAACAGCTATGAC
DALP221 GTTTTCCCAGTCACGAC GC
DALP231 GTTTTCCCAGTCACGAC AGC
DALP232 GTTTTCCCAGTCACGAC GAC
DALP233 GTTTTCCCAGTCACGAC ACG
DALP234 GTTTTCCCAGTCACGAC CAG
DALP235 GTTTTCCCAGTCACGAC CAC
DALP241 GTTTTCCCAGTCACGAC TCAG
DALP242 GTTTTCCCAGTCACGAC CTAG
DALP243 GTTTTCCCAGTCACGAC TCGA
选择性引物
Selective Primers DALP 2XX
DALP244 GTTTTCCCAGTCACGAC CTGA
重扩增和测序通用引物
Re-amplification and
sequencing: U.S.P.
-40USP GTTTTCCCAGTCACGAC
U.S.P: 通用测序引物. 灰色框显示－40 USP序列
U.S.P., Universal sequencing primers. The grey box indicates the –40 USP sequence

PCR扩增程序：用 PE9700（美国 PE公司）扩增仪，95 ℃预变性 5分钟，然后进行
40个循环：94 ℃变性 30s，50 ℃复性 30s，72 ℃延伸 1min，循环结束后 72 ℃延伸 10min。
扩增产物检测：PCR扩增产物在 1.5 ％的琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭(EB)染色，
Kodak Image Station 440CF凝胶成像系统拍照，检测DALP带型是否清晰。
1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶制备、电泳及银染显色
参照王海英等（2005）的方法。凝胶染色干燥后用计算机图象扫描仪扫描，保存图片。
从保存的扫描图片中统计 DALP条带。
1.2.5 数据处理
电泳图谱中根据分子量标准对照反应产物在胶上的位置，估计扩增产物及其分子量。
有带记为 1，无带记为 0，弱带及重复性不好的条带不予统计，形成 0/1矩阵图输入计算机。
采用 POPGENE软件计算出各菌塘的 Nei’s基因多样性指数（H）、Shannon’s多态性信息指
数(I)、多态位点百分率（PPB）、基因分化系数（Gst）、菌塘内基因多样度（Hs）、菌塘间
基因多样度（Ht）等相关指标，并进行 UPGMA聚类分析。
1期 汤洪敏等：云南野生大白口蘑遗传多样性研究 131

2 结果与分析
2.1 DALP电泳图谱分析
筛选获得的 5个 DALP引物对供试菌塘的所有子实体 DNA共扩增 202条重复性高的
清晰条带，图 2为 DALP图谱。



图 2 DALP指纹图谱示意图
Fig. 2 DNA fingerprints of DALP

扩增 DNA片断的分子量在 170~2800bp之间，每个引物扩增条带数为 35~45条。在扩
增出的 202 条带中有 151条为多态条带，6 个菌塘总的多态位点百分比 PPB为 74.75％。
但各菌塘的 PPB值均较低，与 Shannon多样性指数 I分析结果相同。基于基因频率矩阵，
利用平均观察等位基因数Na、平均有效等位基因数Ne和 Nei’s 基因多样性指数 H对大白
口蘑菌塘的遗传多样性进行评价，得到了与 Shannon多样性指数 I分析一致的结果（表 3）。
2.2 遗传分化及聚类分析
遗传分化相关指标见表 4。大白口蘑 6个菌塘总的基因多样性指数 Ht 为 0.2705，菌塘
内多样性指数 Hs 为 0.0120，菌塘间基因分化系数 Gst 为 0.9556。大白口蘑约有 95.56％
的遗传变异来自菌塘之间，4.44％来自菌塘内子实体间，遗传变异绝大多数分布在菌塘间，
即大白口蘑遗传变异绝大多数存在于菌塘之间；而菌塘内不同子实体间的遗传差异非常小，
近乎于一个无性系。
各菌塘的 Nei’遗传一致度和遗传距离见表 5，菌塘遗传距离的UPGMA聚类图见图 3。
在大白口蘑的 6个菌塘中，遗传一致度最大为整碗菌塘和三棵桩菌塘间为 0.8104。最
小为三棵桩菌塘和红河县独格菌塘间为 0.5784。多数菌塘的遗传一致度在 0.60-0.80之间。
大白口蘑 6个菌塘的 UPGMA聚类分析显示，供试的大白口蘑 6个菌塘被聚为三个小
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Tr31－ 10 M Tr41 － 9 M M Tr31－ 10 M Tr41－ 9
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类群：群? 由思茅市曼连菌塘（Tr1）和思茅市大寨菌塘（Tr2）组成；群? 由思茅市三棵
桩菌塘（Tr5）和思茅市整碗菌塘（Tr6）组成；群? 由红河县独格菌塘（Tr3）和墨江县
打东菌塘（Tr4）组成。群? 和群? 先聚合后再与群? 聚合。也就是说同一地区地理位置较
近的菌塘间遗传一致度高，遗传距离接近，在聚类图上首先聚合；地理隔离较远的菌塘之
间，遗传距离相对较大，聚合较晚。而作为外类群的松茸在聚类图上明显与大白口蘑的菌
塘分开。
表 3 大白口蘑菌塘遗传多样性
Table 3 Genetic diversity of shiros in Tricholoma giganteum
物种
Species
菌塘
Shiro
总位点数
Total number
of loci
多态位点数
Number of
polymorphic loci
多态位点
百分比%
PPB
等位基因数
Na *
有效等位
基因数
Ne *
Nei’s 基因
多样性指数
H *
Shannon
多样性指数
I *
Tr1 202 6 2.97 1.0297 1.0238 0.0132 0.0189
Tr2 202 2 0.99 1.0099 1.0093 0.0048 0.0067
Tr3 202 6 2.97 1.0297 1.0237 0.0132 0.0188
Tr4 202 4 1.98 1.0198 1.0125 0.0071 0.0105
Tr5 202 5 2.48 1.0248 1.0208 0.0113 0.0161
Tr6 202 11 5.54 1.0545 1.0402 0.0225 0.0326
平 均
mean
202 5.7 2.82 1.0281 1.0217 0.0121 0.01727
大白口蘑
T.giganteum
总 计
total
202 151 74.75 1.7475 1.4659 0.2722 0.4053
松口蘑
T. matsutake
Tm 202 40 19.80 1.1980 1.1529 0.0838 0.1205
* Na = Observed number of alleles（平均观察等位基因数）
* Ne = Effective number of alleles (Kimura & Crow, 1964) （平均有效等位基因数）
* H= Neis (1973) gene diversity（遗传多样性指数）
I = Shannons Information index (Lewontin, 1972) （Shannon 多样性指数）

表 4 大白口蘑菌塘的遗传分化
Table 4 Genetic differentiation among shiros of T. giganteum
物种
Species
总基因多样性
Ht *
菌塘内基因多样性
Hs *
菌塘间基因分化系数
Gst *
白口蘑 T．giganteum 0.2705 0.0120 0.9556
标准差 SD 0.0349 0.0011 －
* Ht =Total gene diversity ; * Hs =Gene diversity within shiro; * Gst =The coefficient of gene differentiation
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表 5 遗传一致度和遗传距离
Table 5 Nei’s genetic identity and genetic distance
pop ID Tr1 Tr2 Tr3 Tr4 Tr5 Tr6 Tm

Tr1 **** 0.7729 0.5955 0.7149 0.7365 0.6987 0.6071
Tr2 0.2576 **** 0.5792 0.6471 0.7524 0.6814 0.5491
Tr3 0.5183 0.5461 **** 0.7916 0.5784 0.5843 0.4002
Tr4 0.3356 0.4352 0.2337 **** 0.6792 0.6689 0.5169
Tr5 0.3059 0.2845 0.5475 0.3869 **** 0.8104 0.6017
Tr6 0.3586 0.3836 0.5374 0.4021 0.2103 **** 0.5612
Tm 0.4990 0.5994 0.9158 0.6600 0.5080 0.5777 ****
遗传一致度（对角线上方）和遗传距离（对角线下方）
Neis genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal)

s
菱镁矿







图 3遗传距离的 UPGMA聚类图
Fig.3 UPGMA dendrogram based on Neis (1978) genetic distance

3 讨论
本研究中采用 DALP分子技术对大白口蘑遗传多样性进行检测，研究结果表明大白口
蘑同一菌塘内子实体间的遗传变异非常小，只约有 4.44％，这与其生长特性是相吻合的。
大白口蘑是基部相连、丛生的大型真菌，能以菌丝的无性繁殖在适宜的生境中生长多年。
观察研究还发现，如遇环境条件恶劣，菌丝还可通过形成厚垣孢子构成其生活史中的无性
小循环（文章另行发表）。因此可以认为同一菌塘内的子实体相当于是一个无性系，其子实
体间的遗传变异甚微。大白口蘑物种的遗传变异绝大多数分布在菌塘间约有 95.56％，菌塘
间遗传一致度在 0.60-0.80之间，6个菌塘总的多态位点百分比 PPB为 74.75％。因此，大
白口蘑绝大多数遗传变异存在于菌塘之间，并且菌塘间遗传差异的大小，与其距离的远近

Tm
Tr6
Tr3
Tr1
Tr4
Tr2
Tr5
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有密切关系。从总体上看，随着空间距离的增大，菌塘间的遗传异质性相应增高。代江红
和林芳灿（2001）在对野生香菇的遗传关系研究中也得出了相同的结论。
当今世界上食、药用菌的栽培面临的一个严重问题是所用生产菌株的遗传变异背景狭
窄(Khush et al.,1992; 赵勇等 2003)，这使得它们的杂交育种面临巨大困难（Royse & May,
1982）。本研究表明，大白口蘑物种具有丰富的遗传多样性，作为珍稀栽培菌种颇具开发利
用价值。在大白口蘑开发利用过程中，应广泛收集不同地理种源的野生菌塘种质资源，为
其栽培育种提供更多的选择素材，并注重野生大白口蘑优良性状菌株之选育，运用到人工
栽培中。
本文是把 DALP技术运用到高等真菌遗传多样性检测的一种尝试，由于 DALP是共显
性标记，共显性数据提高了数据可信度、提供了完整的遗传信息，加上 DALP 对 DNA 纯
度和质量要求不高、技术难度低、耗费小等优点(Desmarais et al., 1998)，有望成为高等真
菌遗传多样性检测的重要技术之一。
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