全 文 ： 1
DOI: 10.13344/j.microbiol.china.150823
3 种野生牛肝菌的菌塘土壤细菌多样性
秦余 李茜茜 郑雨焕 丁光玲 郭霞*
(重庆师范大学生命科学学院 重庆 401331)
摘 要：【目的】以远东疣柄牛肝菌(Leccinum extremiorientale)、美味牛肝菌(Boletus edulis)
和小孢粉孢牛肝菌(Tylopilus microsporus)菌塘为对象，揭示其菌塘土壤细菌的菌群多样性。
【方法】通过高通量测序方法，分析这 3种野生牛肝菌菌塘土壤细菌的菌群结构及多样性。
【结果】远东疣柄牛肝菌菌塘土样中的主要细菌类群为变形杆菌门(53.6%)、酸杆菌门
(33.8%)、拟杆菌门(4.7%)、放线杆菌门(1.7%)；美味牛肝菌中主要类群为酸杆菌门(40.7%)、
变形杆菌门(38.1%)、拟杆菌门(10.3%)、放线杆菌门(3.1%)；小孢粉孢牛肝菌中酸杆菌门
(65.3%)、变形杆菌门(23.8%)、拟杆菌门(4.9%)为主要类群。细菌在属级分类水平上远东疣
柄牛肝菌菌塘中主要属中 69.8%为未知属，其余为伯克氏菌属 Burkholderia (16.0%)，酸杆菌
门中的 Candidatus Solibacter (5.9%)和酸孢菌属 Acidocella (3.3%)。美味牛肝菌中主要的属分
布在未知类群(83.0%)，此外，还有 Candidatus Solibacter (8.0%)，伯克氏菌属 Burkholderia
(2.1%)。小孢粉孢牛肝菌菌塘中，分别为未知类群(80.9%)和 Candidatus Solibacter (12.6%)。
【结论】3种牛肝菌菌塘土壤中细菌类群具有丰富的多样性，其中含有大量未知类群。
关键词：外生菌根菌，牛肝菌，高通量测序，菌塘
Bacteria diversity of shiroes soil growing three species of
wild Boletus
QIN Yu LI Qian-Qian ZHENG Yu-Huan DING Guang-Ling GUO Xia
*

(School of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China)
Abstract: [Objective] In order to study the community diversity of shiroes soil, shiroes of
Leccinum extremiorientale (Le), Boletus edulis (Be) and Tylopilus microsporus (Tm) were
investigated. [Methods] Bacterial diversity and community structure of shiroes of these wild
Boletus were analyzed via high throughput sequencing. [Results] Major phyla of Le, Be and Tm

Foundation item: Natural Science Foundation of Chongqing (No. cstc2012jjA80028); Characteristic Major
Building Project of “Sante Action Plan” by Chongqing Higher Education (No.
YuJiaoGao[2013]49); Foundation of Chongqing Normal University (No. 14XYY021)
*Corresponding author: Tel: 86-23-65910139; E-mail: guoxiaamy@163.com
Received: October 26, 2015; Accepted: March 01, 2016; Published online (www.cnki.net): March 02, 2016
基金项目：重庆市自然科学基金项目(No. cstc2012jjA80028)；重庆市本科高校“三特行动计划”特色专业建
设项目(No. 渝教高[2013]49)；重庆师范大学基金项目(No. 14XYY021)
*通讯作者：Tel：86-23-65910139；E-mail：guoxiaamy@163.com
收稿日期：2015-10-26 接受日期：2016-03-01 优先数字出版日期(www.cnki.net)：2016-03-02
网络出版时间：2016-03-02 08:39:44
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1996.Q.20160302.0839.002.html
2
were Proteobacteria (53.6%), Acidobacteria (33.8%), Bacteroidetes (4.7%), Actinobacteria (1.7%);
Acidobacteria (40.7%), Proteobacteria (38.1%), Bacteroidetes (10.3%); Acidobacteria (65.3%),
Proteobacteria (23.8%) and Bacteroidetes (4.9%), respectively. The dominant genera of Le, Be
and Tm were unclassified bacteria (69.8%), Burkholderia (16.0%), Candidatus Solibacter (5.9%),
Acidocella (3.3%); unclassified bacteria (83.0%), Candidatus Solibacter (8.0%), Burkholderia
(2.1%); unclassified bacteria (80.9%), Candidatus Solibacter (12.6%), respectively. [Conclusion]
The bacterial diversity is abundant in the three shiroes and there are a number of unclassified
bacteria.
Keywords: Ectomycorrhiza, Boletus, High throughput sequencing, Shiroes
牛肝菌是一类外生菌根菌，营养价值丰富，味道鲜美，具有非常高的经济以及食药用价
值。李泰辉和宋斌对我国牛肝菌资源进行了系统的调查，发现我国已知牛肝菌 199种，牛肝
菌资源非常丰富[1]。目前仅有极少数牛肝菌种类，例如远东疣柄牛肝菌可以实现仿生栽培[2]，
暗褐网柄牛肝菌与小粒咖啡苗形成的人工菌塘中获得了发育成熟的子实体[3]，但是，绝大数
牛肝菌种类尚不能人工栽培或人工栽培十分困难。多数外生菌根菌很难用人工栽培法和宿主
建立共生关系，其中关键的因素主要集中在菌根菌、宿主、环境三者的联系。菌塘是由菌丝
与植物根系及土壤颗粒相互交错扭结而成的团状结构，是菌丝体与宿主植物共生并进行营养
交换的场所，也是其进行核配与分化并形成子实体原基的地方，是菌根菌完成其整个生活不
可缺少的场所。牛肝菌菌丝生长缓慢，容易退化，人工培养非常困难，与宿主植物形成菌根
效率低。于富强等将牛肝菌采集地土壤浸出液作为分离培养基的成分，牛肝菌分离成功率从
41.7%–58.3%，提高到 70%[4]，并指出人工培养基质接近牛肝菌的野外生存营养环境，是成
功分离的重要因素之一。为什么添加牛肝菌菌塘土壤浸出液能促进牛肝菌菌丝生长呢？可能
是菌塘中分离的微生物对菌根菌的菌丝生长和菌根的合成有一定的积极作用，土壤中的微生
物分泌了某些代谢产物促进了菌丝生长。而人工培养菌丝因为缺乏这些特异代谢物，生长缓
慢。近年来，研究发现植物根圈促生细菌不仅能提高菌根真菌对植物根部的侵染效率[5]，还
能通过与外生菌根真菌的互作改良土壤结构和促进植物营养吸收[6]。但是，牛肝菌菌塘土壤
中到底都有哪些细菌类群，优势菌群是哪些类群，鲜有报道。
本文以重庆石柱县当地盛产、并且十分受当地人喜欢的 3 种牛肝菌，远东疣柄牛肝菌
(Le)、美味牛肝菌(Be)和小孢粉孢牛肝菌(Tm，煮熟过水后食用)菌塘土壤为研究对象，利用
高通量测序技术，研究菌塘细菌的多样性，以期为研究牛肝菌的菌塘生态功能、人工菌塘的
建立、菌根菌人工培植和人工林地驯化提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集：2014年 8月于平均海拔 1 550 m的重庆石柱黄水森林公园采到用于研究
的 3 种牛肝菌菌塘土样。采样点位于针阔叶混交林，乔木主要为云南松(Pinus yunnanensis
Franch.)、云南油杉(Keteleeria evelyniana Mast.)、青冈(Cyclobalanopsis glauca)，菌塘枯枝落
叶层厚度为 1.5–2.2 cm。采其菌塘正下方 5–10 cm深处的菌塘土壤。每一种牛肝菌选择 5个
其生长旺盛的菌塘，首先用灭菌且锋利的小刀轻轻拨开牛肝菌菌塘表面的土壤，用灭菌的镊
子将菌塘的土壤夹起放入灭菌的布袋中混匀后，迅速放入冰盒内，尽快带回实验室。将每种
3
牛肝菌 5个菌塘的土壤分别放入搅拌机中混匀后，分别取混合土壤用于 DNA提取。
1.1.2 主要试剂和仪器：PCR扩增仪、凝胶成像仪，美国 Bio-Rad公司；DNA提取试剂盒，
广州美基生物科技有限公司。
1.2 土壤总 DNA的提取
用 HiPure Soil DNA Kits (Magen，广州)专用土壤 DNA提取试剂盒提取土壤总 DNA。
1.3 高通量测序分析
提取的各样本细菌总 DNA，扩增 16S rRNA 基因序列的 V3-V4 可变区，引物 F：
5′-GTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，引物 R：5′-GTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。
PCR反应体系为：含 15 mmol/L MgCl2的 10×Buffer 10.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL，10
μmol/L引物各 5.0 μL，5 U/μL Taq酶 1.0 μL，DNA模板 4.0 μL，灭菌去离子水 73.0 μL，总
体积 100 μL。PCR反应条件为：94 °C 5 min；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 30 s，30个循环；
72 °C 10 min。扩增好的 DNA序列，采用 Illumina MiSeq第二代高通量测序平台测定 16S高
变区域的序列，测序长度 2×250 bp (委托北京华诺时代科技有限公司完成)。
1.4 数据分析
对获得的测序数据，采用 COPE 软件及其内部程序进行数据拼接和过滤，0.97 相似度
下利用 Qiime (v1.8.0)软件提交到 RDP数据库搜索比对。数据的统计分析以每个样品中可操
作的分类单元(Operational taxonomic unit，OTU)作为分类和计算的依据[7-8]。在本文中，定义
一个 OTU 为不少于 120个有效碱基，且碱基差异小于 3%，即序列中碱基差异少于 3 个的
序列群，一个 OTU在结果分析中被视为代表 1种细菌。
2 结果与分析
2.1 测序结果的质量分析
对各土壤样品中高通量测序的数据进行统计(表 1)，OTU数值越大，说明物种多样性越
丰富。从表中可见，从 Le、Be和 Tm样品中分别读取了 20 399、17 852、7 681个序列，其
中优质序列 OTU分别为 2 677、2 770、1 441个。3种牛肝菌的菌塘 OTU数量存在一定差
异，Le菌塘的 OTU数值最大，其次是 Be的菌塘，最低是 Tm的菌塘。从各个样品的序列
总数和 OTU总数的比值来看，3种牛肝菌的测序序列数可基本覆盖 OTU的多样性，其中，
Le和 Be样品的测序深度要好于 Tm样品。
表 1 各样品中高通量测序数据统计
Table 1 Data analysis of high throughput sequencing of each sample

Sample

Total numbers of valid sequences in each
sample
OTU
Total OTUs in each
sample
OTU /
The ratio of total OTUs/total
sequences
Le 17 852 2 770 0.155
Be 20 399 2 677 0.131
Tm 7 681 1 441 0.188
注：Le、Be和 Tm分别代表远东疣柄牛肝菌、美味牛肝菌和小孢粉孢牛肝菌.
Note: Le, Be and Tm represent Leccinum extremiorientale, Boletus edulis and Tylopilus microsporus.
从 3种样品中随机抽取的测序条数如图 1横轴所示，纵轴则表示基于该测序条数能构建
的 OTU数量，绘制了各样品高通量测序结果的稀释性曲线。当曲线趋于平坦时，说明测序
数据量合理，更多的数据量对发现新 OTU的边际贡献很小；反之则表明继续测序还可能产
4
生较多新的 OTU。该分析是基于 OTU 序列差异水平在 0.03即相似度 97%的水平上进行运
算的。从图上分析，除了 Tm样品以外，Le和 Be样品曲线逐渐趋于平缓，说明有效序列可
以基本覆盖 OTU的多样性。其中，Le和 Be样品的测序质量优于 Tm样品。
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 5000 10000 15000 20000 25000
The number of random sequence
T
h
e
O
T
U
s
b
as
in
g
o
n
r
an
d
o
m
s
eq
u
en
ce
n
u
m
b
er
s
Le
Be
Tm
5 000 10 000 15 000 20 000 25 000


3 000
2
1 000

图 1 3种样品高通量测序结果的稀释曲线
Figure 1 The dilution curves of high throughput sequencing results of three samples
2.2 各样品中细菌多样性及相关性分析
在 0.97的相似度下，得到了每个样品的 OTU个数，利用 R (v3.1.1)画图软件绘出 Venn
图，结果可以展示多样品相同和各自特有 OTU 数目，直观展示样品间 OTU 的重叠情况。
结合 OTU所代表的物种，可以找出不同环境中的核心微生物。如图 2所示，Le样品中含有
细菌种类 2 770个，Be样品中 2 677个，Tm样品中含有 1 441个。其中，Le和 Be有相同
种类 1 708个，即 31.3%的种类是相同。Be与 Tm共有 1 011个，共有种类约 21.5%；Le和
Tm共有 916个，共有种类约 24.6%。三者共有 OTU 654个，即 9.50%的种类同时出现在 3
种牛肝菌的菌塘中。

图 2 3 种样品中细菌多样性的相关性分析
Figure 2 The similarity analysis of bacteria diversity among three samples
注：图中数字为各样品中的 OTU数量.
Be
Le Tm
800 168 262
654
357 1 054
612

25 0
5
Note: The number in each figure is the OTU amount in three samples.
2.3 菌塘中菌群组成分析
将 OTU的序列提交 16S ribosomal RNA sequences (Bacteria and Archaea) RDP数据库中
进行同源性比对，结果发现 3 种牛肝菌菌塘土壤细菌菌群丰富，Le 菌塘土样中共检测到细
菌门 26个，属 72个；Be菌塘土样则为门 26个，属 53个；Tm菌塘土样则为门 22个，属
44个。Le菌塘土样中的主要门分别为变形杆菌门(53.6%)、酸杆菌门(33.8%)、拟杆菌门(4.7%)、
放线杆菌门(1.7%)；Be 中主要类群为酸杆菌门(40.7%)、变形杆菌门(38.1%)、拟杆菌门
(10.3%)、放线杆菌门(3.1%)；Tm中酸杆菌门(65.3%)、变形杆菌门(23.8%)、拟杆菌门(4.9%)
为主要类群。
在属的层次下对各样品物种丰度进行统计，3个样品所含物种基本相似，但物种分布差
异较大，图 3对所含主要种属进行了分析和归类。3种牛肝菌菌塘土壤细菌中优势物种在数
据库中并没有相关的已知信息可供参考。Le主要属中，69.8%为未知属，即与未培养细菌的
序列相似性较高，此外，还有伯克氏菌属 Burkholderia (16.0%)，酸杆菌门中的 Candidatus
Solibacter (5.9%)，酸孢菌属 Acidocella (3.3%)。Be 中主要的属分布在未知类群(83.0%)，
Candidatus Solibacter (8.0%)，伯克氏菌属 Burkholderia (2.1%)。Tm中主要属分别为未知类
群(80.9%)、Candidatus Solibacter (12.6%)。
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Le Be Tm
Others
Rhodoplanes
Acidocella
Candidatus Solibacter
Burkhoulderia
Bacteria unclassified

图 3 3 种样品中的主要属的分布图
Figure 3 Major genus distribution of three samples
2.4 各样品中优势 OTU 种类的丰度分析
对各样品中 OTU 优势度最高的前 10 位进行丰度分析，并将每个样品中优势度最高的
前 10种 OTU的序列提交 16S ribosomal RNA sequences (Bacteria and Archaea) RDP数据库中
进行同源性比对，选取比对结果中相似度最高的已知菌株序列作为参考。结果发现，在菌塘
中的优势细菌在数据库中几乎没有已知序列可供比对。
3 讨论
3种牛肝菌菌塘中变形杆菌门、酸杆菌门、拟杆菌门为优势类群。牛肝菌菌塘土壤中含
有较多的变形菌门和拟杆菌门，这与从云南松口蘑菌塘中分离到可培养细菌类群变形菌门
(占 58.43%)、厚壁菌门(占 26.40%)、拟杆菌门(占 10.67%)，其次还有放线菌门(占 4.49%)比
较一致[9]。Candidatus Solibacter和 Burkholderia是 3种牛肝菌的优势属，与松口蘑菌塘可分
ers
hodoplanes
Acidocella
Candidatus Solibacter
Bacteria unclassified
rkhoulderia
6
离微生物中也含有大量伯克氏菌属 Burkholderia细菌相似。从这些优势属或者优势门中分离
菌根促生细菌应该是一种可行并且快捷的途径。
菌根菌和宿主共生的微环境菌塘，具有特定的菌落结构和丰富的细菌多样性。菌塘土壤
细菌种类与普通林区土壤细菌菌群存在较大的差异，例如宝天曼森林土壤以变形菌门(29%)、
酸杆菌门(18.5%)、疣微菌门(10%)等为主[10]。与菜地土壤微生物类群相比，其主要是 α-和 γ-
变形杆菌亚门微生物[11]，与牛肝菌菌塘细菌类群也存在较大差异。这种差异不仅与土壤所处
环境有关，还与具体的检测方法有关。文献关于菌塘促生细菌的分离报道中，芽孢杆菌属报
道较多。例如，芽孢杆菌属细菌能提高粘盖牛肝菌[12]和彩色豆马勃的菌丝生长和菌根生成
[13]。蜡状芽孢杆菌对美味牛肝菌菌丝的促生作用均得到证实[5]。但是，实验中牛肝菌菌塘中
的厚壁菌门微生物确有检测到，但并不是优势菌群，3 种样品中都有少量 OTU 属于厚壁菌
门的链球菌属和芽孢杆菌属。可能是因为由于土壤生态系统的复杂性，某些细菌与土壤颗粒
结合紧密，在离心去除土壤颗粒的同时，丢失了一部分土壤微生物类群。放线菌类群可以通
过在菌塘中释放抗生素，抑制其它致病微生物生长，从而促进菌根菌与宿主共生。例如，链
霉菌属细菌能促进毒蝇鹅膏菌丝生长，提高共生植物云杉二级根菌根形成率 1.2–1.7倍[14]。
3种牛肝菌中也均检测到少量放线菌属细菌，但是数量较少均不是优势种群。菌塘中发现大
量优势菌群，与未培养微生物同缘关系。可能是因为，虽然人们已分离培养了大量细菌种类，
但是已发现的细菌物种数约占自然界中存在种类的 10%。这是一类目前认识不足的微生物
类群，也可能与特殊的微环境有关[15]。菌塘是一个复杂且特殊的生态系统，菌根菌子实体
的形成，与菌塘微生物密切相关。此外，还有温度、降雨、植被、光照等环境因素的影响，
以及采集方式和管理模式等因素[16]。本研究仅检测了菌塘细菌多样性，要获得牛肝菌菌塘
微生物多样性的完整信息，还需要对菌塘真菌以及原生动物的多样性，环境因子对菌塘微生
物多样性的影响进行研究。
致谢：感谢重庆师范大学生命科学学院王汉臣副教授和长江师范学院陈今朝教授在牛肝菌鉴
定中的帮助。
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