全 文 ：盆栽条件下暗褐网柄牛肝菌人工菌塘
及其子实体的培养 ?
纪开萍 , 张春霞 , 曾 雁 , 刘昌芬 , 何明霞 , 王文兵
( 云南省热带作物科学研究所 , 云南 景洪 666100 )
摘要 : 在土壤中添加促进暗褐网柄牛肝菌 ( Phlebopus portentosus) 菌丝及其宿主咖啡生长的营养液 , 用暗褐
网柄牛肝菌纯培养种接种盆栽件下的咖啡苗根系 , 结果表明 : 92 .5% 以上的小粒咖啡 ( Coffea arabica) 苗
形成菌根 , 菌根上外延菌丝向根尖、侧根及根系周围的土壤延伸生长 , 与土粒相互交结形成菌塘。接种
20 天后 , 菌塘中子实体紧贴咖啡苗茎基或于咖啡苗株间生长 , 共生长 162 个子实体 , 发育成熟 52 个。子
实体菌柄基部菌索与咖啡苗主根表面菌套连接。
关键词 : 暗褐网柄牛肝菌 ; 营养液 ; 人工菌塘 ; 成熟子实体
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2007) 05 - 554 - 05
Artificial Fungal Colony and Its Fruiting of Phlebopus
portentosus (Boletaceae) in Pot
J I Kai-Ping, ZHANG Chun-Xia, ZENG Yan, LIU Chang-Fen,
HE Ming-Xia, WANG Weng-Bing
( Yunnan Tropical Crops Research Institute, J inghong 666100 , China)
Abstract: Nutrient solution was added into soil to improve the growth of hyphae and its host seedlings ( Coffea arabica) .
Pureculture of Phlebopus portentosuswas inoculated in the roots of the host seedling . Results showed that over 92 .5% of
seedlings were found withmycorrhiza . External hyphae develop to thetop or side of the roots, and even in the soil around
roots . Fungal colonies (shiros) were ultimately formed . Itwas found that youngfruit bodies appeared around or among the
host seedlings after inoculation of 20 days . 52 of 162 young fruit bodies grew into mature in pots .
Key words: Phlebopus portentosus; Nutrient solution; Artificial fungal colony; Mature fruiting
暗褐网柄牛肝菌 [ Phlebopus portentosus ( Berk .
& Broome) Boedijn ( Pegler, 1986) ] , 又名异样脉
柄牛肝菌 ( 宋斌 , 2004) , 见于亚洲及非洲热带 ,
国内广西、海南有分布 (臧穆 , 2006 ) , 也见于
西双版纳景洪 ( 纪开萍 , 2006) , 是一种菌根型
食用菌。
菌根食用菌人工诱导栽培存在下列困难 : ①
菌种纯培养生长速度极其缓慢 , 菌丝体难以迅速
扩增。如华美牛肝菌 ( Boletus speciosus Frost) , 其
组织培养获得的纯菌丝生长速度很慢 , 菌丝日生
长量仅 0 .2 mm (吴金荣 , 2002 ) ; ②人工菌根化
小苗移栽后 , 菌丝体在培养基质中生长缓慢 , 难
以形成菌落或人工菌塘。如松口蘑 [ Tricholoma
matsutake (S . Ito et S . Imai) Singer] , 其菌丝体在
宿主植物体内形成哈蒂网后仍难于在菌根周围形
成大量菌丝体 , 菌根小苗移栽出现菌丝生长退
化 , 并且有的菌根仅能存活 4 个月左右 ( Yamada
等 , 2001) 。菌根上有限生长的外延菌丝无法形
云 南 植 物 研 究 2007 , 29 (5) : 554～558
Acta Botanica Yunnanica

? ?基金项目 : 云南省科技厅预研项目资助
收稿日期 : 2007 - 01 - 09 , 2007 - 04 - 04 接受发表
作者简介 : 纪开萍 (1966 - ) 女 , 云南临沧人 , 助理研究员 , 主要从事外生菌根食用菌及食用菌栽培研究。
成天然条件下松口蘑子实体形成的场所 - 菌塘 ,
因而也就无法继续进行子实体的诱导试验 ( 伦志
明等 , 2005 ) ; ③菌丝体形成子实体原基以及由
原基发育成子实体的机理并不清楚。
纪开萍等 ( 2006 ) 报道 , 暗褐网柄牛肝菌其
菌丝生长速度快 , 添加促进菌丝生长的营养液
后 , 菌丝生长健壮、致密 , 与培养基质紧密结合
形成团块状结构。但培养土中添加营养液形成的
菌根苗 , 子实体收获后菌根上菌膜、菌索枯萎 ,
菌根苗枯萎死亡。本文筛选了适宜宿主树咖啡苗
生长的营养液浓度 , 并将暗褐网柄牛肝菌纯培养
固体种接种在小粒咖啡 ( Coffea arabica L .) 苗的
根系上 , 盆栽条件下成功培养了暗褐网柄牛肝菌
人工菌塘及成熟子实体 , 为菌根食用菌人工培养
奠定了基础并探索出新的途径。
1 材料和方法
1 .1 材料
1 .1 .1 供试菌株、营养液 人工分离野生暗褐网柄牛肝
菌子实体纯培养 01 菌株 , 营养液Ⅰ、Ⅳ。
1 .1 .2 供试土壤 晒干的红壤。
1 .1 .3 供试宿主苗 咖啡沙床催芽苗。
1 .1 .4 供试培养盆 口径 30 cm的花盆。
1 .1 .5 人工培养的子实体凭证标本放在中国科学院昆明
植物研究所真菌标本室 , 编号为 HKAS 49706。
1 .2 方法
1 .2 .1 菌种扩培 母种扩培成液体种 (菌龄 10 d) , 液
体种扩培成固体种 (菌龄 40 d)。
1 .2 .2 适宜咖啡苗生长的营养液浓度的筛选 0. 02%、
0 .04%、0 .1%的营养液Ⅰ及 5 .0%、10 .0%、15 .0% 的营
养液Ⅳ均匀喷洒在红壤中并混合均匀 , 对照喷水。用花
盆装土壤 , 10 .0 kg (干土计 )?盆 , 移栽苗龄 5 个月的咖
啡苗 , 15 株?盆。每处理 3 个重复 , 淋水管理。栽苗后 60
d测苗高、地径 , 称茎叶及根的鲜重、干重。筛选出适
宜咖啡苗生长的营养液浓度。
1 .2 .3 适宜菌根率形成及子实体生长的营养液浓度的筛
选 土壤中营养液添加同“1 .2.2”, 以添加清水为对照。
用花盆装土壤 , 10 .0 kg (干土计 )?盆 , 移栽苗龄 18 个月
的咖啡苗 , 10 株?盆 , 4 次重复。栽苗时接种暗褐网柄牛
肝菌 B-01-1 固体原种 (对照同样接种 ) , 50 g?株 , 然后淋
定根水。培养盆置于塑料棚 + 遮荫网的荫棚中 , 使菌种
萌发生长、侵染宿主形成菌根及菌塘。
1 .2 .4 菌根率、菌塘形成及子实体生长观测 接种后观
察子实体生长情况 , 子实体生长中期或成熟时观测菌根
率及菌塘形成情况。
1 .2 .4.1 子实体生长观测 接种 20 d后 , 每天观察记录
培养盆中子实体生长的个数、分化出土至成熟的时间
(以产孢散射孢子为成熟标准 )、成熟的个数 , 并标记生
长子实体的咖啡菌根苗。子实体成熟时采收称重。
1 .2 .4.2 菌塘观测 子实体中等成熟时 , 观测咖啡菌根
苗上菌丝、菌索、菌套的形成情况 , 菌丝、菌索在土壤
中生长、分布及与菌柄基部相连的情况。
1 .2 .4.3 菌根苗、菌根率观测 子实体生长中期或成熟
采收后 , 用头部稍尖的木棍扒开盆中咖啡苗茎基 0 .2～
2 .5 cm深的土层 , 若咖啡苗的茎基或主根上生长菌膜、
菌索 , 说明形成菌根苗。菌根率 : 接种咖啡苗中菌根苗
的百分率。
1 .2 .5 统计分析 利用分析软件 SPSS 11 .5 , Duncan氏
单因素方差分析 (显著水平 0.05、0 .01) 检验营养液对
菌丝日平均生长量、咖啡苗生长量及对子实体生长的差
异显著性。
2 结果与分析
2 .1 适宜宿主咖啡苗生长的营养液浓度
营养液Ⅰ、Ⅳ有促进宿主咖啡苗生长的作
用。土壤中添加 0 .02%的营养液Ⅰ及 5 .0%的营
养液Ⅳ , 咖啡苗的根鲜重、茎叶干重、根干重极
显著高于对照 ( 表 1 )。
2 .2 菌根苗形成及营养液对菌根率形成的影响
接种 30 d, 菌根苗茎基部及主根部被深黄色
菌索、菌膜包裹形成菌套 , 菌套表面粘附土粒 ,
对照 ( 不接种 ) 咖啡苗根系表面无菌膜、菌索
(图 1: 1～ 2 )。菌根苗的茎基部及主根部上菌
膜、菌索浓密 , 侧根及根尖上无菌丝或菌丝稀
疏。土壤中添加 0 .02% ～0 .2% 营养液Ⅰ , 菌根
率 92 .5%～100 .0% ; 添加 5 .0%～10 .0%营养液
Ⅳ , 菌 根 率 97 .5% ～ 100 .0% ; 对 照 菌 根 率
100 .0% ; 三者的菌根率无显著差异 (表 2) 。
2 .3 菌塘形成情况
子实体紧帖菌根苗的茎基生长 , 子实体菌柄
基部菌索与菌根上菌索相连接 (图 1: 3 )。咖啡
菌根苗周围 0 .2～2 .0 cm深的表层土下 , 即分布
有菌索。菌索自菌根苗的茎基及主根上的菌套延
伸生 长于土壤中 , 树状分 枝 , 网状 结构 , 粗
0 .24～2 .5 mm, 与土粒相互交结形成菌塘 (图 1:
4) , 菌根苗位于菌塘中心。菌索旺盛生长与土壤
交结形成 0 .2～0 .3 cm厚的“菌块”, 菌块上可生
5555 期 纪开萍等 : 盆栽条件下暗褐网柄牛肝菌人工菌塘及其子实体的培养
长多个子实体 ( 图 1: 5 )。菌塘中菌索的一端与
菌根苗上菌套相连 , 另一端与子实体菌柄基部相
连 ( 图 1: 6 )。
2 .4 子实体生长情况
子实体紧贴咖啡苗茎基部生长或位于菌塘中
的“菌块”上 , 多为单生 ( 图 1: 7～9 )。从接
种至出菇需 20～30 d。从出菇至成熟需 5～6 d
(图 1: 10～12)。除添加 0 .02%营养液Ⅰ出菇仅
2 盆外 , 其余均出菇 3～4 盆 (表 3)。
2 .5 营养液对子实体生长的影响
土壤中添加 0.04%、 0.2% 的营养液Ⅰ 及
5 .0%、10 .0% 营养液Ⅳ , 子实体生长数、成熟
数均高于不添加营养液的对照 ( 表 3 ) , 但因各
重复的子实体生长数、成熟数差异大 , 因此差异
检验不显著。土壤中添加 5 .0% 的营养液Ⅳ , 子
实体总重及单重均显著高于其它处理 ( 表 4 )。
图 1 1 . 菌根表面菌索 ; 2 . 菌根与不接种的苗的根系 ; 3 . 菌索连接子实体及菌根 ; 4 . 菌塘中菌索 ; 5 . 菌塘中菌块连接菌根苗
及子实体 ; 6 . 菌塘中菌索连接菌根苗及子实体 ; 7～9 . 子实体出菇状 ; 10 . 出菇第 2 天 ; 11 . 出菇第 4 天 ; 12 . 出菇第 5 天
Fig . 1 1 . shoestring on mycorrhizal ; 2 . mycorrhizal and seedling root without inoculation; 3 . fruiting was connected by shoestring and mycorrhizal ;
4 . shoestring in shiro; 5 . myceliumwas connected with mycorrhizal seedling and fruiting in shiro; 6 . shoestringwas connectedwith mycorrhizal
seedling and fruiting in shiro; 7 - 9 . fruit body grow up; 10 . Mushroom on the second day; 11 . On the fourth day; 12 . On thefifth day
655 云 南 植 物 研 究 29 卷
表 1 土壤中添加营养液Ⅰ、Ⅳ后咖啡苗各项生长量差异显著性分析
Table 1 Analysis of growth of coffee seedlings in soil with nutrient solutionⅠ、Ⅳ for their significant difference
营养液 Nutrient solution
编号 使用浓度
Number Solution ( % )
株高
Height
( cm)
地径
Diameter
(cm)
茎叶鲜重
Fresh weight of
leave (g)
茎叶干重
Dry weight of
leave ( g)
根鲜重
Weight of
root (g)
根干重
Dry weight of
root ( g)
Ⅰ 0 ?. 1 6 .46 a 4 .83 a 11 p. 7 b 3 .3 b 5 ,. 5 b 1 .5 b
CK 0 ?. 0 6 .61 a 5 .02 a 13 p. 0 b 3 .4 b 5 ,. 6 b 1 .8 b
Ⅰ 0 u. 04 6 ?. 94 a 4 .29 a 13 p. 0 b 3 .8 b 6 .. 3 c 1 .93 c
Ⅳ 10 ?. 0 6 .94 a 5 .53 a 14 p. 6 b 3 .7 b 7 ,. 5 d 2 .0 c
Ⅳ 15 ?. 0 7 .18 a 5 .56 a 16 p. 3 b 4 .2 bc 7 ,. 5 d 2 .13 c
Ⅳ 5 ?. 0 7 .58 a 5 .87 a 17 p. 3 b 4 . 8 c 8 -. 2 de 2 .6 c
Ⅰ 0 u. 02 7 ?. 79 a 5 .87 a 22 r. 6 c 6 .2 d 8 .. 5 e 3 .6 f
以上数据 , 株高、地茎来自 45 株苗的平均值 ; 茎叶鲜重、根鲜重、茎叶干重、根干重来自 3 个重复的平均值。不同字母表示处理间
有极显著差异 (单因素方差分析 , Duncan 方法 , P < 0 .01)。
Among the datas above, height and diameter averaged from 45 seedlings: fresh weight of leave?root, dry weight of leave?root averaged from 3 replicates .
Different letters indicate significant difference under treatments assessed by Duncan′s single range test ( P < 0 .01) .
表 2 土壤中添加营养液后咖啡苗菌根率
Table 2 Mycorrhizal ratio of host seedlingwith nutrient solution in soil
观测指标 Test index
营养液Ⅰ
Nutrient solutionⅠ ( % )
0 ?. 1 0 9. 04 0 .2 0 m. 02
营养液Ⅳ
Nutrient solutionⅣ ( % )
5 .0 10 j. 0
CK
( % )
菌根率 Mycorrhizal ratio ( % ) 92 ?. 5 a 97 ?. 5 a 100 . 0 a 100 .0 a 97 .5 a 100 ]. 0 a 100 .0 a
以上数据来自 4 个重复的平均值 , 同一字母表示处理间差异不显著 (单因素方差分析 , Duncan 方法 , P < 0 .05 )。 Data averaged from 4
replicates, different letters indicate significant difference under treatments assessed by Duncan′s single range test ( P < 0 .05 ) .
表 3 子实体生长情况
Table 3 Survey on growth of fruiting body
观测指标 Test Index
土壤中营养液含量 Nutrient solution in soil (v?v, % )
Ⅰ Ⅳ
0 ?. 02 0 ?. 04 0 .1 0 `. 2 5 .0 10 K. 0
CK
( % )
合计
Total
接种盆数 Inoculated pot (个 ) 4 ?4 Q4 4 4 4 ]4 28 {
生长盆数 Growth number ( 个 ) 2 ?4 Q3 3 4 4 ]4 24 {
生长个数 Fruiting number (个 ) 13 ?. 0 37 ?. 0 8 .0 43 s. 0 22 .0 25 K. 0 14 .0 162
成熟数 Mature number ( 个 ) 7 ?. 0 7 ,. 0 6 .0 7 `. 0 11 .0 10 K. 0 4 .0 52 {
成熟率 Ratio of mature fruiting ( % ) 53 ?. 8 18 ?. 9 75 .0 16 s. 2 50 .0 40 K. 0 28 .5
表 4 营养液对子实体生长影响的差异检验
Table 4 To check the effect of nutrient solution on growth of fruiting
营养液 Nutrient solution
编号 使用浓度
Number Solution ( % )
子实体 Fruiting
生长数 成熟数 总重 平均单重
Growth number ( 个 ) Mature number (个 ) Total weight ( g) Averageweight ( g)
0 ?. 02 3 .25 a 1 P. 75 a 36 .25 a 10 /. 20 a
0 ?. 2 10 .75 a 2 P. 0 a 45 .0 a 17 /. 5 a
Ⅰ 0 ?. 04 9 .25 a 1 P. 75 a 41 .25 a 24 /. 5 ab
0 ?. 1 2 .0 a 1 P. 5 a 35 .0 a 34 /. 57 ab
CK 3 ?. 5 a 1 P. 0 a 51 .25 a 42 /. 5 ab
Ⅳ
10 ?. 0
5 ?. 0
6 .25 a
5 .0 a
2 P. 5 a
2 P. 75 a
62 .5 a
126 .25 b
27 /. 5 ab
53 /. 75 b
以上数据来自 4 个重复的平均值 , 不同字母表示处理间有极显著差异 ( 单因素方差分析 , Duncan 方法 , P < 0 .05 )。
Data averaged from 4 replicates, different letters indicate significant difference under treatments assessed by Duncan′s single range test ( P < 0 .05) .
7555 期 纪开萍等 : 盆栽条件下暗褐网柄牛肝菌人工菌塘及其子实体的培养
3 讨论
3 .1 5 .0%的营养液Ⅰ及 0 .02%的营养液Ⅳ促进
咖啡苗的生长 , 对子实体生长有增重作用。其原
因可能是添加的营养物质能被咖啡苗的根系及菌
塘中菌丝吸收利用。但土壤中添加营养液后 , 咖
啡苗的菌根率、子实体生长个数、子实体成熟数
与不添加营养液的对照无差异。说明在纯培养土
中 , 菌丝也可以侵染形成菌根、菌塘并分化、生
长子实体 , 营养液的添加只是促进了子实体生
长 , 使之增加重量。
3 .2 在外生菌根的形成中 , 菌丝发生侵染时 ,
菌丝体在其分泌的纤维素酶、果胶酶、淀粉酶及
其他糖酶等水解的作用下 , 由侵染点通过根尖及
根毛区进入到皮层细胞间隙进行生长繁殖 , 同时
分布于根表皮层外表面的菌丝体繁殖成真菌套将
根尖包裹 , 完成真菌对根的侵染形成菌根 ( 王
琴 , 2002) 。而暗褐网柄牛肝菌接种咖啡苗形成
的菌根 , 接种 30 d 形成的菌根苗 , 其根尖及侧
根无菌膜、菌索生长或生长量很少 , 茎基及主根
部则被浓密的菌膜、菌索覆盖、包裹 , 越往根尖
及侧根部 , 菌丝越稀疏 , 说明菌丝的侵染从茎基
及主根开始。其原因及机理有待进一步研究。
3 .3 对多数菌根食用菌而言 , 人工菌根化苗的
菌根外延菌丝难于延伸生长形成菌塘 , 因此无法
进行子实体分化。本研究在盆栽条件下 , 用暗褐
网柄牛肝菌接种咖啡苗的根系 , 在接种后的 30
～50 d内完成了菌根苗合成—菌塘形成—子实体
分化、生长、成熟等过程。菌根能在短时间内形
成 , 菌根上外延菌丝能迅速延伸生长 , 并与土壤
相互交织生长形成菌塘 , 其原因应与暗褐网柄牛
肝菌菌丝生长速度较快有密切关系。
3 .4 盆栽条件下 , 菌根苗不用移栽 , 菌根苗上
的外延菌丝不会受到损伤。菌根形成、菌塘形成
及子实体分化为一个连续性过程 , 有益于外延菌
丝的延伸生长及累积 , 当外延菌丝累积到一定量
即形成菌塘 , 从而可以分化、生长子实体。另
外 , 咖啡苗的根系较为发达 , 须根较多 , 增大了
菌种与根系的接触面积 , 为菌丝侵染、菌根形成
提供了更多的机率。
致谢 栽培试验用种暗褐网柄牛肝菌 Phlebopus portentosus
的标本为中国科学院昆明植物研究所杨祝良研究员鉴
定 ; 臧穆研究员、杨祝良研究员、杨雄飞研究员审阅初
稿并提出宝贵意见 , 侯建勇参加部分工作。
〔参 考 文 献〕
王琴 ?, 2002 . 辽东栎幼苗的外生菌根合成及其生理效应 [ D] . 哈
尔滨 : 东北林业大学 (硕士学位论文 )
吴金 ?荣 , 2002 . 华美牛肝菌的组织分离及其栽培初探 [ J ] . 食用
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臧穆 ?, 2006 . 中国真菌志第 22 卷 [ M ] . 北京 : 科学出版社 , 1—
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Lun ?ZM ( 伦志明 ) , Li YH ( 李玉花 ) , Xing ST ( 邢树堂 ) , 2005 .
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ble ectomycorrhizal fungi associatedwith Pinus densiflora by in vitro
mycorrhizal synthesis . I . Primordium and basidiocarp formation in
open pot culture [ J ] . Mycorrhiza, 11 : 59—66
—————————————
* ?云南农业大学学报将于 2007 年第 4 期将文章中所有“茶褐牛
肝菌 Boletus brunneissimus Chiu” 更 正 为“ 暗褐 网 柄 牛 肝 菌
Phlebopus portentosus (Berk . & Broome) Boedijn”.
855 云 南 植 物 研 究 29 卷