全 文 ：作者简介:陈小露，女，硕士 研究方向:广东地产药材药理研究与制剂开发，中药资源与分子鉴定 * 通讯作者:梅全喜，男，教授，主任中
药师，硕士生导师 研究方向:广东地产药材药理研究与制剂开发 Tel:(0760)89980306 E-mail:meiquanxi@ 163. com
茅莓根及其混伪品的 DNA条形码鉴定研究
陈小露1，向丽2，梅全喜1* (1. 广州中医药大学附属中山医院，广东 中山 528401;2. 中国中医科学院中药研究所，中药鉴定与安全性检
测评估北京市重点实验室，北京 100700)
摘要:目的 茅莓根与同科属其他物种存在混用现象，为保证安全用药，本实验利用 ITS2 序列对茅莓根及其混伪品进行鉴定
研究。方法 提取茅莓及其混伪品的 DNA，经 PCＲ扩增后测序，通过 CodonCode Aligner V3. 7. 1 对测序序列进行质量分析和
拼接，基于 MEGA5. 1 中的 K2P模型计算茅莓根及其混伪品的种内、种间遗传距离并构建系统聚类树。结果 茅莓 ITS2 序列
比对后长度为 212 bp，种内最大 K2P遗传距离为 0. 014，存在 3 个变异位点，平均 GC含量为 57. 42%。基于 ITS2 序列构建 NJ
树，茅莓及其混伪品能够表现出良好的单系性，均能相互明显区分。从药材市场购买的 23 份茅莓根样品，DNA提取和扩增成
功率为 100%，采用 NJ树分析，其中 13 份药材样品与茅莓聚为一支，其余 10 份属于其他物种。结论 茅莓及其混伪品鉴定难
题可用 ITS2 条形码技术解决。
关键词:茅莓根;ITS2;分子鉴定;混伪品
doi:10. 11669 /cpj. 2015. 17. 007 中图分类号:Ｒ282 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2015)17 － 1490 － 06
Identification of Ｒubi Parvifolii Ｒadix and Its Adulterants Using DNA Barcoding
CHEN Xiao-lu1，XIANG Li2，MEI Quan-xi1* (1. Zhongshan Hospital Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine，
Zhongshan 528401，China;2. Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Key Laboratory of Bei-
jing for Identification Andsafety Evaluation of Chinese Medicine，Beijing 100700，China)
ABSTＲACT:OBJECTIVE To identify Ｒubi Parvifolii Ｒadix from its adulterants using ITS2 sequence. METHODS All the DNA
of Ｒubi Parvifolii Ｒadix and its adulterants were extracted. All the sequences were assembled using the CondonCode Aligner V3. 7. 1.
The Kimura 2-parameter(K2P) genetic distances and the neighbor joining(NJ) phylogenetic tree were calculated by using
MEGA5. 1. ＲESULTS The ITS2 sequences were succesfully amplified and sequenced. The length of ITS2 sequences of Ｒubus parvifo-
lius was 212 bp，and the average GC content was 57. 42% . Among 20 ITS2 sequences of Ｒ. parvifolius，three transversions were de-
tected at site 66，118 and 177. The maximum intra-specific K2P distance of Ｒ. parvifolius was 0. 014，lower than the minimum inter-
specific K2P distances of adulterants，except for Ｒ. coreanus. Additionally，the ITS2 sequences of all the polytypic species were sepa-
rated into pairs of divergent clusters in the NJ tree and Ｒ. parvifolius can be distinguished clearly from its adulterants. The ITS2 se-
quences of 23 samples of Ｒubi Parvifolii Ｒadix collected from different herb markets，were successfully amplified. The NJ tree analysis
indicated that 13 samples clustered with Ｒ. parvifolius，while the other 10 samples were clustered into other divergent clusters. CON-
CLUSION ITS2 Sequence can be used as DNA barcode to correctly identify Ｒubi Parvifolii Ｒadix from its adulterant.
KEY WOＲDS:Ｒubi Parvifolii Ｒadix;ITS2;molecular identification;adulterant
茅莓根为蔷薇科植物茅莓(Ｒubus parvifolius
L. )的干燥根［1］。作为一种传统中药，具有清热解
毒，祛风利湿等作用，主要用于感冒发热，风湿骨痛
等。研究发现，茅莓根在抗鼻咽癌方面有显著的药
理活性，在“鼻咽灵”等中成药中作为主要原料［2-3］。
由于蔷薇科悬钩子属植物的形态以及在名称上常有
混淆，同名异物现象较为严重。茅莓又称蛇泡簕，而
悬钩子属植物习惯以藨、悬钩子命名，《岭南采药
录》所载蛇泡簕的别名为虎掌、山象皮，在广东、广
西等地民间有大叶蛇泡簕被当做蛇泡簕使用的情
况［4-5］，所以造成了与同属的大叶蛇泡簕(粗叶悬钩
子)混淆。目前市场上常见的混伪品包括同属的大
叶蛇泡簕(Ｒ. alceaefolius Poir. )、白花悬钩子(Ｒ.
leucanthus Hance)、山莓(Ｒ. corchorifolius L. f. )、锈
毛莓(Ｒ. reflexus Ker. )、插田泡(Ｒ. coreanus Miq. )、
蔷薇莓(Ｒ. rosaefolius Smith)，同科的珍珠梅［Sor-
baria sorbifolia (L. )A. Br. ］、中甸蔷薇(Ｒosa zhong-
dianensis)、月季(Ｒosa chinensis Jacq. )等［4］，以及菊
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科植物大蓟(Cirsium japonicum Fisch. ex DC)。由
于同科属的植物形态以及药材特征相似，而依靠传
统的性状、显微和理化鉴别不能很好地区分，不利于
药材流通管理规范化以及用药安全，需要寻找一种
快速、准确的分子鉴定方法，以确保临床用药安全。
DNA条形码已成为全球生物分类学的研究热
点和方向［6-8］。陈士林等［9-12］以药用植物及其密切
相关的物种为研究对象，分析比较核基因序列、叶绿
体基因组序列及线粒体在药用植物中的变异率，结
果表明，ITS2 表现突出，鉴定效率较高，适用于中药
材等存在降解的材料，明显优于 rbcL 和 matK 联合
条形码，得到国际 DNA条形码领域的广泛关注和认
可。基于大样本量中药材 DNA 条形码鉴定研
究［13-16］，陈士林等［17］创建中药材 DNA 条形码分子
鉴定体系(http:/ /www. tcmbarcode. cn /china /)，为
中草药建立“基因身份证”，利用二维码图片与 DNA
条形码数据库结合使用，在基因水平解决中药材与
混伪品的物种识别问题。这对于传统医药走向国际
化起到巨大的推动作用，是中药鉴定方法学的一个
创新。本实验采用 ITS2 序列对茅莓根及其主要混
伪品进行 DNA条形码鉴定研究，为确保药材质量及
临床用药安全提供参考。
1 材料来源
本实验通过实地采集、药材市场购买等方式收
集茅莓及其混伪品共 11 个物种 79 份样本，其中基
原植物样本共 56 份，分别采自北京市、山东烟台市、
湖北神农架和广东广州市、中山市、肇庆市、佛山市;
药材样本共 23 份，分别购自安徽亳州药市、河北安
国药市、广东清平药市、广西玉林药市、福建尤溪县。
实验材料经中国中医科学院药用植物研究所林余霖
教授鉴定，凭证标本保存于中国中医科学院中药研
究所。本实验所用 ITS2 序列共 81 条，其中 79 条序
列为实验所得，另从 GenBank 下载 2 条序列
(GenBank登录号:JF421539，GQ434478)，样本信息
见表 1。
2 实验方法
2. 1 样品 DNA提取、PCＲ扩增和测序
用体积分数 75%乙醇擦拭药材及原植物表面，
刮去外表皮取其中间部分，取药材样本 30 ～ 50 mg，
用高通量组织球磨仪 45 Hz频率研磨 120 s后，核分
离液洗涤 3 次(800 μL·次 － 1)，去除上清液，留沉
淀，再采用植物基因组 DNA 提取试剂盒(Tiangen
Biotech公司，China)提取 DNA。ITS2 序列扩增正向
表 1 茅莓根及其混伪品的样本信息
Tab. 1 Sample information of Ｒ. parvifolius and its adulterants
Latin name Sample number Voucher no. GenBank No. Locality(in Chinese)
Ｒ. parvifolius 7 YC0809MT14 －18 KP241755-59 Guangzhou，Guangdong(广东广州市)
YC0809MT19 KP241760 Zhaoqing，Guangdong(广东肇庆市)
YC0809MT20 KP241761 Yantai，Shandong(山东烟台市)
Ｒ. alceaefolius 10 YC0810MT01 －04 KP241711-14 Guangzhou，Guangdong(广东广州市)
YC0810MT05 －06 KP241715-16 Zhaoqing，Guangdong(广东肇庆市)
YC0810MT09 －12 KP241719-22 Zhongshan，Guangdong(广东中山市)
Ｒ. corchorifolius 14 YC0811MT01 KP241723 Foshan，Guangdong(广东佛山市)
YC0811MT02 －07 KP241724-29 Zhongshan，Guangdong(广东中山市)
YC0811MT08 －11 KP241730-33 Zhaoqing，Guangdong(广东肇庆市)
YC0811MT12 －14 KP241734-36 Guangzhou，Guangdong(广东广州市)
Ｒ. reflexus 11 YC0812MT01-02 KP241762-63 Zhongshan，Guangdong(广东中山市)
YC0812MT03 －04 KP241764-65 Zhaoqing，Guangdong(广东肇庆市)
YC0812MT05 －11 KP241766-72 Guangzhou，Guangdong(广东广州市)
Ｒ. rosaefolius 3 YC0813MT01 －03 KP241772-75 Guangzhou，Guangdong(广东广州市)
Ｒ. leucanthus 2 YC0814MT01 －02 KP241740-41 Zhaoqing，Guangdong(广东肇庆市)
Ｒ. coreanus 3 YC0815MT01 －03 KP241737-39 Shenlongjia，Hubei(湖北神农架)
Sorbaria sorbifolia 4 YC0816MT01 －02 KP241697-98 Beijing Botanical Garden(北京植物园)
YC0816MT03 －04 KP241699-700 Beijing (北京市)
Ｒosa zhongdianensis 2 YC0817MT01 －02 KP241709-10 Beijing Botanical Garden(北京植物园)
Ｒosa chinensis 1 － JF421538 GenBank
Cirsium japonicum 1 － GQ434478 GenBank
Ｒubi Parvifolii Ｒadix 5 YC0809MT01 －05 KP241742-46 Guangxi Yulin medicinal materialsmarket(广西玉林药市)
4 YC0809MT06 －09 KP241747-50 Guangdong Qingping medicine market(广东清平药市)
4 YC0809MT10 －13 KP241751-54 Youxi，Fujian(福建尤溪县)
2 YC0810MT07 －08 KP241717-18 Guangdong Qingping medicine market(广东清平药市)
4 YC0266MT15 －18 KP241705-08 Hebei Anguo medicine market(河北安国药市)
4 YC0432MT09 －12 KP241701-04 Anhui Bozhou medicinal materials market(安徽亳州药市)
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引物 ITS2F:5-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3 和
ITS3Ｒ:5-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3。反 应
体系:2 × Taq PCＲ MasterMix 12. 5 μL，正反向引物
(2. 5 μmol·L －1)各 1. 0 μL，模板 DNA 1. 0 ～ 3. 0
μL，其余用 ddH2O 补至 25 μL。PCＲ 扩增条件:94
℃变性 5 min，再进行 40 个循环(94 ℃变性 30 s，56
℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s)，72 ℃延伸 10 min［17］。
PCＲ扩增产物经 1%琼脂糖电泳检测并纯化后，使
用 ABI 3730XL 测序仪(Applied Biosystems 公司，
USA)进行双向测序。
2. 2 数据处理
测序 峰 图 用 Condon Code Aligner V3. 7. 1
(Codon Code 公司，USA)进行质量分析和校对拼
接，去除低质量区，将所得序列采用基于隐马尔
科夫模型 HMMer注释方法去除所得序列的 5. 8S
端和 28S 端，从而获得 ITS2 间隔区序列，将所有
ITS2 序列用 MAGA5. 1 进行序列比对分析，并基
于 K2P(Kimura 2-Parameter)模型对种内及种间
遗传距离进行分析，用邻接(Neighbor Joining，
NJ)法构建系统聚类树，采用 bootstrap 重复 1 000
次进行检验。
3 结果与分析
3. 1 DNA提取及 PCＲ扩增
本实验采用核分离液进行洗涤，能除去次生代
谢产物多糖、多酚，提高 DNA 纯度，11 个物种 79 份
样本均能成功提取 DNA。通用引物 ITS2F /3Ｒ对 11
种基原植物及药材样本的 PCＲ 扩增效率为 100%，
PCＲ产物电泳呈清晰明亮的单一条带。双向测序
峰图质量较好，测序成功率为 100%，经注释拼接后
能得到高质量的 ITS2 序列。
3. 2 种内序列分析
本实验共涉及 ITS2 序列 81 条，分析其 ITS2 序
列长度、GC 含量及种内变异位点，见表 2。茅莓共
20 条序列，其基原植物样本分别采自山东烟台市，
广东广州市、肇庆市，药材样本分别来自广西玉林药
市、福建尤溪县、广东清平药市。基于 K2P 模型计
算遗传距离，结果表明，茅莓根 ITS2 序列种内的
平均遗传距离为 0. 002，种内最大遗传距离为
0. 014。ITS2 序列比对后长度为 212 bp，平均 GC
含量为 57. 42%，种内存在 3 个变异位点，分别为
66 位点 T-C 变异，118 位点 A-C 变异，以及 177
位点 A-G 变异，存在一处插入 /缺失，为 11 位点，
分为 4 种单倍型。其中 H1 单倍型样本 9 个，H2
单倍型样本 8 个，H3 单倍型样本 2 个，H4 单倍
型样本 1 个。
粗叶悬钩子与锈毛莓比对后序列长度均为 212
bp，其平均 GC 含量分别为 56. 81%、57. 27%，两者
种内暂未发现变异;山莓比对后序列长度为 212 bp，
平均 GC含量为 56. 57%，种内存在一处变异，为 38
位点的 A /C 变异;月季 5 条序列，比对后序列长度
为 212 bp，平均 GC 含量为 57. 55%，种内存在 2 处
变异，为 24、150 位点的 T /C变异;珍珠梅 4 条序列，
比对后长度为 223 bp，平均 GC 含量为 69. 89%，种
内存在 3 处变异，为 184 位点的 A /G 变异，在 19、
171 位点存在简并碱基。白花悬钩子、插田泡、蔷薇
莓、中甸蔷薇以及大蓟序列长度分别为 211、211、
210、212、228 bp，种内暂未发现变异。
3. 3 茅莓与其混伪品的种间变异分析
11 个物种的 ITS2 序列长度在 210 ～ 228 bp，比
对后序列长度为 237 bp。茅莓与其混伪品种间 K2P
距离为 0. 005 ～ 0. 505，平均遗传距离为 0. 092。分
析茅莓与混伪品的种间距离，结果显示，茅莓与粗叶
悬钩子、山莓、锈毛莓、蔷薇莓、白花悬钩子、月季、珍
珠梅、中甸蔷薇、插田泡、大蓟的种间最小遗传距离
分别为 0. 024，0. 024，0. 019，0. 093，0. 076，0. 151，
0. 260，0. 140，0. 005，0. 471，除插田泡外，茅莓与其
混伪品间的最大种内距离小于最小种间距离。粗叶
悬钩子、锈毛莓、插田泡、蔷薇莓、中甸蔷薇和大蓟的
种内 K2P 距离为 0，均小于与其他物种的最小种间
距离。
3. 4 茅莓与其混伪品的 NJ树鉴定
基于茅莓及其混伪品的 81 条 ITS2 序列，以邻
接(NJ)法构建系统聚类树(图 1)。20 条茅莓 ITS2
序列独自聚为一支，表现出良好的单系性，与其混伪
品能够很好的区分。同时，混伪品之间也都能各自
单独聚为一支，单系性良好，能够很好的与茅莓区分
开。结果表明，基于 NJ树能够准确鉴定茅莓及其混
伪品。
3. 5 茅莓根药材的鉴别
从河北安国、安徽亳州、广西玉林、广东清平药
市以及从福建尤溪县购买的茅莓根药材共计 23 份，
提取药材总 DNA，ITS2 序列扩增成功率为 100%，获
得 23 条 ITS2 序列。在中药材 DNA 条形码鉴定系
统(http:/ /www． tcmbarcode． cn /china /)和 NCBI数
据库上 BLAST 搜索。结果表明，13 份样品的 ITS2
序列与茅莓的序列相似度最高(≥99%);来自河北
安国药材市场的 4 份样品，与月季的序列相似度最
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表 2 ITS2 序列特征及遗传距离分析
Tab. 2 The characteristics of ITS2 of Ｒ. parvifolius and its adulterants
Latin name Sample No. Haplotype Length /bp G + CContent /% Intraspecific genetic distance(average) Interspecific genetic distance(average)
Ｒ. parvifolius 20 4 212 57. 42 0 － 0. 014(0. 002) 0. 005 － 0. 505(0. 092)
Ｒ. coreanus 3 1 211 57. 82 0 0. 005 － 0. 485(0. 070)
Ｒ. alceaefolius 12 1 213 56. 81 0 0. 005 － 0. 489(0. 083)
Ｒ. rosaefolius 3 1 210 53. 33 0 0. 076 － 0. 511(0. 134)
Ｒ. leucanthus 2 1 211 56. 40 0 0. 065 － 0. 466(0. 114)
Ｒ. corchorifolius 14 2 212 56. 57 0 － 0. 005(0. 001) 0. 009 － 0. 480(0. 085)
Ｒ. reflexus 11 1 213 57. 28 0 0. 005 － 0. 479(0. 075)
Ｒosa chinensis 5 2 212 57. 55 0 － 0. 010(0. 005) 0. 009 － 0. 438(0. 183)
Sorbaria sorbifolia 4 3 223 69. 89 0 － 0. 005(0. 002) 0. 271 － 0. 467(0. 308)
Ｒosa zhongdianensis 2 1 212 58. 02 0 0. 009 － 0. 428(0. 167)
Cirsium japonicum 5 1 228 62. 28 0 0. 419 － 0. 511(0. 478)
图 1 基于 ITS2 序列构建茅莓及其混伪品的 NJ树
注:Bootsrap 1000 次重复，仅显示支持率≥50%的分支;* －茅莓根药材
Fig. 1 NJ Tree base on ITS2 sequence from Ｒubi Parvifolii Ｒadix and its adulterants
Note:The bootstrap scores (1 000 replicates)are shown (≥50%)for each branch;* － Ｒ. parvifolius medical materials
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中国药学杂志 2015 年 9 月第 50 卷第 17 期 Chin Pharm J，2015 September，Vol. 50 No. 17
高，为 100%;来自安徽亳州药材市场的 4 份样品，
与大蓟的序列相似度最高，为 100%;来自广东清平
药材市场的 2 份样品 ITS2 序列与粗叶悬钩子的序
列相似度为 100%。
基于 ITS2 序列构建 NJ 树，13 份茅莓根药材
样品 ITS2 序列与基原物种聚为一支;来自广东清
平药材市场的 2 份药材样品 ITS2 序列与粗叶悬
钩子基原物种聚为一支;来自河北安国药材市场
的 4 份样品 ITS2 序列与从 GenBank 下载的月季
的 ITS2 序列聚为一支;来自安徽亳州药材市场的
4 份药材样品 ITS2 序列从 GenBank 下载大蓟的
ITS2 序列聚为一支。因此，NJ 树鉴定结果与
BLAST 鉴定结果一致，均能准确鉴定茅梅根及其
混伪品。
4 讨 论
4. 1 应用 DNA条形码鉴定茅莓根药材及其混伪品
的可行性
茅莓根作为岭南地区地方药材被广泛应用于中
医临床，特别是近年来的研究发现其在治疗“广东
瘤”———鼻咽癌方面有显著的药理活性，临床上常
作为主药结合其他药材用于鼻咽癌的治疗［2］。由
于茅莓根在岭南地区常以“蛇泡簕”、“三月泡”、“薅
田藨”、“插田泡”等为名入药。同时，悬钩子属的其
他物种在形态以及名称上存在混淆的情况，造成了
市场上同属物种误用和混用。rDNA的 ITS2 序列长
度相对较短，对于生药饮片、粉末、标本、长期贮藏的
中药材及样品 DNA 已部分降解的材料，ITS2 表现
出较高的 PCＲ扩增和测序效率［18-19］，其准确性和稳
定性已经在多个科属基原植物及药材的实验中得到
了验证，已成为药用植物 DNA 条形码序列。药材
DNA提取是开展中药材 DNA 条形码研究的首要前
提［20］，本实验收集的样品包括基原植物样本和药
材。由于中药材以及植物叶片含有大量的次生代谢
产物，因此在提取药材 DNA时需要对其进行核分离
液洗涤处理，每次加入 800 μL 核分离液，充分混匀
洗涤 2 min，弃上清液，重复 3 ～ 4 次，直至上清液颜
色变浅，再用试剂盒提取总 DNA。经核分离液洗涤
后，样品 DNA纯度提高，PCＲ 扩增效率和测序成功
率可大大提高。
4. 2 茅莓根药材 DNA 条形码鉴定的稳定性与准
确性
DNA条形码技术为对中药材进行有效鉴定的
新技术，发展迅速，该方法的准确性和稳定性优势备
受关注，特别是应用该技术对市场药材鉴定的准确
性方面［15，21-23］。本实验将经专家鉴定的基原物种
样本作为标准，同时收集不同产地的茅莓根药材样
本，用 ITS2 作为 DNA 条形码对茅莓根及其混伪品
进行鉴定研究。本实验中不同产地、不同批次的茅
莓及其混伪品的 DNA 提取效率为 100%，PCＲ 扩增
结果显示，所有的 ITS2 序列均可稳定获得。种内变
异分析表明，茅莓 ITS2 序列种内变异较小，其 K2P
平均距离为 0. 002，粗叶悬钩子、锈毛莓、山莓等的
种内变异较小。上述结果表明，ITS2 序列用于茅莓
根药材具有较好的稳定性。应用 K2P 遗传距离法
对序列进行计算分析，数据显示，除插田泡外，茅莓
ITS2 序列种内最大遗传距离均小于其他混伪品的
种间最小 K2P 距离。基于 NJ 法构建系统聚类树，
茅莓与插田泡聚为一大支，并且又各自聚为一小支，
锈毛莓与粗叶悬钩子聚为一大支，然后锈毛莓又独
自聚为一小支，说明茅莓与插田泡的亲缘关系较为
密切，而锈毛莓与粗叶悬钩子亲缘关系较为密切，茅
莓与粗叶悬钩子的亲缘关系则相对较远。同时，其
他混伪品之间也都能各自单独聚为一支，单系性良
好，能很好地与茅莓区分开。遗传距离和进化树的
分析结果表明，ITS2 序列能够准确的区分茅莓根药
材及其混伪品。
此外，本实验中从河北安国药市、安徽亳州药市
收集的 3 批共 10 份茅莓根样品经 ITS2 序列鉴定，
结果鉴定为粗叶悬钩子、月季以及大蓟。药材市场
上存在以粗叶悬钩子、月季、蓟以及同属的其他植物
混伪的情况，这些药材性味功效以及临床应用均不
同，严重影响了茅莓根的用药安全。
本实验利用 ITS2 序列对茅莓根及其混伪品进
行了准确的鉴定，为茅莓根药材的有效鉴定提供了
分子生物学依据。再次证明了 ITS2 条形码技术在
药用植物中具有良好的鉴定能力，同时为悬钩子属
类药用植物的鉴定提供新的方法和依据，对于保障
茅莓根及同属的中药用药安全具有重要意义。
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(收稿日期:2015-03-13)
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中国药学杂志 2015 年 9 月第 50 卷第 17 期 Chin Pharm J，2015 September，Vol. 50 No. 17