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内部沸腾法提取箬叶总黄酮的研究
乐 薇，李 刚
(武汉工商学院 环境与生物工程学院，湖北武汉 430065)
收稿日期:2015－06－18
作者简介:乐薇(1979－) ，女，硕士，副教授，研究方向:生物分析:E－mail:yuewei11@ 126.com。
基金项目:湖北省自然科学基金资助项目(2013C111)。
摘 要:目的:确定内部沸腾法提取箬叶总黄酮的优化工艺。方法:以黄酮得率为指标，分别在解吸过程和提取过程的
单因素实验基础上，进行正交实验，考察内部沸腾法提取箬叶总黄酮含量的最佳条件，并与回流法、超声波法、微波法
进行了比较。结果:内部沸腾法提取箬叶总黄酮最佳条件是在固液比 1∶ 3的 90%乙醇溶液中解吸 25 min 后，在 85 ℃
下，在固液比为 1∶ 30 的 30%乙醇溶液中提取 5 min，箬叶总黄酮的得率达到 2.05%，异荭草苷含量为 1.656 mg·g －1，荭
草苷含量为 0.454 mg·g －1，与回流法、超声波法和微波法相比，黄酮得率差异不显著(p ＞ 0.05) ，但乙醇用量少，成本低。
关键词:内部沸腾法，总黄酮，箬叶
Extraction of total flavonoids from leaves of
Indocalamus using inner ebullition method
YUE Wei，LI Gang
(Wuhan Technoligy and Business University，Wuhan 430065，China)
Abstract:Objective:To explore the optimum extraction process of total flavonoids from leaves of Indocalamus by
inner ebullition method.Methods:Through single － factor experiments of desorption /extraction process and the
orthogonal experiments，the optimal extract conditions of the total flavonoids from leaves of Indocalamus by using
inner ebullition method was studied.The method was also compared with reflux method，ultrasonic method and
microwave method.Ｒesults:The optimal desorption conditions were as follows:solid－ liquid ratio was 1∶ 3，ethanol
concentration was 90%，the resolution time was 25 min.The optimal extraction conditions were:solid － liquid ratio
was 1∶ 30，the temperature was 85 ℃，ethanol concentration was 30%，the extraction time was 5 min .The yield of
total flavonoids was 2.05%，the content of isoorientin and orientin was 1.656，0.454 mg·g － 1 .Comparing with reflux
method，ultrasonic method and microwave method，the inner ebullition method had no significant difference of yield
of flavonoids，but lesser amount of ethanol and cheaper cost.
Key words:inner ebullition;total flavonoids;Indocalamus
中图分类号:TS201.1 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2016)05－0263－06
doi:10． 13386 / j． issn1002 － 0306． 2016． 05． 043
箬叶为禾本科竹亚科箬竹属植物叶的总称。该
属植物约为 20 种以上，均产至我国，主要分布于长
江以南各省区，自古以来就是端午节标志食品－粽子
的包装物［1］。据我国医书记载，箬叶味甘，性寒，有清
热止血、解毒消肿之功效。箬叶中含有黄酮类、活性
多糖、特种氨基酸和肽类、微量元素、维生素、挥发油
等多种功能性成分，杀菌、防腐、抗癌等多种功能作
用显著，可广泛应用于医药、食品及日化用品等［2－9］。
作为箬叶中重要的抗菌活性成分之一，箬叶总黄酮
已经逐渐引起研究者的重视［10－12］，但关于总黄酮的提
取方法报道不多，已有报道采用的是常规的回流
法［13］，但该法提取时间长，能量消耗大，溶剂量大。
内部沸腾法是一种新型的提取分离技术，该法首先
用少量低沸点溶剂浸润物料，使被提取组分得到充
分浸润，然后加入另外一种高于浸泡物料溶剂沸点
的提取剂，让渗入物料内部的溶剂来不及扩散就沸
腾，从而将被提取组分大量的挟带至提取溶剂中，可
大大缩短提取时间，强化了提取过程［14－16］。目前内部
沸腾法已在丹参［17］、三七皂苷［18］、香菇多糖［19］、绞股
蓝总黄酮［20］等的提取中取得了较好的效果。本文拟
采用内部沸腾法对箬叶总黄酮进行强化提取，旨在
为箬叶的开发应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
箬叶 湖北武陵山区，洗净后于烘箱中 40 ℃干
燥 6 h，于粉碎机中粉碎，过 16 目筛，于样品袋中冷
藏保存。
氢氧化钠 天津市凯通化学试剂有限公司;
95%无水乙醇 天津市北联精细化学品开发有限公
264
司;亚硝酸钠 洛阳市化学试剂厂;硝酸铝 天津市
天力化学试剂有限公司;冰乙酸 天津市科密欧化
学试剂有限公司;以上试剂均为分析纯;乙腈 色谱
纯、天津市化学试剂三厂;甲醇 色谱纯、天津市科
密欧化学试剂有限公司;荭草苷、异荭草苷、芦丁 标
准品 南京春秋生物工程有限公司。
722E型可见分光光度计 上海光谱仪器有限公
司;KQ3200E超声波发生器 昆山市超声仪器有限
公司;LC－1000 型高效液相色谱仪 山东鲁南瑞虹
化工仪器有限公司;ＲE52CS旋转蒸发器 上海亚荣
生化仪器厂;FD－1A－50 冷冻干燥机 北京博医康实
验仪器有限公司。
1.2 箬叶黄酮含量的测定
1.2.1 光度法测定总黄酮含量 标准曲线的绘制:
准确称取芦丁标准品 15 mg 溶于 30%乙醇中，并定
容至 100 mL。用移液管分别取 0、0.5、1.0、2.0、3.0、
4.0 mL于 10 mL容量瓶中，加入 5%亚硝酸钠 0.3 mL，
使其混匀，放置 6 min 后加入 10%硝酸铝 0.3 mL。摇
匀静置 6 min后加入 4 mL 4%氢氧化钠，以 30%乙醇
定容至刻度，摇匀静置 10 min后在波长 510 nm处测
吸光度，参比为不加芦丁标准品的溶液。以测定的
吸光度 A为纵坐标，芦丁标准品浓度 c 为横坐标，绘
制标准曲线。箬叶提取液中黄酮含量的测定:准确
移取 1.00 mL黄酮提取液于 10 mL容量瓶中，按标准
曲线的绘制方法加入各种试剂，以不加黄酮提取液
的溶液为参比，在波长 510 nm 处测定吸光度，并按
式(1)计算总黄酮得率:
总黄酮得率(%)= cVn
m × 106
× 100 (式 1)
式中:c 为总黄酮的浓度(μg·mL －1) ;m 为箬叶
粉末的质量(g) ;V 为溶液的体积(mL) ;n 为稀释
倍数。
1.2.2 HPLC测定提取液中黄酮碳苷的含量 制备
标准溶液:准确称取异荭草苷、荭草苷各 10 mg 分别
于 50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，用超
声震荡辅助对照品溶解。制成浓度为 200 μg·mL －1
的混合对照品溶液;HPLC 检测条件:C18 色谱柱
(150 mm ×4.6 mm) ;流动相:乙腈 /水(14 /86，v /v) ，
水中含有 0.5%的乙酸;流速:0.8 mL·min －1;检测波
长 360 nm［21－23］。
1.3 内部沸腾法提取箬叶总黄酮
准确称取 1.0 g箬叶粉末后，采用单因素及正交
实验进行内部沸腾法提取箬叶总黄酮，测定各提取
液中总黄酮的含量，并计算出对应的得率，具体步骤
如下:
1.3.1 解吸过程的单因素实验 采取少量乙醇润湿
箬叶粉末一段时间，以使箬叶黄酮能被解吸。乙醇
浓度的影响:取 3 mL一定浓度乙醇溶液解吸 20 min
后，在 85 ℃下用 25 mL的 30%乙醇溶液提取 5 min，
共进行两次;解吸时间的影响:取 3 mL 的 80%乙醇
溶液解吸一定时间后，在 85 ℃下用 25 mL的 30%乙
醇溶液进行提取 5 min，共进行两次;解吸剂用量的
影响:取一定体积的 80%乙醇溶液解吸 20 min后，在
85 ℃下用 25 mL的 30%乙醇溶液提取 5 min，共进行
两次。
1.3.2 解吸过程的正交实验 准确称取 1.0 g箬叶粉
末，按表 1 进行解吸过程的正交实验，然后在 85 ℃下
用 25 mL 30%乙醇溶液提取 5 min，共提取两次，以
箬叶总黄酮的得率为指标进行考察。
表 1 解吸过程的正交实验因素水平表
Table 1 The factors and levels of orthogonal test
for desorption process
水平
解吸剂浓度
(%)
解吸剂用量
(mL)
解吸时间
(min)
1 70 2 15
2 80 3 20
3 90 4 25
1.3.3 提取过程的单因素实验 乙醇浓度的影响:
取 3 mL 90%乙醇溶液解吸 20 min 后，在 85 ℃下用
25 mL的一定浓度乙醇溶液提取 5 min，共进行两次;
提取温度的影响:取 3 mL 90%乙醇溶液解吸 20 min
后，在不同温度下用 25 mL的 30%乙醇溶液进行提
取 5 min，共进行两次;提取剂用量:取 3 mL 90%乙
醇溶液解吸 20 min 后，在 85 ℃下用不同体积的
30%乙醇溶液进行提取 5 min，共进行两次;提取时
间的影响:取 3 mL 90%乙醇溶液解吸 20 min后，在
85 ℃下用 25 mL 30%乙醇溶液提取 5 min，共进行
两次。
1.3.4 提取过程的正交实验 准确称取 1.0 g箬叶粉
末，取 3 mL 90%乙醇溶液解吸 20 min 后，按照表 2
进行提取过程的正交实验，共提取两次，以箬叶总黄
酮的得率为指标进行考察。
表 2 提取过程的正交实验因素水平表
Table 2 The factors and levels of
orthogonal test for extraction process
水平
提取剂浓度
(%)
提取温度
(℃)
提取时间
(min)
提取剂用量
(mL)
1 25 80 3 20
2 30 85 5 25
3 35 90 7 30
1.3.5 其他方法提取箬叶总黄酮 选取了前期实验
已经优化的箬叶黄酮提取工艺条件分别对箬叶总黄
酮进行提取，并测定提取液中的总黄酮含量及异荭
草苷、异牡荆苷的含量。超声波法提取箬叶总黄酮:
按固液比为 1∶ 25 加入 60%的乙醇溶液，在 150 W的
超声波清洗机超声提取 35 min，共提取两次;回流法
提取箬叶总黄酮:按固液比1∶ 20加入85%的乙醇回流
50 min，共提取两次;微波法提取箬叶总黄酮:按固液
比 1∶ 20加入 80%的乙醇，700 W微波提取 2 min，共提
取两次。
1.4 数据统计分析
用 Microsoft Excel 软件进行数据的统计分析，结
果以平均值 ±标准误差(M ± SE)表示，采用 Origin
软件进行做图。
265
2 结果与讨论
2.1 光度法测定箬叶黄酮含量的标准曲线及回归
方程
按 1.2.1 操作，绘制标准曲线如图 1 所示，得到回
归方程为 A =0.0105c + 0.0017，Ｒ2 = 0.9998。
图 1 标准曲线
Fig.1 The standard curve of rutin
2.2 内部沸腾法解吸过程的单因素实验
2.2.1 解吸剂浓度对箬叶总黄酮得率的影响 解吸
剂浓度对箬叶总黄酮得率的影响如图 2 所示。可
知，解吸剂体积分数在 50% ～80%间，箬叶总黄酮得
率随乙醇体积分数的升高而增大，当乙醇体积分数
大于 80%后，得率随乙醇体积分数的升高而减小。
原因可能是乙醇的体积分数不同，渗透进入箬叶细
胞内部的能力也不同，解吸黄酮的效果也有差别。
在一定乙醇浓度范围内，解吸黄酮的能力随乙醇的
体积分数增大而增大，但是当乙醇浓度增大到一定
程度时，乙醇的渗透能力下降，反而导致黄酮浸出受
影响。所以解吸剂最佳体积分数约 80%。
图 2 解吸剂浓度对总黄酮得率的影响
Fig.2 The effect of desorption agent’s concentration
on the yield of flavonoids
2.2.2 解吸时间对箬叶总黄酮得率的影响 解吸时
间对箬叶总黄酮得率的影响如图 3 所示。可知在
5～20 min间，箬叶黄酮得率随解吸时间的增大而增
大，20 min后箬叶总黄酮浸出量趋于稳定，说明此解
吸过程可能以普通的分子扩散过程为主。为节省时
间，解吸时间选择为 20 min。
2.2.3 解吸剂用量对箬叶总黄酮得率的影响 由图
4 可知解吸剂用量少时，箬叶总黄酮的渗透及解吸不
充分，但进一步增大用量时，箬叶黄酮与解吸剂接触
表面积增大，可充分解吸，用量为 3 mL 时趋于稳定，
此后再增加解吸剂用量，黄酮得率基本不变。因此
选择 3 mL乙醇溶液解吸。
图 3 解吸时间对总黄酮得率的影响
Fig.3 The effect of desorption time
on the yield of flavonoids
图 4 解吸剂用量对总黄酮得率的影响
Fig.4 The effect of desorption agent’volume
on the yield of flavonoids
2.3 解吸过程的正交实验
2.3.1 正交实验结果 在单因素实验的基础上，进
行了正交实验，结果见表 3 和表 4。
表 3 箬叶中提取总黄酮中解吸过程正交实验结果
Table 3 The results of orthogonal test for desorption process
实验号
解吸因素
解吸剂
浓度
(%)
解吸剂
用量
(mL)
解吸时间
(min) 空白
得率
(%)
1 1 1 1 1 1.70
2 1 2 2 2 1.72
3 1 3 3 3 1.73
4 2 1 2 3 1.90
5 2 2 3 1 2.04
6 2 3 1 2 1.85
7 3 1 3 2 2.02
8 3 2 1 3 2.00
9 3 3 2 1 2.05
K1 5.15 5.62 5.55 5.91
K2 5.79 5.76 5.67 5.59
K3 6.07 5.63 5.79 5.63
Ｒ 0.31 0.047 0.08 0.067
可知箬叶总黄酮得率受解吸剂浓度影响程度达
到显著水平，对黄酮得率的极差分析可知影响能力
大小顺序为:解吸剂浓度 ＞解吸时间 ＞解吸剂用量。
由正交实验可得解吸阶段最佳工艺水平是 3 mL 的
266
90%的乙醇解吸 25 min。
表 4 解吸过程正交结果方差分析
Table 4 The analysis of variance for desorption process
方差来源
解吸剂
浓度
解吸剂
用量
解吸
时间
误差 E 总和 T
离差平方和 0.15 0.004 0.01 0.01 0.17
自由度 2.00 2.00 2.00 2.00 8.00
F值 21.14 0.57 1.43
F0. 05(2，2)= 19 F0. 01(2，2)= 99
2.3.2 验证实验 在解吸最佳条件下，重复 3 次，实
验结果见表 5，可知，实验的重复性较好。
表 5 解吸过程的重复性实验结果
Table 5 The results of repetivite experiment
for desorption process
序号 1 2 3 平均值 ＲSD
总黄酮得率
(%)
1.98 2.09 2.05 2.04 2.73%
2.4 内部沸腾法提取过程的单因素实验
2.4.1 提取剂浓度对箬叶总黄酮得率的影响 由图
5 可知，随着提取剂乙醇浓度的提高，总黄酮得率呈
现先升高后下降的趋势，在 30%时黄酮得率最高。
这可能是增大乙醇浓度时，一方面使提取过程中黄
酮溶解速度加快，但同时也使乙醇溶液汽化挥发加
快，沸腾持续过程短，降低了黄酮在箬叶中的传质效
果。因此选取提取剂的最适浓度是 30%。
图 5 提取剂浓度对总黄酮得率的影响
Fig.5 The effect of extrction agent’s concentration
on the yield of flavonoids
2.4.2 提取温度对箬叶总黄酮得率的影响 由图 6
可知，当温度范围处于 75～85 ℃之间时，黄酮浸出效
果随温度的增大而增强，温度大于 85 ℃后，黄酮浸
出量反而减小。温度低于 85 ℃时，黄酮成分在提取
溶液中扩散较慢，溶解不完全，提取效果较差，随着
温度的增大，乙醇沸腾越来越剧烈。当沸腾速度超
过一定速度时，由于乙醇挥发较快，对流传质持续的
过程不长，同样造成箬叶中黄酮浸提不完全。因此
选择提取的最佳温度是 85 ℃。
2.4.3 提取剂用量对箬叶总黄酮得率的影响 由图
7 可知，提取剂用量低于 25 mL时，黄酮浸出不充分，
随着提取剂的增加，黄酮得率提高，在 25 mL 时基本
达到最大浸出，此时箬叶中黄酮成分基本浸出，继续
增加提取剂用量而黄酮不再增加，即 25 mL 为最合
适的提取剂用量。
图 6 提取温度对总黄酮浸出量的影响
Fig.6 The effect of extraction temperature
on the yield of flavonoids
图 7 提取剂用量对总黄酮浸出量的影响
Fig.7 The effect of extraction agent’volume
on the yield of flavonoids
2.4.4 提取时间对箬叶总黄酮得率的影响 由图 8
可知，在 1～5 min间，随着提取时间的增长，箬叶中提
取的黄酮得率越来越高，5～9 min 间，黄酮提取量趋
于稳定而不再增加，内部沸腾法提取黄酮效率较高，
在 5 min完成浸提，继续浸提没有更多黄酮浸出。所
以提取过程选择 5 min。
图 8 提取时间对总黄酮浸出量的影响
Fig.8 The effect of extraction time on the yield of flavonoids
2.5 提取过程的正交实验
内部沸腾法提取过程的正交实验结果见表 6 和
表 7。可知箬叶总黄酮的提取过程中，四种因素对黄
酮得率均未达到显著影响，影响能力大小顺序是提
取剂用量 ＞提取剂浓度 ＞提取温度 ＞提取时间。根
据正交实验可知内部沸腾法的提取阶段最佳工艺为
30 mL的 30%的乙醇溶液在 90 ℃下提取 7 min，但由
于提取时间和提取温度对箬叶黄酮的得率影响较
小，从生产成本考虑，可进一步优化提取工艺为
30 mL的 30%的乙醇溶液在 85 ℃下提取 5 min。
267
表 7 提取过程正交结果方差分析
Table 7 The analysis of variance for extraction process
方差来源 提取剂浓度 提取温度 提取时间 提取剂用量 误差 E 总和 T
偏差平方和 0.051 0.018 0.016 0.097 0.02 0.18
自由度 2 2 2 2 2.00 8.00
F值 3.19 1.13 1.00 6.06
F0. 05(2，2)= 19 F0. 01(2，2)= 99
表 6 箬叶中总黄酮提取过程正交实验结果
Table 6 The results of orthogonal test
for extraction process
实验号
提取剂
浓度
(%)
提取温度
(℃)
提取时间
(min)
提取剂
用量
(mL)
得率
(%)
1 1 1 1 1 1.58
2 1 2 2 2 1.77
3 1 3 3 3 1.97
4 2 1 2 3 2.04
5 2 2 3 1 1.81
6 2 3 1 2 2.02
7 3 1 3 2 1.97
8 3 2 1 3 1.84
9 3 3 2 1 1.76
k1 1.77 1.86 1.81 1.72
k2 1.96 1.81 1.86 1.92
k3 1.86 1.92 1.92 1.95
Ｒ 0.18 0.11 0.10 0.23
2.6 内部沸腾法提取箬叶中总黄酮的重现性实验
在优化的解吸及提取条件下重复三次实验，结
果见表 8，说明优化工艺的稳定性良好。并将提取液
减压浓缩后冷冻干燥，得到浸膏，浸膏中黄酮含量
为 19%。
表 8 内部沸腾法提取箬叶总黄酮的重现性实验
Table 8 The results of repetivite experiment
for extraction process
序号 1 2 3 平均值 ＲSD
总黄酮得率
(%)
2.01 2.04 2.10 2.05 2.23%
2.7 内部沸腾法与其他提取箬叶总黄酮方法的比较
采用不同方法对箬叶总黄酮进行提取，结果如
表 9～表 10 所示。超声波法、微波法、回流法和内部
沸腾法等提取方法对箬叶黄酮得率不存在显著差异
(p ＞ 0.05)。在 4 种提取方法中，回流法能耗最高，微
波法所需时间最短。但内部沸腾法实验设备简单，
无需超声波法和微波法所需的特殊仪器，且消耗乙
醇量最少，单次提取时间仅比微波法多 3 min，尽管
比其他方法多了 25 min 的润湿时间(即解吸时间) ，
但此步过程不需加热，所以内部沸腾法成本更低。
3 结论
通过解吸过程和提取过程的单因素实验确定了
内部沸腾法提取箬叶总黄酮的最适条件。解吸过程最
佳条件为:解吸剂浓度 90%乙醇、解析时间 20 min、解
吸剂用量 3 mL·g －1。提取过程最佳条件为:提取剂
浓度 30%、提取时间 5 min、提取温度 85 ℃、提取剂
用量 30 mL·g －1。通过解吸过程的正交实验得到三
个因素的影响能力大小顺序为:解吸剂浓度 ＞解吸
时间 ＞解吸剂用量。提取过程的正交实验得到四个
因素的影响能力大小顺序为:提取剂用量 ＞提取剂
浓度 ＞提取温度 ＞提取时间。与超声波法、微波法
及回流法相比，内部沸腾法在黄酮得率上无显著差
异，但成本更低，可以用于箬叶总黄酮的提取。
表 9 提取方法对箬叶总黄酮含量的影响
Table 9 The effect of extraction methods
on the yield of flavonoids
提取方法
总黄酮得率(%)
重复 I 重复Ⅱ 重复Ⅲ 平均值
超声波法 1.98 2.22 2.1 2.10
微波法 2.03 2.19 2.17 2.13
回流法 2.3 2.38 2.24 2.31
内部沸腾法 2.01 2.04 2.10 2.05
表 10 多种方法提取箬叶总黄酮的比较
Table 10 The comparison of different methods
for extraction of flavonoids
提取方法
超声
波法
微波法 回流法
内部
沸腾法
润湿时间(min) － － － 25
单次提取时间(min) 35 2 50 5
单次乙醇用量(mL /g) 15 16 17 11.7
总黄酮得率(%) 2.10 2.13 2.31 2.05
异荭草苷得率(%) 0.258 0.104 0.175 0.166
荭草苷得率(%) 未测出 未测出 0.0520 0.0454
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性研究［J］.中国农学通报，2009，25(3) :45－48.
(下转第 272 页)
272
件为:超声功率为 225 W、超声处理时间为 40 min、液
料比 23.5∶ 1(mL/g) ，测得总多酚的得率为76.53 mg /g，
与回归方程所得预测值 77.55 mg /g 的误差为
1.31%。这表明该回归方程能够真实地反映各因素
对水溶性怀菊总多酚得率的影响，也表明响应面法
可用于该提取工艺的研究。
3 结论
响应面分析法可用于超声辅助水提怀菊中总多
酚的工艺条件研究，在单因素实验的基础上，采用中
心组合实验设计(CCD)对提取工艺进行优化，并利
用统计学方法对该模型进行了显著性检验，优化了
内在因素水平，探讨了各因素间的交互作用，并对实
验结果进行数学模拟和预测，从而以最经济的方式
高效、准确地得到优化条件。优化后的工艺条件为:
超声功率为 225 W，超声处理时间为 40 min，液料比
23.5∶ 1(mL /g)。在此工艺条件下，总多酚的得率为
76.53 mg /g。该实验结果能够为怀菊中水溶性多酚
提取工艺的进一步放大提供科学依据和理论参考，
具有一定的理论价值和实际应用前景。
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