全 文 ：［收稿日期］ 20120118(004)
［基金项目］ 江西省自然科学基金项目(2010GQY0010) ;江西省教育厅科技计划项目(GJJ11206)
［第一作者］ 李洪亮，硕士，讲师，主要从事药理学研究，Tel:18970786132，E-mail:zhonglishidatou@ 126． com
［通讯作者］ * 程齐来，硕士，副教授，主要从事中药学研究，Tel:18970786158，E-mail:cql_57@ 126． com
山绿茶中 Ilexgenin A对 HepG2 肿瘤细胞抑制作用的研究
李洪亮1，徐仙赟2，孙立波3，程齐来1 *
(1. 赣南医学院药学院，江西 赣州 341000;2. 赣南医学院基础医学院，江西 赣州 341000;
3. 青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 266001)
［摘要］ 目的:探讨 3β，19α -二羟基乌苏-12-烯-24，28-二羧酸(IA)对肝癌细胞株 HepG2 细胞周期、凋亡的影响及其作
用机制。方法:人肝癌细胞株 HepG2 以 IA 20，40，60，80 g·L －1作用不同的时间后，分别使用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT) ，
吖啶橙(AO)荧光染色法，免疫细胞化学 SP法，流式细胞术检测 HepG2 细胞的增殖抑制情况，细胞周期和凋亡的形态学变化，
以及细胞内凋亡相关蛋白 Bcl-2，Bax 表达的变化。结果:IA对 HepG2 细胞增殖有抑制作用，其作用随着药物浓度和作用时间
的增加而增强。IA作用 24 h后 HepG2 细胞周期的主要特点是大量细胞累积于 G1 期，进入 S 期的细胞减少，IA 能够诱导
HepG2 细胞凋亡，IA(40，60，80 g·L －1)经过 24 h作用后，细胞凋亡率分别为 7. 89%，8. 37%，9. 93%，AO染色观察到大量凋亡
细胞，凋亡细胞染色减弱、荧光较暗、呈均匀一致的圆状或固缩状，细胞内 Bcl-2 的表达随着药物浓度增加逐渐减少;Bax蛋白
的表达随着药物浓度增加逐渐增加。结论:IA能够抑制 HepG2 细胞的增殖，并使细胞大量累积于 G1 期，进入 S 期的细胞减
少，通过影响凋亡蛋白表达诱导细胞凋亡。
［关键词］ 3β，19α-二羟基乌苏-12-烯-24，28-二羧酸;HepG2 细胞;抑制作用;山绿茶;乌苏烷三萜
［中图分类号］ R287 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2012)15-0238-04
Experimental Study of the Inhibiting Effects of Ilexgenin
A from Ilex Hainanensis on Tumor Cell HepG2
LI Hong-liang1，XU Xian-yun2，SUN Li-bo3，CHEN Qi-lai1*
(1. School of Pharmacy，Gannan Medical College，Ganzhou 341000，China;
2. Medical College of Pharmacy of Gannan Medical University，Ganzhou 341000，China;
3. Qingdao University Affiliated Hospital，Qingdao 266001，China)
［Abstract］ Objective:To investigate the proliferation inhibition and apoptosis in human hepatic cancer
cell strain HepG2 by ilexgenin A and its mechanism． Method:HepG2 were treated by iexgenin A with different
concentration and time． MTT assay，around totally orange (AO)fluorescence staining method，flow cytometry
(FCM) ，SP method of immunocytechemistry were used to determine the inhibiting effect on HepG2 cells，the cell
cycle and apoptosis morphological changes and the expressions of Bcl-2，Bax． Result:Ilexgenin A inhibited the
proliferation of HepG2 cells in dosage and time dependent manner． After HepG2 cells were treated by ilexgenin A
for 24 hour，ilexgenin A induced a G1 cell cycle arrest and reduced the cell population in S phase and the apoptosis
rate were 7. 89%，8. 37%，9. 93%，respectively． With the increasing of the medicine density，the expression of
Bcl-2 was down- regulated，while the expression of Bax up-regulated in the apoptosis． Conclusion:Ilexgenin A
can inhibit proliferation of the HepG2 cells and induced a G1 cell cycle arrest and reduced the cell population in S
phase． It also can induce apoptosis of human prostatic carcinoma through down-regulating the expressions of Bcl-2，
up-regulating the expression of Bax．
·832·
第 18 卷第 15 期
2012 年 8 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 15
Aug．，2012
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2012.15.071
［Key words］ ilexgenin A;hepG2;inhibiting effect;ilex hainanensis;ursane triterpene
山绿茶为冬青科植物海南冬青(Ilex hainanensis
Merr．)的干燥叶经加工炮制而成，具有清热解毒，消
肿止痛，活血通脉的功效。主要用于降血压、降血
脂、降胆固醇及冠心病、脑血管意外所致的偏瘫，以
及风热感冒、肺热咳嗽、咽喉水肿、扁桃体炎、痢疾等
病症［1］。山绿茶为广西少数民族民间中草药，使用
历史悠久，目前主要作为生产降压制剂(如山绿茶
降压片、双山冲剂等)的原料药材使用。山绿茶资
源在我国分布极为丰富，其主要化学成分为黄酮类、
三萜苷类、三萜酸类及香豆素类等。本课题组通过
前期研究，已从山绿茶中分离鉴定出多个三萜类化
合物，其中的 ilexgenin A(IA)又名 3β，19α -二羟基
乌苏-12-烯-24，28-二羧酸，属于乌苏烷型三萜，现
代研究表明一些三萜和三萜皂苷特别是具有羧基的
该类化合物具有抗肿瘤活性［2-3］，乌苏烷型三萜大
多是乌苏酸的衍生物。本课题组针对 IA 是否具有
抑制 HepG2 肿瘤细胞增殖进行研究并且探讨其初
步作用机制。
1 材料
1. 1 药品和试剂 ilexgenin A 对照品(含量 ＞
97%，HPLC)自制，具体制备方法见参考文献［2］;
实验前用水 + DMSO 20 ∶ 1溶解;胎牛血清，上海克
隆生化制品公司，批号 NRJ0021;MTT，吖啶橙
(AO) ，低糖 DMEM，胰蛋白酶，DMSO，Sigma 公司，
批号分别为:A6014，D5975，T0458，D0324;Bcl-2，
Bax抗体，S-P试剂盒，上海长岛生物技术开发有限
公司，批号 201103，201103，201101;碘化丙啶(PI) ，
RNase A，Amersco公司，批号 0612。
1. 2 仪器 CK40型荧光倒置显微镜(日本 Olympus
公司) ;BB15 型 CO2 培养箱(德国 Heraeus 公司) ;
354 型酶标仪(美国 Thermo 公司) ;BD FACS 型流
式细胞仪(美国 Calibur公司)。
1. 3 细胞 人的肝癌细胞株 HepG2，购自中国典型
培养物收藏中心(CCTCC)。在 37 ℃，5% CO2 条件
下，用含 10%胎牛血清的低糖 DMEM 培养，对数生
长期的细胞用于实验。
2 方法
2. 1 MTT法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期
HepG2 加入 1. 5 g·L －1胰蛋白酶消化，吹打制成单个
细胞悬液，调整细胞密度为 5 × 103 /L，以每孔体积
200 μL接种于 96 孔培养板上。培养 24 h，待细胞
贴壁后，各孔分别加入不同浓度的 IA，每孔体积均
为 200 μL，使终浓度分别为 0(溶剂对照组) ，20，40，
60，80 g·L －1(给药组) ，每个浓度 6 个复孔，同时加
3 块板。分别培养 24，36，48 h后，加入 MTT 20 μL /
孔，置于 CO2 培养箱中继续培养 4 h 后终止培养。
小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入 DMSO 150
μL，充分振荡，使蓝紫色沉淀充分溶解，用酶标仪测
定 570 nm波长处的吸光度(A) ，不同时间点不同浓
度对肝癌细胞的增殖抑制率 =(对照组 A570 －用药
组 A570)/对照组 A570 × 100%，将抑制率最强的 3 个
浓度用于以下实验。
2. 2 HepG2 的相关凋亡蛋白 Bcl-2、Bax 表达 细
胞(1 × 104 /mL)接种于 6 孔板培养，按照实验分组
置培养箱中培养，制备 HepG2 爬片，相关凋亡蛋白
Bcl-2，Bax表达按照试剂盒检测方法操作，阳性染色
为胞浆棕色颗粒。根据阳性细胞分布情况，在 200
倍镜视野下，每张爬片随机选择 10 个视野，每个视
野计数 100 个细胞。计算平均阳性细胞率［(阳性
细胞数 /计数细胞总数)× 100%］作为阳性细胞表
达指数(PEI)。
2. 3 吖啶橙(AO)荧光染色检测细胞凋亡 将各组
制备成爬片，无菌 PBS 溶液洗去培养液，用 95%乙
醇固定 15 min，滴加 AO 染液，避光静置 2 ～ 3 min。
将附有单层细胞染色后的小盖玻片反置于载玻片
上，以滤纸吸取盖玻片周围的多余液体，用荧光显微
镜观察。凋亡细胞呈现染色减弱、荧光较暗、均匀一
致的圆状或固缩状、团块状结构，而非衰老细胞核呈
现荧光深浅不一的结构样特征。
2. 4 流式细胞仪分析细胞周期分布 将 HepG2 细
胞(1 × 104 /mL)接种于 6 孔板，待细胞长至 80%左
右融合。分为溶剂对照组及含 10%血清培养液的
给药组，培养 24 h后 70%乙醇 4 ℃固定过夜，RNase
A处理，PI避光染色，1 h 内上流式细胞仪检测细胞
周期分布，实验重复 3 次。
2. 5 统计学处理 采用 Prism 4. 0 统计软件，数据
以珋x ± s表示，组间比较进行单因素方差分析，P ＜
0. 05 为有统计意义。
3 结果
3. 1 IA对 HepG2 细胞增殖的影响 与溶剂对照组
比较，IA对 HepG2 细胞增殖抑制率呈现时间和浓度
依赖性。IA 80 g·L －1对细胞增殖的抑制效果最明
显，结果见表 1。
·932·
李洪亮，等:山绿茶中 Ilexgenin A对 HepG2 肿瘤细胞抑制作用的实验研究
表 1 ilexgenin A对 HepG2 细胞增殖的影响 (珋x ± s，n = 6)
组别
剂量
/ g·L －1
24 h 36 h 48 h
A 抑制率 /% A 抑制率 /% A 抑制率 /%
溶剂对照 — 0. 591 ± 0. 048 — 0. 634 ± 0. 075 — 0. 579 ± 0. 035 —
ilexgenin A 20 0. 503 ± 0. 042 14. 9 0. 511 ± 0. 098 19. 4 0. 476 ± 0. 022 17. 8
40 0. 407 ± 0. 0561) 31. 1 0. 357 ± 0. 0582) 43. 7 0. 328 ± 0. 0372) 43. 4
60 0. 373 ± 0. 0391) 36. 9 0. 398 ± 0. 0672) 37. 2 0. 366 ± 0. 0861) 36. 8
80 0. 355 ± 0. 0451) 39. 9 0. 197 ± 0. 0492) 68. 9 0. 224 ± 0. 0432) 61. 3
注:与溶剂对照组比较1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01。
3. 2 各组 Bcl-2、Bax 阳性表达情况 溶剂对照组
HepG2 的 Bax免疫化学染色部分细胞轻度着色，在
20 倍显微镜下观察无强阳性表达。IA 给药组 Bax
免疫化学染色出现明显强阳性，阳性细胞显现棕黄
色，在 20 倍显微下就能观察到明显表达。溶剂对照
组 HepG2 的 Bcl-2 免疫化学染色部分细胞重度着
色，在 20 倍显微镜下观察强阳性表达。IA 给药组
无显强阳性，阳性细胞显现淡棕黄色，在 200 倍显微
下观察表达率明显弱于溶剂对照组。各组 PEI结果
见图 1。
3. 3 AO 荧光染色结果 溶剂对照组镜下观察
HepG2 细胞生长良好，细胞形态均一，吖啶橙染色
后细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征，在荧光
20 倍镜下观察整个视野未出现明显凋亡细胞。IA
给药组 HepG2 在 IA 给药组作用下部分细胞明显
与溶剂对照组比较1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01
图 1 各组 Bcl-2、Bax阳性表达情况(珔x ± s，n =3)
出现衰老或凋亡，在荧光 200 倍显微镜下观察，能够
观察到大量的凋亡细胞，凋亡细胞染色减弱、荧光较
暗、均匀一致的圆状或固缩状。见图 2。
A. 溶剂对照;B. ilexgeniz A 20 g·L －1;C. ilexgenin A 40 g·L －1;D. ilexgenin A 60 g·L －1;E. ilexgenin A 80 g·L －1
图 2 IA对细胞凋亡的影响 (AO荧光染色，200 ×)
3. 4 IA对 HepG2 细胞周期分布的影响 流式细胞
术检测结果显示，IA作用 HepG2 细胞 24 h 后，与正
常组相比，G1 期比例明显增加，随质量浓度增加，S
期细胞比例逐渐减少，G2 期细胞有所减少，以 80 g·
L －1最为明显。各组细胞均存在不同程度的凋亡，
结果见表 2、图 3。
表 2 IA对 HepG2 细胞周期分布的影响 (珋x ± s，n = 6)
组别
剂量
/ g·L －1
G0 /G1 期
/%
S期
/%
G2 /M期
/%
凋亡率
/%
溶剂对照 — 57. 14 ± 5. 78 21. 34 ± 2. 14 21. 52 ± 3. 10 4. 56 ± 1. 12
ilexgenin A 40 60. 32 ± 3. 24 16. 34 ± 2. 361) 23. 34 ± 2. 56 7. 89 ± 3. 091)
60 63. 45 ± 4. 67 17. 57 ± 1. 981) 18. 98 ± 1. 341) 8. 37 ± 2. 571)
80 74. 32 ± 3. 78 16. 11 ± 2. 711) 9. 57 ± 2. 581) 9. 93 ± 3. 141)
注:与溶剂对照组比较1)P ＜ 0. 05。
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第 18 卷第 15 期
2012 年 8 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 18，No． 15
Aug．，2012
A. 溶剂对照;B. ilexgenin A 40 g·L －1;
C. ilexgenin A 60 g·L －1;D. ilexgenin A 80 g·L －1
图 3 IA对 HepG2 细胞周期分布的影响
4 讨论
大量的研究表明乌苏酸对多种肿瘤细胞株的生
长有抑制作用，如 A549 人肺腺癌细胞、P388 和
L1210 白血病细胞、Burkitt淋巴瘤、P3HR1 细胞及慢
性髓性白血病细胞 K562 等［4］，在对乌苏酸诱导人
肝毒细胞瘤 HepG2 细胞凋亡的研究中发现，乌苏酸
明显降低 HepG2 细胞活力并呈现出浓度和时间依
赖性，且 30 μmol·L －1乌苏酸能够诱导细胞 DNA 断
裂和亚二倍体细胞生成，同时还可以提高细胞色素
C的释放和凋亡蛋白酶 CPP3 的活力［5］。本研究
中，IA作用于 HepG2 细胞相同时间段不同浓度之间
增殖抑制率有统计学差异，说明 IA 对 HepG2 细胞
的增殖抑制作用有浓度依赖性。IA 作用于 HepG2
细胞相同浓度 24，36 h和 48 h的不同时间段三者差
异显著，说明 IA 对 HepG2 细胞的增殖抑制作用有
时间依赖性。AO 荧光染色结果表明，HepG2 细胞
经 IA作用后，细胞周期的主要特点是大部分细胞累
积于 G1 期，进入 S期的细胞减少，有丝分裂减少，或
者发生分化，或者进入凋亡过程。从某种程度上说，
Bcl-2 与 Bax 的比值决定了细胞生命过程的走向，
Bcl-2 /Bax升高，细胞凋亡减少，存活量增加;Bcl-2 /
Bax 降低，细胞凋亡增加，存活量减少［6-7］，IA 对
HepG2 细胞的增殖抑制作用机制可能是通过使
HepG2 细胞内 Bcl-2 表达减少和 Bax 的表达增加。
IA 在体内对细胞凋亡的影响以及其详细机制尚有
待进一步研究。
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［S］．南宁:广西科技出版社，1992:137．
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验室，2010，27(1) :131．
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［7］ 夏阳，苟欣． 熊果酸诱导前列腺癌细胞株 PC-3 凋亡
的实验研究［J］． 重庆医科大学学报，2009，34
(12) :1661．
［责任编辑 何伟］
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李洪亮，等:山绿茶中 Ilexgenin A对 HepG2 肿瘤细胞抑制作用的实验研究