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豨莶草指纹图谱研究和3种活性成分的含量测定



全 文 :*河北省中医药管理局基金资助项目(2013009)
豨莶草指纹图谱研究和3种活性成分的含量测定*
张 磊 刘 佳 于 静 杨树民 河北医科大学第一医院(石家庄050031)
 摘 要 目的:建立豨莶草药材 HPLC指纹图谱,并同时测定豨莶草中奇壬醇、豨莶苷及豨莶精醇3
种主要活性成分的含量。方法:采用 Kromasil WQ C8柱(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,
以甲醇-乙腈-0.05mol/L KH2PO4溶液为流动相进行梯度洗脱,流速1.0mL/min,柱温30
℃,进样量10μL,检测波长215nm,记录不同产地10批豨莶草色谱图数据,并同时测定了
其中3种主要活性成分的含量。结果:建立了豨莶草 HPLC指纹图谱,10批不同来源的豨
莶草药材指纹图谱相似度较高,并利用“中药色谱指纹图谱相似度评价软件”生成了豨莶草
药材的对照指纹图谱,得到14个共有峰,各色谱峰分离度良好,符合指纹图谱检测要求。并
成功测定了不同批次豨莶草中奇壬醇、豨莶苷及豨莶精醇3种主要活性成分的含量,结果分
别为0.12%~1.41%、0.10%~2.19%、0.01%~0.39%。结论:本方法操作简便、准确、重
现性好,为豨莶草药材的鉴别和质量控制提供科学依据,并为豨莶草活性成分的含量测定提
供参考方法。
 主题词 色谱法,高效液相 @活性成分含量测定 豨莶草
 【中图分类号】 R282【文献标识码】 A doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2015.12.052
Determination of fingerprint of Herba Siegesbeckiae and3 kinds of active ingredients
The First Hospital of Hebei Medical University(shijiazhuang 050031) Zhang Lei Liu Jia Yu Jing et al
  ABSTRACT Objective:To establish Siegesbeckia herb material HPLC fingerprint,and simultaneous determina-
tion of Herba Siegesbeckiae kirenol,Siegesbeckia glycosides and Siegesbeckia alcohol 3kinds of main active ingredient
content.Methods:Kromasil WQ C8column(4.6mm×250mm,5m)column,methanol-acetonitrile(0.05mol/L
KH2PO4solution for flow by gradient elution,flow rate of 1.0mL/min,column temperature of 30DEG C,into the
sample weight of 10g l,detection wavelength of 215nm recorded from different regions of 10batches of Herba Sieges-
beckiae chromatogram data,and simultaneous determination of the content of three kinds of active ingredients.Results:
Herba Siegesbeckiae HPLC fingerprint were established.Ten batches of different sources of Siegesbeckia herb fingerprint
similarity higher,and the traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation software to gen-
erate the control fingerprint of Herba Siegesbeckiae herbs,get 14common peaks,al kinds of spectral peaks were wel
separated,in line with the fingerprint.And the successful determination of the content of different batches of Herba Sieg-
esbeckiae kirenol,Siegesbeckia glycosides and Siegesbeckia alcohol 3kinds of main active components,the results were 0.
12%to 1.41%,0.10% ~2.19%,0.01% ~0.39%.Conclusion:This method operation is simple,accurate and repro-
ducible,Siegesbeckia herb identification and quality control to provide a scientific basis,and Herba Siegesbeckiae active
ingredient content determination to provide reference method.
KEY WORDS HPLC @Determination of active ingredients Herba Siegesbeckiae
  豨莶草收载于《中国药典》2010版一部,具有祛风
湿、强筋骨、解毒、化湿热的功效,中医临床主治风湿痹
痛、筋骨不利、腰膝冷痛、四肢麻痹、半身不遂、风疹湿
疮等症[1]。主要产区有河北、四川、浙江、湖北等,主要
含有二萜类、倍半萜类、黄酮类等化学成分,研究表明,
豨莶草中奇壬醇、豨莶精醇、豨莶苷具有抗风湿、抗血
栓、抗炎镇痛及心血管保护等生物活性[2-3]。目前国
内大多是对豨莶草中化学成分的研究,而对在同一色
谱条件下测定豨莶草的多种活性成分和指纹图谱的研
究较少。本实验采用高效液相色谱法,研究并建立中
药豨莶草的指纹图谱,并对不同批次的豨莶草药材进
行对比,以期为豨莶草的质量控制建立有效的方法,并
为豨莶草的临床用药提供参考。
1 仪器与试药 1.1 仪 器  Agilent-1100
高效液相色谱仪(包括G1322A在线脱气机,G1311A
四元梯度泵,G1313A 自动进样器,G1316A 柱温箱、
G1315BDAD可变波长紫外检测器,美国 Agilent公
司);METTLER AE240型1/10000天平 (北京赛多
4761 陕西中医2015年第36卷第12期
利斯仪器有限公司)。
1.2 试 剂  甲醇、乙腈;蒸馏水,其他试剂均为
分析纯。对照品:奇壬醇对照品(批号111726-200601,
中国生物制品检定研究院)提供,豨莶苷对照品(批号
30-1007,上海中药标准化研究中心)、豨莶精醇对照品
(批号03-2006,上海中药标准化研究中心)。药材:10
批药材均购自药材市场,依次为:120401批(河北安
国)、120501批(河北安国)、20120701-1批(湖北)、
130811批 (湖 北)、131101CP651 批 (河 北 安 国)、
1401001批 (四川)、120901CP651 批 (河北安国)、
130101批(浙江)、20100901批(河北安国)、110701批
(湖北)。
2方法与结果 2.1 对照品溶液的制备  取奇
壬醇、豨莶苷、豨莶精醇对照品适量,精密称定,加甲醇
溶解并稀释制成浓度分别为0.24、0.84、0.20mg/mL
的对照品溶液,即得。
2.2 供试品溶液的制备  豨莶草药材粉碎,过
40目筛。取约20.0g精密称定,置500mL圆底烧瓶
中,加10倍量的70%乙醇溶液,摇匀,称定质量,加热
回流提取40min,取出,放冷至室温,用70%乙醇溶液
补足质量,摇匀,过0.45μm 微孔滤膜,取续滤液,即
得。
2.3 指纹图谱方法的建立 色谱条件及系统适
用性 试 验:色 谱 柱:Kromasil WQ C8 (4.6mm×
250mm,5μm),流动相:甲醇-乙腈-0.05mol/L KH2
PO4溶液,梯度洗脱程序见表1;流速:1.0mL/min;柱
温:30℃;进样量:10μL;检测波长:215nm。所有组
分均在60min内检测完成,除未达到基线分离的两峰
合并外,其余各峰之间的分离度均大于1.5。豨莶草
药材色谱图见图1,奇壬醇、豨莶苷、豨莶精醇对照品
色谱图见图2。
表1 梯度洗脱程序表
时间/min 甲醇-乙腈-0.05mol/L KH2PO4
0~15  6:28:66
15~20  6:43.5:50.5
20~30  6:50:44
30~50  6:60:34
50~60  6:28:66
  专属性试验:分别取空白溶剂(甲醇-乙腈-0.
05mol/L KH2PO4=6:28:66)和供试品溶液,按 “2.
1”项下色谱条件进样,记录色谱图。结果表明,空白溶
剂不干扰供试品溶液的测定,专属性良好。精密度试
验:取同一份豨莶草药材的供试品溶液,按 “2.1”项下
色谱条件,连续进样6针,记录色谱图。利用中药色谱
指纹图谱相似度评价系统A版软件计算相似度,结果
均大于0.9;各主要色谱峰相对保留时间的RSD均小
于0.16%,相对峰面积的RSD均小于1.5%。结果表
明,仪器的精密度良好。重复性试验:取同一批豨莶草
药材,分别按 “2.3”项下方法平行制备6份供试品溶
液,按 “2.1”项下色谱条件依次进样,记录色谱图。相
似度计算结果均大于0.9;各主要色谱峰相对保留时
间的RSD均小于0.36%,相对峰面积的RSD均小于
1.45%。结果表明,该方法的重复性良好。稳定性试
验:取同一份豨莶草药材的供试品溶液,按 “2.1”项下
色谱条件,分别在0、2、4、6、8、10、12、24h进样,记录
色谱图。相似度计算结果均大于0.9;各主要色谱峰
相对保留时间的 RSD均小于1.1%,相对峰面积的
RSD均小于2%,结果表明,供试品溶液在24h内稳定
性良好。豨莶草药材指纹图谱的建立:取10批不同产
地豨莶草药材,按 “2.2”项下方法制备供试品溶液,分
别进样,记录色谱图,得豨莶草药材指纹图谱,见图3。
采用国家药典委员会编写的“中药色谱指纹图谱相似
度评价系统2004A版”软件生成豨莶草共有模式的对
照指纹图谱,得到14个共有峰,通过与对照品图谱对
照,指认其中的1号峰为奇壬醇,2号峰为豨莶苷、8号
峰为豨莶精醇。
相似度评价:利用相似度评价软件对上述10批豨
莶草药材的指纹图谱进行相似度分析,其相似度依次
5761陕西中医2015年第36卷第12期
为0.912、0.908、0.923、0.607、0.928、0.489、0.905、
0.653、0.621、0.619。由相似度结果可知,不同来源的
10批豨莶草药材中有5批的相似度均在0.9以上,6
号药材相似度在0.5以下,不同产地的豨莶草药材批
间差异较大,河北安国产地药材相似度普遍高于其他
产地。
2.4 豨莶草中奇壬醇、豨莶苷和豨莶精醇的含量
测定 色谱条件及系统适用性试验 色谱条件同“2.
3.1”,在此色谱条件下,精密量取供试品溶液10μL,注
入 HPLC色谱仪,记录色谱图至60min,理论塔板数
按奇壬醇、豨莶苷和豨莶精醇计算分别为45 000、40
000和60 000,与其他色谱峰的分离度大于1.5,达到
基线分离。线性关系考察:精密量取“2.1”项下制备的
对照品混合溶液适量,稀释成含有奇壬醇、豨莶苷、豨
莶精醇分别为15~240μg/mL、、52.5~840μg/mL、
12.5~200μg/mL 的对照品溶液。吸取上述溶液
10μL,注入 HPLC色谱仪,记录峰面积。以质量浓度
为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,经
计算得回归方程如下,奇壬醇:Y=6.57X+9.50(R2
=0.9999);豨莶苷:Y=2.1744X+78.975(R2=0.
9999);豨莶精醇:Y=8.331X+32.129(R2 =0.
9995),表明在该色谱条件下,各成分线性关系良好。
精密度试验:取1号豨莶草药材适量,精密称定,制备
供试品溶液,吸取10μL,注入高效液相色谱仪,重复进
样6次,记录峰面积,计算得奇壬醇、豨莶苷和豨莶精
醇峰面积的RSD分别为0.6%、1.1%和0.9%,表明
该方法精密度良好。稳定性试验:取1号豨莶草药材
适量,精密称定,制备供试品溶液,分别于0、2、4、6、8、
12、24h连续进样6次,记录保留时间和峰面积,结果
奇壬醇、豨莶苷和豨莶精醇峰面积的RSD分别为1.
0%、1.3%和1.1%,说明供试品溶液在24h内稳定。
重现性试验:取1号豨莶草药材适量,精密称定6份,
制备供试品溶液,分别吸取10μL,注入高效液相色谱
仪,记录峰面积,结果奇壬醇、豨莶苷和豨莶精醇峰面
积的RSD分别为1.7%、1.6%和2.0%,表明该方法
重现性良好。加样回收率试验:取1号豨莶草药材约
10.0g,共6份,精密称定,分别精密量取奇壬醇、豨莶
苷和豨莶精醇对照品溶液1mL(约相当于豨莶草药材
含奇壬醇、豨莶苷和豨莶精醇的50%),依次加入上述
6份药材中,制备供试品溶液,依法测定,结果奇壬醇、
豨莶苷和豨莶精醇的平均回收率分别为 99.18%、
101.77%和102.34%,RSD分别为0.9%,1.3%和1.
1%,表明该方法准确度高,可用于3种成分的含量测
定。样品测定:取10批不同产地和不同批次的豨莶草
药材,制备供试品溶液,依法测定,平行测定3次,计算
供试品中奇壬醇、豨莶苷和豨莶精醇的含量,结果见表
2。
表2 10批豨莶草药材中奇壬醇、
豨莶苷和豨莶精醇的含量测定结果(mg/g)
产 地 奇壬醇 豨莶苷 豨莶精醇
S1 河北安国 0.45  0.95  0.35
S2 河北安国 0.46  0.91  0.39
S3 湖北 1.41  1.68  0.25
S4 湖北 0.62  0.30  0.05
S5 河北安国 0.75  2.19  0.34
S6 四川 0.12  0.10  0.01
S7 河北安国 0.75  1.22  0.15
S8 浙江 0.64  0.68  0.15
S9 河北安国 1.22  1.94  0.23
S10 湖北 0.76  0.90  0.05
  3 讨 论 不同来源的豨莶草药材指纹图谱相
似度存在差异,10批豨莶草药材中有5批的相似度均
在0.9以上,其中河北安国产地的指纹图谱相似度普
遍高于其他产区样品,证明了固定药材产地对于保证
药材质量的重要意义。含量测定结果表明,含量测定
结果显示豨莶草主要活性成分含量大小顺序为奇壬醇
>豨莶苷>豨莶精醇,其中河北安国产地药材中豨莶
精醇含量均明显高于其他产地。不同来源10批豨莶
草药材中奇壬醇、豨莶苷和豨莶精醇的含量差异较大,
药材质量存在优劣。初步推测这可能与药材不同产
地、不同采收期、不同生长年限等因素有关,这些影响
含量变化的因素还有待进一步考察。
另外,由相似度评价结果可知,不同产地的10批
豨莶草药材指纹图谱中14个特征指纹峰的相对保留
时间一致,但各共有峰相对峰面积有一定的差异,证明
各批次药材之间的质量存在差异。结合主要活性成分
含量测定的结果,表明豨莶草药材指纹图谱的相似度
与其主要活性成分的含量存在一定的相关性,可为豨
莶草药材的品质评价、规范种植产地、发展道地药材提
供科学指导。
参考文献
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1094。
(收稿2015-07-29;修回2015-08-25)
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