全 文 ：2016 年 10 月 第 18 卷 第 10 期 中国现代中药 Mod Chin Med Oct. 2016 Vol. 18 No. 10
·专题·
△ ［基金项目］ 新疆维吾尔自治区科技厅高新技术研究发展项目(201517107)
* ［通信作者］ 李晓瑾，研究员，研究方向:中药资源，Tel: (0991)2665614，E-mail:xjlxj@ 126. com
基于 ITS2 序列的维吾尔药材蜀葵及其近缘种鉴定研究△
樊丛照，坤杜孜·阿依，李晓瑾*
(新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002)
［摘要］ 目的:研究蜀葵与药蜀葵特征 DNA 序列的差异，为鉴定维吾尔药材蜀葵及药蜀葵提供依据。方法:
采用试剂盒法提取蜀葵及药蜀葵基因组 DNA，PCＲ 扩增 ITS2 片段，双向测序，应用 Mega6. 0 软件分析序列，计算
种内及种间遗传距离，构建 NJ鉴别树。结果:蜀葵 ITS2 序列长度为 233 bp，与药蜀葵 231 ～ 232 bp存在差异;蜀葵
种内最大 K2P遗传距离为 0. 004，药蜀葵种内 K2P遗传距离为 0，蜀葵与药蜀葵种间平均 K2P 遗传距离为 0. 0732;
NJ树结果表明蜀葵与药蜀葵均单独聚为一支。结论:ITS2 序列可用于维吾尔药材蜀葵真伪鉴定的 DNA 条形码，为
保障临床正确用药提供了新的方法。
［关键词］ ITS2;蜀葵;鉴定
Identification of Uyghur Medicine Althaea rosea and Its
Closely Ｒelated Species Based on ITS2 Sequence
FAN Congzhao，KUNDUZI·Ayi，LI Xiaojin*
(Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and Ethnical Materia，Urumqi 830002，China)
［Abstract］ Objective:To explore a new method to identify Uygur Medicine Althaea rosea and its closely related
species A. officinalis by the difference of ITS2 regions. Methods:Genomic DNA of A. rosea and A. officinalis were extracted by
Ｒeagent kit，ITS2 sequences were obtained by PCＲ amplification and sequenced bidirectionally. Mega 6. 0 software was used to
analyze sequence，calculate intra-and inter-specific genetic distance and construct neighbor joining (NJ)tree. Ｒesults:The
ITS2 sequence length of A. rosea was 233 bp and A. officinalis was 231 to 232 bp differences. The maximum K2P genetic
distance of A. rosea was 0. 004，when A. officinalis was zero. The average interspecific K2P genetic distance between A. rosea
and Althaea officinalis was 0. 0732. NJ tree results showed that A. rosea and A. officinalis were clustered，
respectively. Conclusion:The ITS2 sequences can be used to identify Uygur A. rosea with A. officinalis as an effective DNA
barcoding，which provides a new methods to ensure its clinical safety.
［Keywords］ ITS2;Althaea rosea;identification
doi:10． 13313 / j． issn． 1673-4890． 2016． 10． 004
锦葵科(Malvaceae)蜀葵属植物在我国分布有 3
种，其 中 蜀 葵 Althaea rosea 与 药 蜀 葵 Althaea
officinalis在新疆分布较为广泛，而裸花蜀葵 Althaea
nudiflora分布较少［1-2］。
蜀葵及药蜀葵皆为维吾尔医常用药，但功效用
法不同。蜀葵:花可镇静安神、止咳平喘，种子用
于清热解毒、利水通便，根则下乳、生肌［3-4］;药蜀
葵:叶外用可消疮祛痈，根内服利尿止咳［5-6］。新疆
药材地方标准仅收载了蜀葵［7-8］。但市场上常因两者
外观相似而混淆［9］，存在临床用药安全隐患。因此，
准确鉴定药材基原，对保障药材质量具有重要的
意义。
DNA条形码是利用植物基因组中一段通用标准
短序列来进行物种鉴定的分子诊断新技术［10］，可不
受样品形态形状的限制，实现快速、准确的判定植
物基源。陈士林等研究证明 ITS2 序列可以作为通用
DNA条形码鉴别药用植物［11-15］，已在羌活［16］、阿
魏［17］、金银花［18］、香青兰［19］等中药民族药材得到
验证。 “中药材 DNA 分子鉴定指导原则”已载入
《中华人民共和国药典》2010 版第三增补本［20］和
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2016 年 10 月 第 18 卷 第 10 期 中国现代中药 Mod Chin Med Oct. 2016 Vol. 18 No. 10
2015 版［21］。本文旨在研究蜀葵属 ITS2 序列，建立
蜀葵、药蜀葵药材基原的鉴定方法，保障患者用药
的准确与安全，为正确合理利用维吾尔药材资源提
供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 实验材料
研究样本 34 个(详见表 1)。其中:11 份采自新
疆各地，由新疆中药民族药研究所副研究员王果平
鉴定为蜀葵 8 份，药蜀葵 3 份，凭证标本保存于新
疆中药民族药研究所标本馆(新疆 XTNM) ;购自维
吾尔药市场蜀葵药材样品 6 份;查自 GenBank 数据
库蜀葵序列 10 条，药蜀葵序列 5 条，欧亚花葵序列
2 条。
表 1 研究样本信息
样品名称 标本号
样本号或
GenBank
登录号
样品来源
蜀葵
Althaea
rosea
基原植物
药材
对照序列
652822120702139 KF454359 轮台群巴克乡
20120628178 KF454360 于田县希吾勒乡
20120715270 KF454361 民丰县叶亦克乡
20120720408 KF454362 于田县兰干乡
654021120704002 — 伊宁县愉群翁
654025120904020 KF454366 新源县新源镇
65230575 KF454358 吉木萨尔二工乡
65230736 — 昌吉木垒县城
YC003633(根) — 和田药材市场
YC000236(根) — 二道桥药材市场
YC000237(花) — 伊犁药材市场
YC000045(花) — 二道桥药材市场
YC000043(种子) — 二道桥药材市场
YC000044(种子) — 二道桥药材市场
— JX017319、KP231346-54 GenBank
药蜀葵
Althaea officinalis
654025120801003 KF454365 新源县 72 团
654025120801002 KF454364 新源县 72 团
H0228 — 哈巴河县 185 团
—
AF303026、
F679733、
EF419536-38
GenBank
欧亚花葵
Lavatera thuringiaca — EF419451-52 GenBank
注:标本号为 654021120704002、65230736 的样本 ITS2 序列与
KF454359 一致，H0228 序列与 KF454364 一致。
1. 1. 2 试剂 PCＲ 扩增引物由生工生物工程合成，
ITS2 正向序列:5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’，
反向:5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’;DNA 提
取试剂盒、DNA聚合酶及 dNTP等均购自天根生物。
1. 1. 3 实验仪器 研磨仪:型号 GT-100，GＲINDEＲ;
离心机:型号 Anker TGL-16C，上海安亭科学仪器;
PCＲ 扩 增 仪:型 号 070-851， An Analytik Jena
company。
1. 2 方法
1. 2. 1 DNA提取及检测 称取干燥药材 30 mg，DNA
提取研磨仪 1000 r·min －1研磨 2 min，植物 DNA提取
试剂盒提取总 DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组
DNA的质量。
1. 2. 2 PCＲ 扩增及测序 反应体积 25 μL，dNTP
0. 4 μL(10 mmol·L －1) ，PCＲ缓冲液 2. 5 μL(10 ×) ，
引物各 1. 0 μL(2. 5 μmol·L －1) ，聚合酶 1. 0 U，总
DNA 1 μL(约 30 ng)。引物 ITS2 扩增程序:94 ℃，
变性 5 min;94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃
延伸 45 s(40 个循环) ;72 ℃延伸 10 min［13］。PCＲ
扩增产物电泳检测后，使用 ABI 3730 XL(Applied
Biosystems Co. ，USA)测序仪由美吉生物测序公司进
行双向测序。
1. 3 数据处理
测 序 峰 图 用 CodonCode Aligner V 4. 0. 4
(CodonCode Co. ，USA)校对拼接，去除引物区。将
所有序列由软件 MEGA6. 0(molecular evolutionary
genetics analysis)分析比对［22］，ITS2 序列基于隐马尔
可夫模型的 HMMer注释方法，去除两端 5. 8S和 28S
区段获得 ITS2 间隔区序列［23］，用邻接(NJ)构建系
统聚类树，使用 bootstrap(1000 次重复)检验各分支
的支持率［24］。
2 结果与分析
2. 1 DNA提取、PCＲ扩增及测序结果
从样品叶片、干燥花、种子、根等药用部位中
均成功提取了基因组 DNA，经电泳检测条带清晰，
PCＲ结果经双向测序，质量较好。
2. 2 序列信息及变异
蜀葵 24 条 ITS2 序列比对后，长度均为 233 bp。
其中来源于基原植物标本的 8条 ITS2序列种内无变异
位点，为 1个单倍型，来源于药材市场的蜀葵药材有
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两个单倍型，编号为YC000043的样本在24 bp位点有
C-个变异，其余样本序列与蜀葵基原植物一致(如图
1) ，来源于 GenBank的序列均与基原植物相同。药蜀
葵 8 条序列比对后，长度为 231 ～ 232 bp，KF454365
在 125 bp 位点有 T 碱基缺失变异，其余序列与
KF454364一致。蜀葵平均 GC 含量为 53. 22%，药蜀
葵为 57. 76%，蜀葵与药蜀葵种间 GC含量差异显著。
图 1 不同单倍型实验样本种内及种间变异位点比较
2. 3 种内及种间 K2P距离分析
蜀葵种内 K2P距离为 0 ～ 0. 004，平均 K2P距离
为 0. 000 3;药蜀葵种内 K2P 距离为 0。蜀葵与药蜀
葵种间 K2P距离为 0. 073 ～ 0. 078，种间平均 K2P距
离为 0. 073 2，表 2。ITS2 序列种间存在 18 个变异位
点，其中信息变异位点有 16 个，16 个信息变异微店
均以将蜀葵与药蜀葵进行区分。
表 2 种内种间 K2P遗传距离计算结果
关系 K2P距离范围 平均 K2P距离 变异位点数
蜀葵种内 0 ～ 0. 004 0. 000 3 1
药蜀葵种内 0 0 1
蜀葵与药蜀葵种间 0. 073 ～ 0. 078 0. 073 2 18
2. 4 蜀葵与药蜀葵 NJ树聚类鉴定结果
采用蜀葵 23 条 ITS2 序列，药蜀葵 7 条 ITS2 序
列，以与蜀葵属亲缘关系相近形态相似的植物欧亚花
葵作为外缘种构建 NJ 系统聚类树，根据图 1 可以看
出，所有来源的蜀葵序列聚为一支，支持率为 99%;
药蜀葵单独聚为一支，支持率为 99%。欧亚花葵作为
外缘种，与前两者显著区分。因此，ITS2 序列作为条
形码可准确鉴别维吾尔药材蜀葵与药蜀葵。
图 2 基于 ITS2 序列的单倍型 NJ鉴别树，在图中显示分支支持率(≥50%，bootstrap 1000 次重复)
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3 讨论
3. 1 ITS2 序列能够准确稳定的鉴定维吾尔药材
蜀葵与药蜀葵为功效不同的两种维吾尔常用药
材，但两者存在混用现象［9］。本研究采用 DNA 条形
码 ITS2 序列对维吾尔药材蜀葵、药蜀葵进行鉴定，
研究结果表明，药用部位叶片、花、种子、根等药
用部位都能成功提取基因组 DNA，适合应用 DNA条
形码 ITS2 序列进行鉴定。通过对市场收集的 6 份蜀
葵药材进行鉴定，ITS2 序列比对及 NJ鉴别树结果表
明，不同地区收集的 6 份药材均来源于蜀葵。本研
究结果仅包括了 6 份市售药材，不能代表市场上流
通的所有药材蜀葵，但 DNA条形码技术能准确鉴定
市售药材蜀葵的基原，为药材的质量控制提供科学
依据。
3. 2 DNA条形码在维吾尔药材鉴定中的意义
药材基原的准确性与中药材的准确鉴定对中药
材的临床疗效有着重要的作用。相比中药材，维吾
尔药材来源更为复杂，广泛使用进口药材，在长期
的用药过程中由于翻译错误、鉴定错误、代用混用
等原因，考证难度较大，传统的形态、显微、化学
等鉴定方法虽然在药材的鉴别中发挥了一定的作用，
但对于鉴定近缘种和外观形态相似的药材，还存在
一定的困难，加之药材形状易受到采收加工及储存
条件的影响，传统鉴定方法已无法满足药材的鉴定
需要［25］。相比之下，DNA条形码鉴定不受药材形状
影响，不受专业技术的限制，直接从基因水平提供
鉴定依据。已有研究者采用 DNA条形码技术对来源
与不同地区药材市场的红景天［26］、泽泻［27］、鹿
茸［28］、川木香［29］等中药材进行了鉴定分析，结果
表明 DNA条形码技术不仅可以为这几种药材市场真
伪品现状提供依据，而且可以追溯药材的基原。因
此，采用 DNA条形码技术可以快速准确的鉴定维吾
尔药材，在今后药材来源、标准制定、药材流通和
市场管理等实际应用中具有重要的价值。
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择上，避免活泼氢干扰，尽量选择信号稳定，杂
质峰干扰小的 26 位的两个氢质子进行定量分析，
结果与质量平衡法相互吻合，保证了牛磺胆酸钠
定值准确。
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(收稿日期 2015-12-22
檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿
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