全 文 ：果 树 学 报 2013，30（1）: 105～109
Journal of Fruit Science
锥栗植株再生体系的建立
杨志坚，冯金玲，陈 辉 *
（福建农林大学林学院，福州 350002）
摘 要： 【目的】为了建立锥栗再生体系，【方法】以锥栗胚为外植体，分析不同基因型、基本培养基及激素组合对锥栗
不定芽的诱导、增殖和生根的影响。 【结果】结果表明，油榛是锥栗组织培养最佳的基因型；锥栗不定芽诱导的最适培
养基为 M（NH4NO3 804 mg·L-1+ KNO3 1011 mg·L-1 +FeSO4·H2O 27.8 mg·L-1 + 1/2MS 其余无机盐 + MS 有机）+6-BA 2.0
mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1，其出芽率为 76%；芽增殖的最佳培养基为 M（同上）+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1，其增殖
倍数达 18；诱导生根的最佳培养基为 M（同上）+IBA 0.5 mg·L-1，其生根率为 48%。 【结论】运用上述体系可获得完整
锥栗再生植株。
关键词： 锥栗； 组织培养； 植株再生
中图分类号：S664．2 文献标志码：A 文章编号：1009－9980(2013)01－0105－05
Establishment of tissue culture regeneration system for Castanea henryi
YANG Zhi-jian， FENG Jin-ling， CHEN Hui*
(Forestry College of Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002 China)
Abstract： 【Objective】The objective of the study was to establish the tissue culture regeneration system for
Castanea henryi. 【Method】The embryo was used as the explant， and the effect of genotype， basic medium
and the combination of hormones on the bud induction， multiplication and rooting was investigated . 【Re-
sult】The results showed that You-zhen was the best genotype suitable for tissue culture of Castanea henryi
and the best medium was M （NH4NO3 804 mg·L-1+ KNO3 1011 mg·L-1+FeSO4·H2O 27.8 mg·L-1+1/2MS
the rest of inorganic salt + MS organic substance）+6-BA 2.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1. The regeneration
ratio was up to 76%. On the medium of M（ditto）+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1， the adventitious bud
could be multiplied rapidly. The multiplication coefficient was about 18. When the shoots with a length of
3cm were cultured on the medium of M（ditto）+IBA0.5 mg·L-1， more than 48% of them rooted and devel-
oped normally. 【Conclusion】The whole regenerated plant of Castanea henryi could be obtained with the
system.
Key words： Castanea henryi； Tissue culture； Regeneration system
锥栗（Castanea henryi）属壳斗科栗属，是我国著
名的木本果材兼用树种。 其人工林主要集中在闽北
和浙南， 已成为闽北地区重要的经济林树种之一 [1]。
锥栗果实外形光洁美观、果肉细嫩香甜， 含有淀粉、
糖、蛋白质等主要营养成分及 18种钙、锌、磷、钾、铁
等矿物质，深受消费者青睐，在国际市场中具有强大
的竞争力。锥栗栽培品种多且乱，为了保持其优良特
性， 目前繁殖大部分采用扦插、 嫁接等无性繁殖方
法，但扦插受限于生根率和优质插条的数量，嫁接受
砧木与接穗亲和力、 接穗数量和生活力以及生长环
境等因素的影响，同时扦插和嫁接出苗周期长，造成
它们扩繁速度慢，育苗效率低，在种质资源有限的条
件下不能满足锥栗良种的大量推广[2]。而组织培养快
速繁殖苗木，不仅可以加速良种繁育，而且在离体条
件下群体大，实验条件易于控制，不受时间和季节的
限制，并在一定程度上保持母本的优良性状。近来学
者对锥栗的生理生化、良种繁育、生态、栽培技术、病
虫害、加工利用等方面开展了研究 [3]，但对锥栗组织
培养的研究相对较少，迄今为止，未见锥栗再生体系
建立的研究报道[4-5]。 我们进行锥栗组培快繁技术和
收稿日期： 2012－07－08 接受日期： 2012－10－31
基金项目： 国家“十二五”科技支撑计划（2013BAD14B04）福建省科技厅重大专项（2001F007）；福建省省长基金（0201E9）；校青年基金
（06A04）
作者简介： 杨志坚，男，讲师，硕士，从事森林培育和水土保持研究。 E-mail: yzj1208@163.com
觹 通讯作者 Author for correspondence． E-mail: zjchchenh@163.com
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2013.01.022
果 树 学 报 30 卷
再生体系的研究， 旨在为遗传改良研究提供基础和
进一步加快锥栗优良品种的推广应用。
1 材料和方法
1.1 材料
14 个锥栗品种均来自福建省建瓯市水源乡，每
份材料采集健康饱满的种子 200粒。
1.2 方法
1.2.1 无菌外植体的建立 将锥栗种子放在流水中
冲洗 10 min，剥去果壳，取出种仁，经 70％ 酒精浸润
30s 左右，移到含有吐温 80 的 0.2％HgCI2溶液中消
毒 8 min，接着用无菌水摇洗 4～5 遍，每次摇洗时间
不少于 1 min，放到灭菌滤纸上，吸干表面水分[5]。 在
超净工作台上用解剖刀切开种仁， 取出种胚接种到
初代培养基上。
1.2.2 基因型筛选 将 14 个供试材料（表 1）的成
熟胚为材料，消毒后，接种于 MS+BA1 mg·L-1+NAA
0.5 mg·L-1培养基中[5]，其中蔗糖 40 g·L-1，琼脂 7g·L-1，
pH为 5.5。每处理接 50个外植体，重复 3次。接种材
料置于温度 （26±1）℃，空气相对湿度 50％~60％，光
照 12 h·d-1，光照度为 1 500~2 000 lx。 30 d后统计分
化率，观察材料状态。
表 1 基因型对锥栗不定芽诱导的影响
Table 1 Effect of genotype on the bud induction of Castanea henryi
品种
Varieties
接种外殖体数
No. of explants
分化外殖体数
No. of explants with buds
分化率
Rate of the differentiation/%
长势
Bud qaulity
邮筒子 You-tong-zi
油榛 You-zhen
黄榛 Huang-zhen
大尖嘴 Da-jian-zui
油栗子 You-li-zi
白露子 Bai-lu-zi
中尖嘴 Zhong-jian-zui
乌榛 Wu-zhen
乌壳长芒 Wu-ke-chang-mang
欧宁子 Ou-ning-zi
坝头子 Ba-tou-zi
处署红 Chu-shu-hong
穗榛 Sui-zhen
毛榛 Mao-zhen
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
21
36
33
33
22
13
23
32
22
9
6
30
19
26
42
72
66
66
44
26
46
64
44
18
12
60
38
52
中 Moderate
良 Good
良 Good
中 Moderate
优 Excellent
中 Moderate
良 Good
优 Excellent
良 Good
差 Poor
差 Poor
差 Poor
良 Good
中 Moderate
1.2.3 基本培养基 以油榛的成熟胚为材料， 消毒
后，接种于按无机盐和有机盐含量高低选取 White、
WPM、MS、1/2MS（1/2 的大量元素）、改良 MS 以及 M
（NH4NO3 804 mg·L-1+ KNO3 1 011 mg·L-1+ FeSO4·
H2O 27.8 mg·L-1+ 1/2MS 其余无机盐 + MS 有机） 这
6 种基本培养基作为锥栗胚诱导、分化、增殖的基本
培养基，分别加入激素 BA 1 mg·L-1和 NAA 0.5 mg·
L-1，其余条件同上。 1个月后观察。
1.2.4 丛生芽诱导 以油榛的成熟胚为材料， 消毒
后，取无菌胚接种于培养基上。基本培养基为 M，添加
不同的分裂素浓度 6-BA（1、2 、0.5 mg·L-1），不同类
型的生长素 （IAA、NAA、IBA） 及不同浓度的 IBA
（0.1、0.2、0.5 mg·L-1）[4] 进行组合实验。 其余条件同
上。 1个月后观察。
1.2.5 不定芽的增殖 将初代培养的芽长至 5~6个
叶芽时，分割，接入增殖培养基。 以 M 为基本培养，
蔗糖 30 g·L-1、 琼脂 6 g·L-1，pH 5.5， 附加 6-BA
（0.25、0.5、1 mg·L-1）、IBA （0.1、0.2、0.3 mg·L-1）、0.1
mg·L-1（IAA、NAA、IBA）进行激素组合实验。 培养条
件同上。 观察记录，30 d后继代 1次。
1.2.6 生根培养 不定芽伸长至 2.0～3.0 cm 时自基
部切下，移至生根培养基。 基本培养基为 White、1/2
MS、M。蔗糖 30 g·L-1，琼脂 6 g·L-1， pH5.5，附加 IBA
（0.3、0.5、0.7 mg·L-1）、0.5 mg·L-1（IAA、NAA、IBA）、0.1
mg·L-1 6-BA进行组合实验。培养条件同上。培养 30
d 后，记录试验结果，观察记录每个组合不定芽的生
根状况及芽的生长反应情况。生根率（%）=生根苗数
量/外植体数量×100。
1.2.7 炼苗及移栽 移栽时选择粗壮、均一、长势好，
无变异的试管苗， 先移到自然光的环境中炼苗 2 d，
再开口炼苗 2 d后移栽。 在瓶内倒入适量清水，摇动
使培养基与幼苗分离，用镊子把幼苗取出，迅速用水
冲洗粘附在根部的培养基，移植于沙质中，用 1/2MS
溶液保湿培养 15 d 后，移栽到营养土中正常栽培管
理。
2 结果与分析
2.1 基因型对锥栗不定芽诱导的影响
106
1 期 杨志坚等: 锥栗植株再生体系的建立
表 2 基本培养基对锥栗不定芽的影响
Table 2 Effect of basic medium on adventitious
buds of Castanea henryi
表 3 不同激素组合对锥栗不定芽诱导的影响
Table 3 Effect of combinations of hormone on adventitious
buds of Castanea henryi
表 4 不同激素组合对锥栗不定芽增殖的影响
Table 4 Effect of combinations of hormone on bud proliferation of Castanea henryi
将 14 个供试材料的胚外植体消毒后， 接种于
MS+BA1 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1分化培养基中， 7 d
左右外植体膨大，14 d左右可见绿色的芽点 （图版-
A），1 个月后 14 个品种的芽分化率为 0.12～0.72，品
种之间存在着明显差异（表 1），长势见（图版-B）。
‘坝头子’、‘欧宁子’、‘处署红’ 的长势最差，‘油栗
子’、‘乌榛’长势在 14个品种中最好。综合外植体分
化率和长势，得出‘油榛’是最好的实验材料。
2.2 基本培养基对锥栗不定芽的影响
以‘油榛’胚为材料，选用附加激素的 6 种培养
基进行培养，1 个月后进行统计（表 2）发现，芽分化
率 0.32~0.84，差异明显。 同时分化出的不定芽长势
差异也较大，White、1/2MS 培养基芽势弱，MS 分化
出的不定芽壮且伴有大量愈伤组织生长，WPM、改
良 MS 褐变严重，M 培养基分化出的不定芽壮，但伴
有少量愈伤组织。
2.3 不同激素组合对锥栗不定芽分化诱导的影响
以‘油榛’的胚为材料，以 M 为基本培养基，分
别附加不同激素组合进行不定芽诱导，每处理 50 个
外植体。 1 个月后观察不定芽分化率 （表 3）， 1.0
mg·L-1 6-BA与 0.5 mg·L-1 IBA 组合时分化率最高，
其次分别为 0.5 mg·L-1 NAA 和 0.5 mg·L-1 IAA。 在
IBA 为 0.5 mg·L-1，2 mg·L-1 的 6-BA 分化率高于 1
mg·L-1的 6-BA 的分化率。 在 6-BA 为 2.0 mg·L-1，
IBA 为 0.2 mg·L-1时， 胚不定芽分化率最高， 达到
92%。
故不定芽分化的培养基为 M+6-BA 2.0 mg·L-1+
IBA 0.2 mg·L-1+蔗糖 4.0%+琼脂粉 0.6%，pH 5.5。
2.4 不同激素组合对锥栗不定芽的增殖的影响
将不定芽分别接种含有不同激素种类及其配比
的 M 培养基中，进行增殖实验，每个处理 50 个外植
体，一个月后观察（图版-C，D，表 4）。 各个处理之间
的增殖倍数变化幅度大，为 1~18，其中倍数最高的
是 6-BA 0.5 mg·L-1和 IBA 0.1 mg·L-1的组合。 从生
长状况看，不同类型的生长素对芽生长影响不同，
IBA增殖的芽正常，IAA促进节间伸长，NAA有利于
根毛分化；高浓度的分裂素促进愈伤形成；适当浓度
的 IBA有利于不定芽的增殖。
培养基
Cultivation
substance
接种总数
No. of explants
出芽数量
No. of explants
with buds
出芽率
Rate of the
differentiation/%
White
WPM
MS
1/2MS
MS modified
M
50
50
50
50
50
50
31
25
36
21
16
38
62
50
72
42
32
76
激素 Hormone/（mg·L-1） 分化率
Rate of the
differentiation/%6-BA IAA NAA IBA
1
1
1
2
2
2
0.5
0.5
0.5
0.5
0.2
0.1
76
64
80
84
92
58
激素
Hormone/（mg·L-1）
增殖倍数
Times of
proliferated
生长情况
Growth situation of shoot
6-BA IAA NAA IBA
1
1
1
0.5
0.5
0.5
0.2
0.2
0.2
0.2
0.1
0.05
3
1
6
5
18
1
基部愈伤水泽状，芽节间长
The water-soaked callus induced from the base of shoots, long internode
基部愈伤分化根毛，芽正常
Root hairs differentiated from the base of callus，normal shoots
基部愈伤浅黄色，芽正常
The light yellow callus induced from the base of shoots, normal shoots
无愈伤，芽正常
No callus, normal shoot
无愈伤，基部与叶腋都有大量不定芽
No callus, a lot of adventitious buds from the base and the leaf axil of shoots
无愈伤，叶子鳞状
No callus, scalelike leaves
故芽增殖的最优培养基为 M+6-BA0.5 mg·L-1+
IBA 0.1 mg·L-1+蔗糖 3.0%+琼脂粉 0.6%，pH 5.5。
2.5 不同激素组合对锥栗不定芽的生根的影响
将不定芽分别接种 M基本培养基中，每处理 50
107
果 树 学 报 30 卷
表 5 不同激素组合对锥栗不定芽诱根的影响
Table 5 Effect of combinations of hormone on rooting of Castanea henryi
个外植体。 15 d 左右不定根开始形成，1 个月后形
成发达根系（图版-E，F），并观察其生根率和根的生
长状况（表 5）。从整体上看，锥栗的生根率比较低。3
种基本培养基生根率最高的是 M，其次是 1/2MS，最
低的是 White 基本培养基， 为 0。 从根的生长状况
看，M基本培养基生根质量最好。 在锥栗生根中，分
裂素起抑制作用，生根率为 0。 3种生长素的生根作
用存在着差异，生根率最高的是 IBA，且根系质量也
最好；最低的是 NAA为 0.12。 不同浓度 IBA对生根
影响也有明显差异， 过高或过低都不利于锥栗不定
编号
The No.
培养基配方
The medium
生根率
Rooting rate/%
根的生长状况
The growth situation of the root
1
2
3
4
5
6
7
8
M+IBA 0.3 mg·L-1
M+IBA 0.5 mg·L-1
M+IBA 0.7 mg·L-1
M+6-BA 0.1 mg·L-1+IBA0.5 mg·L-1
M+IAA 0.5 mg·L-1
M+NAA 0.5 mg·L-1
White+IBA 0.5 mg·L-1
1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1
27
48
9
0
42
12
0
32
+ +
+ + +
+
+ +
+ +
+ +
注： + 根纤弱； + + 根正常； + + + 根粗壮。
Note: + The frail root； + + The normal root； + + + The thick root.
芽的生根。
综上所述，最优生根培养基是M+IBA0.5 mg·L-1+
蔗糖 3.0%+琼脂粉 0.6%，pH 5.5。
2.6 移栽成苗
移栽时，选择根长 3 cm 左右，粗壮、均一、长势
好，无变异的试管苗，先移到自然光的环境中炼苗 2
d，再开口炼苗 2 d后移栽。 在瓶内倒入适量清水，摇
动使培养基与幼苗分离，用镊子把幼苗取出，迅速用
水冲洗根部，移植于沙质中（图版-G），用 1/2MS 溶
液保湿培养 15 d 后， 移栽到营养土中正常栽培管
理。 成活率 75%。
3 讨 论
前人[6-8]报道，基因型的选择对于能否获得再生
植株十分重要。 本研究得到，以胚为外植体，锥栗不
同品种在不定芽诱导和分化中存在明显差异。 ‘油榛’
分化率最高，达到 0.72；‘坝头子’最低，仅为 0.12。这
是因为锥栗不同品种遗传控制再生能力或对诱导条
件的要求不同存在差异[9]，从而造成了不同基因型供
体植株发育状态的差异。
基本培养基是植物组织培养重要的基质， 由于
各种植物的遗传特性， 生物学特性和生态学特性不
一样，因而各种植物需求的营养成分也不尽相同，对
培养基成分要求也有差异 [10]，同时器官发生的不同
时期对培养基的要求是不一样的 [11]。 本课题组在锥
栗组织培养初期得出， 适合锥栗胚分化的基本培养
基是 White[4]，但本次试验得出锥栗组织培养最适宜
的基本培养基为 M。 这是因为虽然 White 基本培养
基中的分化率很高， 但芽的质量不好， 有可能是
White 基本培养基中无机盐含量低有利于胚分化，
有机质含量不高造成芽生长不好。 而 M基本培养基
用有机质含量高的 MS 作基础降低大量元素含量，
即 NH4NO3 804 mg·L-1+ KNO31011 mg·L-1 + FeSO4·
H2O 27.8 mg·L-1+ 1/2MS 其余无机盐 + MS 有机。 因
此是最适宜的基本培养基是 M。 同时也说明锥栗组
培适合于总盐量中等及铵态氮和硝态氨的比值为 1
的培养基。
在木本植物器官发生过程中， 细胞分裂素和生
长素对芽的诱导和生长发育均起着重要的作用，一
般诱导不定芽的形成时细胞分裂素高于生长素的用
量或只用细胞分裂素； 而诱导不定根发生只用生长
素或配合使用较低浓度的细胞分裂素 [12]。 本试验结
果也类似，芽分化中 6-BA 2.0 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1
组合效果好，芽增殖实验中 6-BA0.5 mg·L-1+IBA 0.1
mg·L-1的组合效果最好。 生根激素 IBA0.5 mg·L-1。
在激素配比中， 分裂素与生长素的比例为 10 时，锥
栗分化不定芽效果最好； 比例为 5时， 增殖效果最
好；但分裂素对锥栗不定芽生根有抑制作用。这有可
能是因为随着继代次数的增多， 激素的含量和比例
相对降低[13-14]，且由于有不同种类植物激素的生理效
应相互促进和相互拮抗，影响植物生理生化的合成、
运输、 代谢及效应导致每一个培养阶段只需一定范
围的浓度和配比 [15]。 在 6-BA 与不同类型的生长素
组合中，IBA 对锥栗组织培养效果最好 ， 其次是
NAA，最后是 IAA。 这也许是 IAA是一种内源激素，
在外界环境中易分解的原因[16-17]。
108
1 期 杨志坚等: 锥栗植株再生体系的建立
在锥栗组织培养研究过程中也存在一些问题。
首先锥栗不定芽分化率不高。 这有可能是因为锥栗
为多年生的木本植物，次生代谢旺盛且复杂，易导致
组培过程中发生褐变。 本实验通过基因型选择和基
本培养基中大量元素的调节， 在保证有效的控制褐
变的前题下，提高不定芽分化率。 其次生根率低，是
因为锥栗本身就是难生根的物种[1]，而且对于木本成
年树来说， 不定芽生根的问题是整个培养过程中最
难克服的[18]。 （本文图版见插 3）
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