全 文 ：湖南林业科技　2007年第 34卷第 4期 研究报告
收稿日期:2007— 04 — 16
修订日期:2007— 05 — 23
基金项目:湖南省科技厅攻关重点项目 “速生乡土阔叶树新品
种(系)选育关键技术研究 ”(编号:06FJ3004)
作者简介:李　贵 (1980-),女 ,硕士 , 主要研究方向为植物生
理及植物组培。
椿叶花椒组织培养增殖初探
李　贵1 , 李志辉 1 , 童方平2 , 易霭琴 2 , 宋庆安2
(1.中南林业科技大学 , 湖南 长沙　410004;　 2.湖南省林业科学院 , 湖南 长沙　410004)
摘　要:以椿叶花椒带腋芽的茎段为外植体 , 进行椿叶花椒组织培养与快速繁殖技术研究 , 筛选出最佳消毒方法为
0.1%升汞消毒 6min,最佳基本培养基为 WPM, 最佳增殖培养基为 WPM+6-BA0.2mg· L-1 +IBA0.1mg· L-1 +
NAA0.1mg· L-1 ,其增殖效果最好 , 培养 30d, 增殖倍数达到 3.5以上;并分析了激素配比对椿叶花椒组培苗增殖的
影响。
关键词:椿叶花椒;组织培养;外植体;增殖;诱导
中图分类号:S722.3+7　　　文献标识码:A　　　文章编号:1003— 5710(2007)04— 0017— 03
ApreliminaryresearchontissuecultureofZanthoxylum
ailanthoidesSieb.etZuce.
LIGui1 , LIZhihui1 , TONGFanngping2 , YIAiqin2 , SONGQingan2
(1.GentralSouthUniversityofForestryandTechnology, Changsha410004, China;
2.HunanForestryAcademy, Changsha410004, China)
Abstract:UsingthecaulissegmentwithaxillarybudofZ.ailanthoidesSieb.etZuce.explant, thetisuecultureoftheZ.ail-
anthoidesSieb.etZuce.andbreedquicklytechnologywerestudied.Theresultsshowedthat:Thebeststerlizedmethod
wasusing0.1%Lmercuryin6 min, andWPM+6-BA0.2mg·L-1 +IBA10.1mg· L-1 +NAA0.1mg· L-1is
thebestpropagatedevelopment, culture30d, propagatemultipletoabove3.5.Theinfluenceinthepropagateofthe
tissuecultureofZ.ailanthoidesSieb.etZucebydiferenthormonemixwereanalizedinthepaper.
Keywords:ZanthoxylumailanthoidesSieb.etZuce.;tissueculture;explant;propagate;induction
　　椿叶花椒 (Zanthoxylum ailanthoidesSieb.et
Zuce.)为芳香科木本植物 ,同时也是经济价值较高的
树种 ,其果皮可作调料 ,种子可榨油 ,根 、茎 、叶 、果皮 、
种子均可入药 ,是我国传统的高价值中药。椿叶花椒
是一种典型的速生珍贵阔叶树种 ,落叶乔木 ,树干有
乳凸锐刺 ,锐刺随树干长大而长大 [ 1] 。生产上主要是
以有性繁殖为主 ,造成其品质退化 ,生长缓慢 ,株间整
齐度差。通过组培生产的椿叶花椒苗木 ,造林后生长
迅速 ,林相整齐 ,对生产具有现实意义。
关于花椒的组织培养国内已有先例 ,如许继宏和
杨云龙研究过花椒的组织培养 [ 2-3] ;林艳 ,毕君 [ 4]等
发表过有关日本花椒组培的论文;朝仓花椒和山椒组
织培养也有报道 [ 5-6] ,但椿叶花椒的组织培养还未见
报道。为此 ,作者利用现有研究基础 ,进行了花椒离
体组培快繁研究 ,已获得完整植株。并对椿叶花椒组
织培养的增殖因素等进行试验与分析 ,为该树种的组
培增殖研究和生产提供了理论依据。
1　材料与方法
1.1　试验材料及处理
选用中南林业科技大学株洲校区经济林苗圃内
椿叶花椒幼苗与 1年生嫩梢作为外植体 。切取嫩枝 ,
用自来水冲洗 10min,切割成带腋芽的小茎段 ,用低
浓度的洗洁精溶液清洗 2 ～ 3遍 ,再在流水下冲洗
15min,然后用无菌水清洗干净。
1.2　培养基的制备
李　贵 ,等:椿叶花椒组织培养增殖初探
初代诱导分化培养基:WPM +BA2.5 mg·L-1
+NAA2mg·L-1 +IBA1mg·L-1;
增殖培养基:以 WPM为基本培养基 ,附加不同
浓度的细胞分裂素与生长素(见表 3、表 9、表 10);
以上培养基蔗糖浓度均为 3%, 琼脂浓度为
0.8%,培养基 pH值为 5.8。
1.3　培养条件
培养室温度为 23 ～ 26℃,采用日光灯培养 ,光照
强度为 1 500 ～ 2 000lx,光照时数为 14h/d。
2　结果与分析
2.1　外植体消毒时间的筛选
外植体清洗干净以后 ,在无菌条件下于超净工作
台上先用 70%酒精消毒 30s,再用 0.1%升汞消毒 3、
6、8min,再用无菌水冲洗 5 ～ 6遍 ,然后切取 1cm左
右带腋牙茎段 ,接种到不加任何激素的 MS培养基
上 , 25 ～ 30d后观察不同消毒时间获得无菌外植体的
情况(见表 1)。表 1结果表明 , 0.1%升汞消毒 6min
效果最好 ,无菌外植体获得率为 50%。
表 1　不同消毒时间对获得无菌外植体的影响
消毒时间
(min)
污染芽数
(个)
死亡芽数
(个)
污染率
(%)
死亡率
(%)
无菌外植体
获得率(%)
3 19 7 63.3 23.3 13.4
6 10 5 33.3 16.7 50
8 5 18 16.7 60 23.3
　　注:接种芽数均为 30个 ,培养时间均为 30d。
2.2　基本培养基的筛选
外植体接种后经过 25 ～ 30d培养 ,获得无菌外植
体以后 ,将外植体接种到 4种基本培养基(均添加 6—
BA2.0mg·L-1 , IBA0.1mg·L-1)上(见表 2),进行
芽的诱导 ,经过 25 ～ 30d的诱导培养 ,调查各培养基
上的增殖芽数和芽的生长量。表 2结果表明 , MS和
WPM2种基本培养基比较适合椿叶花椒的生长 ,但
是 ,在 MS培养基上 ,组培苗虽然高生长比较好 ,但苗
太细太弱 ,不利于继代培养;而在 WPM培养基 ,增殖
倍数高 ,达到 116.7%,组培苗的生长状况最好 ,最高
苗高达 3.5cm。
表 2　不同基本培养基对增殖率的影响
基本
培养基
增殖芽数
(个)
增殖芽最高
(cm) 生长状况
增殖倍数
(%)
综合
指标
MS 32 3.0 叶绿苗细 106.7 +
WPM 35 3.5 叶绿苗粗 116.7 ++
B5 28 2.8 叶绿苗细 93.3 +
White 29 2.5 叶绿苗细 96.7 +
　　注:接种芽数均为 30个 ,接种芽高均为 1.0cm。
2.3　激素配比对椿叶花椒组培苗增殖的影响
选取无菌粗壮茎芽 ,切成 1cm左右的带顶芽或
腋芽的茎段 ,接种到附加不同激素配比的 WPM培养
基上 ,试验因素及其水平设计见表 3,实验设计及试
验结果见表 4。
方差分析结果表明(表 7、表 8), BA对椿叶花椒
组培的增殖率有显著性影响 , NAA和 IBA对椿叶花
椒组培的苗高增量有显著性影响。极差 R愈大的因
素对指标的影响愈显著 ,从表 5、表 6可知增殖率的 R
值以 BA的最大 ,苗高增量的 R值以 NAA和 IBA的
最大 , 增殖增养基最佳组合为 L1(BA0.5+NAA0.5
+IBA0.5)。可见对椿叶花椒组培的增殖和苗高的
影响以 BA、NAA和 IBA为主要影响因素 , BA对增殖
的数量起主要作用 , NAA和 IBA对苗高生长起主要
作用。
表 3　试验因素及其水平设计 (mg· L-1)
水平 因　　素BA NAA IBA
1 0.5 0.5 0.5
2 1.0 1.0 1.0
3 1.2 1.2 1.2
表 4　实验设计及结果
实验号 BA NAA IBA 增殖倍数 苗高(cm)
L1 1 1 1 3.03 2.7
L2 1 2 2 2.69 2.1
L3 1 3 3 2.34 2.0
L4 2 1 2 2.33 2.6
L5 2 2 3 1.76 1.8
L6 2 3 1 2.46 2.2
L7 3 1 3 2.18 2.2
L8 3 2 1 2.25 2.3
L9 3 3 2 1.78 2.0
表 5　增殖倍数离差平方和的计算
BA NAA IBA
K1 8.062 5 7.545 833 7.741 66667
K2 6.547 421 6.696 032 6.794 44444
K3 6.2 6.568 056 6.273 80952
k1 2.687 5 2.515 278 2.580 55556
k2 2.182 474 2.232 011 2.264 81481
k3 2.066 667 2.189 352 2.091 26984
R 0.620 833 0.325 926 0.489 28571
表 6　苗高离差平方和的计算
BA NAA IBA
K1 6.791667 7.458 333 7.208 33333
K2 6.5 6.166 667 6.666 6666 7
K3 6.5 6.166 667 5.916 66667
k1 2.263889 2.486 111 2.402 77778
k2 2.166667 2.055 556 2.222 22222
k3 2.166667 2.055 556 1.972 22222
R 0.097222 0.430 556 0.430 55556
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研究报告　　　
表 7　增殖倍数方差分析表
变差来源 离差平方和 自由度 均方 F值
A=BA 0.653 897 2 0.326 948 49 6.647 228 49
B=NAA 0.188 288 2 0.094 143 89 1.914 050 59
C=IBA 0.369 211 2 0.184 605 29 3.753 232 05
e　 0.098 371 2 0.049 185 69
总和　 1.309 767 8
　　注:F
0.05 =4.46, F0.01 =8.65,表 8同。
表 8　苗高方差分析表
变差来源 离差平方和 自由度 均方 F值
A=BA 0.018 904 2 0.009 452 16 0.368 421 05
B=NAA 0.370 756 2 0.185 378 09 7.225 563 91
C=IBA 0.280 478 2 0.140 239 2 5.466 165 41
e 0.051 312 2 0.025 655 86
总和　 0.721 451 8
2.4　增殖最佳培养基的筛选
随着继代培养次数的增多 ,继代培养的组培苗出
现退化现象 ,愈伤组织生长旺盛 、分化快 ,但培养出来
的苗纤细且部分呈现玻璃化现象。所以细胞分裂素
与生长素的比例需要再调整。为此 ,选取健壮组培苗
为试材 ,做单因子实验 ,分别接种于附加相同生长素 ,
不同细胞分裂素水平的培养基上(表 9)。
培养 30d后 ,细胞分裂素浓度为 0.2mg/L的培
养基内增殖最佳 ,增殖倍数达到 3.6,增殖芽最高达
3.5cm,且组培苗生长健壮。在此基础上选取健壮组
培苗分别接种于附加相同细胞分裂素 、不同生长素水
平的培养基上(见表 10)。
培养 30 d后 ,细胞分裂素与生长素的比例为 1∶1
的组合 ,即培养基 WPM+6-BA0.2 mg/L+IBA0.1
表 9　细胞分裂素 BA对增殖率的影响
生长素种类及浓度(mg· L-1) 接种芽数(个) 增殖芽数(个)增殖芽最高 (cm) 生长状况 增殖倍数 综合指标
BA0.5+IBA0.5+NAA0.5 40 142 3.2 叶绿苗细 3.55 ++
BA0.4+IBA0.5+NAA0.5 40 138 3.1 叶绿苗细 2.45 ++
BA0.2+IBA0.5+NAA0.5 40 144 3.5 叶绿苗粗 3.6 +++
BA0.1+IBA0.5+NAA0.5 40 136 1.8 叶黄苗粗 3.4 ++
表 10　不同生长素及其不同浓度对增殖率的影响
生长素种类及浓度(mg· L-1) 接种芽数(个) 增殖芽数(个)增殖芽最高 (cm) 生长状况 增殖倍数 综合指标
BA0.2+IBA0.5+NAA0.2 50 178 3.2 叶绿苗细 3.54 ++
BA0.2+IBA0.2+NAA0.5 50 165 3.1 叶绿苗细 3.3 ++
BA0.2+IBA0.1+NAA0.1 50 182 3.8 叶绿苗粗 3.64 +++
BA0.2+IBA0.5+NAA0.5 50 145 2.6 叶黄苗细 2.9 ++
BA0.2+IBA0.2+NAA0.2 50 170 3.3 叶黄苗粗 3.4 ++
mg/L+NAA0.1mg/L为椿叶花椒增殖最佳培养基 ,
增殖倍数达到 3.64,增殖芽最高为 3.8cm,且组培苗
生长健壮。
3　讨论
(1)春季是植物生长旺盛的季节 ,选择春季采
样 ,有利于无菌外植体的获得及组培苗的快速生长与
分化 。同时 ,春季也是细菌滋生的季节 ,因此初代培
养时灭菌就比较难以控制 ,时间太长容易杀死外植
体 ,太短又不足以杀死细菌达不到灭菌效果。椿叶花
椒当年生的顶芽其木质化程度比较高 ,且外被硬刺 ,
灭菌时难度稍大一点 ,采用低浓度的洗洁精溶液清洗
外植体可以提高无菌外植体的获得率。
(2)植物生长调节剂的种类和浓度对椿叶花椒
的诱导和分化有较大影响 , WPM+6-BA0.2mg/L
+IBA0.1mg/L+NAA0.1mg/L激素组合最适合椿
叶花椒芽的分化与生长 ,增殖芽最高达到了 3.5cm,
增殖倍数达到了 3.6。
(3)采取以下方法可有效控制玻璃化:增加琼
脂浓度 ,提高培养基的硬度 ,减少水分吸收;将做好的
培养基放置一段时间以降低其湿度 ,等到表面不再有
积水再接种;增强光照 ,适当降低培养室内温度;正确
调配培养基中激素比例 ,降低培养基中细胞分裂素的
用量。
参考文献:
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