全 文 ：甜瓜茎尖法遗传转化体系的建立
高 鹏，王学征，纪雪岩，栾非时*
（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）
摘 要：利用甜瓜材料“M-23”建立一种有效的、不依赖于组织培养的农杆菌介导甜瓜遗传转化体系，该遗传
转化体系利用甜瓜植株茎尖组织作为受体材料，避免传统组织培养获得转化植株周期长、工作量大以及无菌操作
要求高的缺陷，可在受体材料后代中直接筛选出转基因品系。研究优化了转化流程中的各项参数，并将CmACS-7
基因连入pBI121载体对甜瓜进行遗传转化，对转基因后代种子的PCR检测和Southern杂交结果表明本转化体系转
化率为8%。
关键词：甜瓜；遗传转化；茎尖；农杆菌介导
中图分类号：S652；Q812 文献标志码：A 文章编号：1005-9369（2013）10-0056-05
高鹏,王学征,纪雪岩,等.甜瓜茎尖法遗传转化体系的建立[J].东北农业大学学报, 2013, 44(10): 56-60.
Gao Peng, Wang Xuezheng, Ji Xueyan, et al. Establishment of melon shoot apex genetic transformation system[J]. Journal
of Northeast Agricultural University, 2013, 44(10): 56-60. (in Chinese with English abstract)
Establishment of melon shoot apex genetic transformation system/GAO
Peng, WANG Xuezheng, JI Xueyan, LUAN Feishi(School of Horticulture, Northeast Agricultural
University, Harbin 150030, China)
Abstract: An efficient and organ culture independent melon Agrobacterium- mediated genetic
transformation protocol was developed by melon line M- 23 in this study, this genetic transformation
system used shoot apex tissue as Agrobacterium receptor tissue, thus avoiding the traditional tissue
culture methods limitations, such as long cycle, big workload and sterile operation. Transgenic plant
could be gained directly in descendants of receptor materials by transgenic screening. This study
optimized various parameters of the transformation process. And pBI121 vector containing CmACS-7
gene was transformed into melon material M- 23, PCR detection and Southern hybridization of trans-
genic offspring seeds results showed that the transformation frequency of this transformation system
was 8%.
Key words: melon; genetic transform; shoot apex; Agrobacterium-mediated
基因工程手段是改良作物性状的有效途径，
有关甜瓜遗传转化的研究比较少，农杆菌介导法
是双子叶植物遗传转化的主要方法，但常规利用
外植体进行农杆菌侵染的方式获得转基因再生甜
瓜植株的成功率较低，有学者认为主要是因农杆
菌侵染造成甜瓜外植体分生组织解体，因此开发
新的甜瓜遗传转化途径很有必要[1]。植物茎尖生长
点是能发育成地上部分完整器官或组织的原始细
收稿日期：2013-04-28
基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12511042）
作者简介：高鹏（1982-），男，助理研究员，博士，研究方向为西甜瓜分子育种。E-mail: gaopeng.neau@gmail. com
*通讯作者：栾非时，教授，博士生导师，研究方向为西甜瓜分子育种。E-mail: luanfeishi@sina. com
Journal of Northeast Agricultural University
东 北 农 业 大 学 学 报第44卷第10期 44(10): 56~60
2013年10月 Oct. 2013
网络出版时间 2013-10-28 14:11:03 [URL] http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20131028.1411.011.html
胞群。因此，以植物茎尖生长点作为遗传转化受
体材料时，可有效解决依赖植物组织培养存在
的基因型依赖，无菌条件的限制，而且一般也
不受季节限制。将茎尖外植体直接作为受体材
料，与农杆菌介导的转化方法相结合，不仅可以
解决植物组织培养过程中存在的问题，还可以简
化繁琐的操作过程，也能获得更多的抗性转化植
株。近年来，国内外一些学者都利用茎尖或茎
尖分生组织结合农杆菌介导法，获得转基因再
生植株[2-4]。
本研究旨在利用农杆菌介导茎尖不定芽法建
立一套高效、稳定的甜瓜遗传转化体系，以期获
得新的甜瓜转基因种质资源，为解决生产中的实
际问题奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于2011年3~12月在东北农业大学西甜瓜
分子育种实验室进行。供试甜瓜品系 M- 23、
WQ、M76、M19均来自东北农业大学西甜瓜分子
育种实验室，分别编号为品系 1、品系 2、品系 3、
品系4。
植物表达载体为pBI121（含有NPT-II抗性筛选
标记以及 CmACS-7基因），农杆菌工程菌株为
EHA105。
Taq酶等酶试剂购自 TaKaRa公司，主要化学
试剂为国产分析纯。
农杆菌重悬液，MS：1/3MS+1.5 mg·L-1 6-BA+
0.05% Silwet L-77。
不定芽诱导液，MS1：1/2MS+2.0 mg·L-1 6-
BA+0.05% Silwet L-77。
1.2 方法
1.2.1 甜瓜叶片敏感性试验
选取 100粒饱满的种子，55~60 ℃水中浸泡，
并不断用玻璃棒搅拌，至水温为室温后浸泡 12 h，
然后播种到营养钵中，待2 d后，于两片子叶未完
全展开前，用手术刀刮除其侧芽与顶芽，在保持
子叶合拢情况下，轻划出3道划伤。对长出的真叶
分别编号，然后涂抹 Km，同时设对照。卡那霉
素 + 0.05% Silwet L- 77， 8 个 Km 梯 度 浓 度
分别为 0、1 000、2 000、3 000、4 000、5 000、
6 000、8 000 mg·L-1。对分化后伸长的叶进行涂
抹，毛笔蘸取溶液涂抹到相应叶子表面，抗生素
溶液每个浓度涂抹20株，连续3 d每天涂抹1次共
3次，最后 1次涂抹的于第 9天观察记录叶子黄化
程度。
参考祝建波等方法 [4]，将甜瓜叶片对Km处理
的黄化程度划分为6个等级：
1级：与对照组相比，叶色仍为绿色，叶片无
明显斑点。
2级：叶色变浅，叶片上斑点较明显。
3级：叶片无褶皱现象，叶片上斑点为黄色。
4级：叶片上出现枯斑，并且枯斑面积不超过
整个叶片面积的一半。
5级：叶柄正常生长，正常叶片面积一半以上
干枯褶皱。
6级：整个叶片及叶柄全部干枯。
1.2.2 受体材料准备
材料处理方法同 1.2.1，作为侵染受体并划
伤，进行滴加诱导液，诱导液 6-BA浓度为 0.5、
1、1.5、2、2.5 mg·L-1。农杆菌侵染，受体材料准
备同上，然后滴加浸染液，进行暗培养2 d后，然
后见光培养，每天滴加诱导液。液体培养基培养
农杆菌至OD600为0.6~0.8时，离心获得农杆菌菌体
并用重悬液重悬菌体。将重悬菌液小心滴入受体
材料子叶缝隙处，24 h后再滴加一次，滴加间隙以
及滴加后2 d需要保湿培养。农杆菌侵染后，暗培
养 2 d，隔天在伤口处滴加芽诱导液，诱导不定芽
分化生长。
1.2.3 转基因植株鉴定
采用甜瓜改良CTAB法提取基因组DNA[5]，利
用外源基因特异引物进行 PCR检测扩增引物序列
如下：
5 TTCAACAAATCTTCAGTTCAATTTCTCTC 3
5 GAAAACAAGGATTTCTTTTTCTTTTTCCTCA
G 3
PCR反应体系：50 μL PCR反应体系，其中模
板 DNA 1 μL， 10 × PCR Buffer 5 μL， dNTP（10
mmol·L- 1）2 μL，上、下游引物（10 mmol·L- 1）各
2 μL，Taq酶（5 U·μL-1）3 μL，ddH2O 35 μL。
PCR反应程序：95 °C预变性，7 min，95 ℃变
性 50 s，57 ℃ 退火，30 s，72 ℃延伸，50 s 72 ℃
延伸，7 min，30个循环。PCR产物用浓度为1%琼
脂糖凝胶进行电泳检测。选取部分 PCR阳性植株
高 鹏等：甜瓜茎尖法遗传转化体系的建立第10期 · 57 ·
2.2 不同激素浓度芽诱导率比较
由表 2可知，随着 6-BA浓度的增加，虽然能
生长分化很多不定芽，不定芽的分化数目显著增
多，分化率均在90%以上，但如果伤口过大，难以
分化，伤口过小，幼芽切除不彻底，在浓度增加
到 1.5 mg·L-1，不定芽分化较多，但芽的伸长相对
较快，而 2.5 mg·L-1时，虽然不定芽数目较多，但
显著抑制芽的伸长，大部分不定芽不伸长，造成
后期死亡，而且根生长受到抑制。因此确定激素
使用浓度为1.5 mg·L-1。
2.3 不同基因型甜瓜分化率比较
现有甜瓜转基因方法往往受到甜瓜基因型
的限制，仅有少数甜瓜品种适合利用传统转化
方式，然而很多具有优良性状的品种对传统转
化方式不敏感。为研究基因型对茎尖转化法的
影响，选取 4个甜瓜不同基因型，以甜瓜品系M-
23、WQ、M76、M19为受体材料。每个品系选取
100粒饱满种子，由表 3可知，四个品系的分化率
都很高，4个基因型中M-23分化率较好，达到
91%。M-19分化率最低，也达到 85%，受基因型
影响较少。
品系Inbred
M-16
M-19
M-23
WQ
萌发率（%）Germination rate
100
100
100
100
分化率（%）Differentiation rate
90
85
91
90
表3 不同基因型甜瓜萌发率和分化率比较
Table 3 Comparison of different genotypic
differentiation of germination rate and rate
进行Southern杂交检测，检测方法参见地高辛试剂
盒说明书，根据NPT-II基因序列设计探针，探针
制备引物序列为：F： 5 GAGGCTATTCGGCTAT
GACT 3，R：5 AATCTCGTGATGGCAGGTTG 3。
2 结果与分析
2.1 卡那霉素敏感试验
本试验通过Km对甜瓜叶片影响研究表明，甜
瓜对卡那霉素有一定抗性，但随着卡那霉素浓度
的升高，对其叶片的发生与分化有一定抑制作
用，尤其 6 000 mg·L-1以上卡那霉素处理的表现最
为明显；处理 9 d后，1 000 mg·L-1以上卡那霉素
处理单株完全消除甜瓜叶片自身对卡那霉素抗性
的限度，只有 6 000 mg·L-1以上卡那霉素处理叶片
全部干枯死亡，因此确定致死浓度为 6 000 mg·L-1
（见表1）。
表1 甜瓜自交系M-23叶片对卡那霉素抗性试验
Table 1 Leaves resistance to kanamycin of melon inbred line M-23
表2 不同激素浓度产生不定芽数目的比较
Table 2 Comparison of different hormone concentration
number of adventitious buds
6-BA
（mg·L-1）
0.5
1
1.5
2
2.5
分化率（%）Differentiation rate
90.21
93.22
95.66
97.43
97.84
不定芽数Number of adventitious bud
2.51
4.53
5.03
6.14
7.23
卡那霉素浓度（mg·L-1）Concentration ofkanamycin
8 000
6 000
5 000
4 000
3 000
2 000
1 000
0
处理植株数Number of processingplants
30
30
30
30
30
30
30
30
处理后9 d叶片黄化程度分级Leaf etiolation degree grading 9 d after treatment
0
0
0
0
0
0
1
3
30
1
0
0
0
8
10
20
25
0
2
0
0
2
12
15
4
2
0
3
0
15
8
4
4
5
0
0
4
2
10
10
2
1
0
0
0
5
6
3
5
4
0
0
0
0
6
22
2
5
0
0
0
0
0
黄化程度小于3级的百分数（%）Percentage of etiolationdegree less than level 3
0
0
33.3
80
96
100
100
100
东 北 农 业 大 学 学 报· 58 · 第44卷
3 讨论与结论
随着植物基因工程的发展，农杆菌介导的茎尖
转基因方法的出现使得转基因技术产生突破。茎尖
不定芽方法与其他转基因方法相比，特点如下：
① 不受植物基因型的限制，对于难以再生的植
物，可以顺利地将外源基因导入；②操作方法简
单，无需经过无菌植物组织培养过程，大大降低体
细胞变异的频率；③ 对于昂贵药品和仪器的依
赖性较小；④周期短，可以在较短时期内获得大
量的转化植株，创造大量的突变株，对功能基因
组的研究意义重大。如果能将这种方法成功用于
农作物，将绕过组织培养环节，有利于转基因技术
推广。
利用农杆菌侵染外植体，再通过组织培养获得
转基因甜瓜，所需条件较高，除了需无菌操作环境
外还需要适合外植体再生的人工温度、湿度以及光
照条件；对操作人员的技术要求较高，需熟练掌握
植物组织培养技术；组织培养工作复杂且工作量
大，工作周期长。另外，甜瓜外植体的分化效率受
基因型影响较大，近年来已经有一些学者对甜瓜组
织培养中的外植体选择、培养条件等因素进行探
讨，然而结果显示基因型是影响甜瓜遗传转化效率
的主要因素，针对一个品种的转化体系很难应用到
图2 转化植株的Southern blot检测
Fig. 2 Southern blot analysis of transgenetic melon
1-质粒阳性对照；2-非转基因植株；
3~4-1号转化植株；5~6-2号转化植株
1-Plasmid; 2-Wild type plant; 3-4-Transgenetic
plant No.1; 5-6-Transgenetic plant No.2
1 2 3 4 5 6
2.4 转化植株的获得及分子生物学检测
以甜瓜M-23为受体建立转化体系，选取 100
粒饱满的种子播种于土壤中，对萌发3 d的甜瓜进
行去除顶芽、侧芽处理后进行农杆菌侵染，在农杆
菌侵染后，利用不定芽诱导液进行诱导不定芽的分
化和生长，每 1 d在创口处滴加一次不定芽诱导
液，7~10 d后分化的生长点处膨大，并能不断分化
出不定芽，随着不定芽的生长发育，长势强的芽开
始发育成新的小植株。待新长出的植株三片新叶
时，涂抹 6 000 mg·L-1卡那霉素，然后进行观察。
叶片大面积失绿变黄的为具有卡那霉素抗性表现，
用剪刀从基部去除阴性植株，直至筛选至同一受体
上得到叶片无明显变化的抗性植株。对获得的100
株卡那霉素抗性植株分别编号并取新鲜叶片进行
PCR鉴定，其中 74株检测到目的条带（见图 1）。
PCR阳性率为 74%，在 PCR阳性植株中选取 PCR
结果稳定的植株进行 Southern blot检测，结果表明
外源基因已整合到甜瓜基因组DNA中（见图2）。
2000 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1000 bp750 bp
500 bp
M-Mark 2 kb；1-质粒；2-未转化植株；3~10-转基因植株
M-Marker 2 kb; 1-Plasmid; 2-Wild type plant; 3-10-Transgenic lines
图1 甜瓜转基因植株的PCR分析
Fig. 1 PCR assay of transgenic melon lines
高 鹏等：甜瓜茎尖法遗传转化体系的建立第10期 · 59 ·
其他甜瓜品种上，制约甜瓜基因工程的研究。在
甜瓜遗传转化过程中，从外植体的选择，到染菌
除菌、褐化、继代、筛选剂等各个环节也都影响
最终的转化效率等。与其他方法相比，茎尖不定
芽转基因方法最大限度保持了甜瓜植株的完整
性，依賴其自身植株的正常生长。在实际操作
中，由于植物根部对生长调节剂和农杆菌比较敏
感，采用局部滴加的方式进行侵染和不定芽诱导
可以尽量降低农杆菌以及激素对整株植株的影
响，再利用针对抗生素抗性的筛选以获得转基因
材料，达到遗传转化的目的。整个过程在开发的
非无菌条件下进行，对设备以及操作人员的要求
较低，只需创造适合甜瓜生长的人工气候条件即
可全年进行甜瓜的遗传转化工作。
由于湿度和光照对转化细胞组织分化的影
响，本研究对处理后的植株进行遮光保湿，保证
适宜湿度条件。本研究建立的转化方法受甜瓜基
因型限制小，整个转化周期，从植株侵染到收获
种子只需3~4个月， 40~50 d后可进行PCR检测，
T0代结瓜率高。但此方法的局限在于，本研究的
转基因植株发育自不定芽，而不定芽的再生途径
起源于多细胞的细胞团，较易产生嵌合体植株，
所以在后代筛选过程中，需要对每一个转基因后
代进行独立检测，以便淘汰嵌合体植株。
[ 参 考 文 献 ]
[ 1 ] Chovelon V, Restier V, Giovinazzo N, et al. Histological study of
organogenesis in Cucumis melo L. after genetic transformation:
why is it difficult to obtain transgenic plants?[J]. Plant Cell Rep,
2011, 30: 2001-2011.
[ 2 ] 刘明月,左开井.农杆菌介导棉花茎尖遗传转化体系优化[J].上
海交通大学学报:农业科学版, 2011, 29(2): 25-31.
[ 3 ] Tafvizi F, Farahanei F, Sheidai M, et al. Effects of zeatin and
activated charcoal in proliferation of shoots and direct regenera-
tion in cotton (Gossypium hirsutum L.) [J]. African Journal of
Biotechnology, 2009(8): 6220-6227.
[ 4 ] 祝建波,王爱英,吴刚,等.转基因棉花的田间筛选技术研究[J].
棉花学报, 2000, 12(5): 230-233.
[ 5 ] Luan F S, Delannay I, Staub J E. Melon (Cucumis melo L.)
diversity analyses provide strategies for genetic improvement and
evidentiary support of domestication patterns[J]. Euphytica, 2008,
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东 北 农 业 大 学 学 报· 60 · 第44卷