全 文 ：《食品工业》2014 年第35卷第 2 期 79
响应面法优化喜树叶总黄酮提取工艺的研究
王宗成1,2*，王多1，王凯1，王宁1，张敏1
1. 湖南科技学院生命科学与化学工程系（永州 425100）；2. 湖南科技学院天然有机物精细化研究所（永州 425100）
摘 要 采用响应面法对喜树叶总黄酮提取工艺进行优化。在单因素试验基础上, 以乙醇体积分数、液料比和提
取温度为响应因素, 喜树叶总黄酮提取率为响应值, 采用3因素3水平的响应面分析法, 确定乙醇回流提取的最佳工
艺 条件为: 乙醇体积分数60%、料液比1︰40 (g/mL)、提取温度82 ℃、提取时间90 min, 在此条件下理论提取率为
61.24 mg/g, 与实测值60.78 mg/g基本相符, 说明响应面法优化得到的提取条件可靠。
关键词 喜树; 总黄酮; 提取工艺; 响应面法
Optimization of Extraction Process of Total Flavonoids from Camptotheca acuminata
Leaves by Response Surface Methodology
Wang Zong-cheng1,2*, Wang Duo1, Wang Kai1, Wang Ning1, Zhang Min1
1. Department of Biology and Chemistry, Hunan University of Science and Engineering (Yongzhou 425100);
2. Institute of Fine Natural Organic Matter, Hunan University of Science and Engineering (Yongzhou 425100)
Abstract The total fl avonoids from Camptotheca acuminata leaves were extracted with ethanol, and the extraction process
was optimized by response surface methodology. Based on single factor test, the optimal extraction conditions of total
fl avonoids were determined by a Box-Behnken experiment design of 3 factors and 3 levels combined with response surface
analysis. The optimal extraction conditions were as follows: the ethanol concentration was 60%, the material-liquid ratio was
1︰40 (g/mL), the extraction temperature was 82 ℃ and the extraction time was 90 min. The predictive best fl avonoids
extraction rate was 61.24 mg/g and the actual extraction rate was 60.78 mg/g. Thus, the optimal process conditions are reliable
by response surface methodology.
Keywords Camptotheca acuminata; total fl avonoids; extraction process; response surface methodology
喜树（Camptotheca acuminata）是我国特有树
种，主要分布于我国长江流域及以南地区，为国家Ⅱ
级重点保护野生植物，具有很高的观赏价值和药用价
值[1-2]。目前对喜树的开发利用主要从其果实中提取抗
癌药物喜树碱[3-4]，其资源没有得到充分利用，特别对
叶子的开发利用较少。大量研究显示，黄酮类化合物
具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌、护肝、抗炎、抗病毒、
调节内分泌系统等功效[5-6]。此外，黄酮在食品中的应
用也很广，它在食品中可作为天然抗氧化剂、天然色
素、保健食品等用途[7]。近几年来，从植物中提取分
离黄酮化合物开发保健食品、化妆品的研究也非常
多[8-9]。而喜树叶中黄酮含量较高，目前对喜树叶黄酮
的研究报道较少[10-13]，优化喜树叶黄酮的提取工艺对
喜树的开发和利用具有重要意义。
响应面分析法是近些年发展起来的一种分析方
法，以最经济的方式、较少的试验次数和较短的时间
对所选试验参数进行全面分析，以得出正确结论，广
泛应用于各种生物、制药、化工、食品工业的处理过
程中[14]。本试验基于当前研究状况和开发利用当地植
物资源，采用有利于工业化提取生产的乙醇提取方法
提取喜树叶黄酮，以响应面法对喜树叶黄酮提取工艺
进行优化获得较佳工艺。以期开发抗氧化保健食品或天
然抗氧化剂，为进一步开发利用喜树提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
喜树叶，2012年9月采自湖南科技学院校园，经
鉴定为珙桐科植物喜树（Camptotheca acuminata）的
叶子；芦丁标准品，中国药品生物制品检定所；石油
醚、95％乙醇、甲醇等均为分析纯试剂。
UV-1750 型紫外可见分光光度计：日本岛津公
司；RE-52B 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；
SHB-Ⅲ 循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限
公司；TE124S 电子天平：北京赛多利斯仪器系统有
限公司；集热式磁力搅拌器：郑州长城科工贸有限
公司。
1.2 试验方法
1.2.1 标准曲线的绘制
精密称取在120 ℃减压干燥至恒重的芦丁标准
品25.0 mg至50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇
匀，配成质量浓度为0.5 mg/mL溶液，精密量取10 mL
置50 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，得到对照
溶液（含芦丁0.1 mg/mL）。再精密吸取对照品溶液
0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0与12.0 mL，分别置于25
*通讯作者；基金项目：湖南省重点学科建设项目（2011-76），湖南省科
技计划项目（2013FJ3004），湖南科技学院科研项目（12XKYTA002），
湖南科技学院大学生研究性学习和创新性试验计划项目
工艺技术
《食品工业》2014 年第35卷第 2 期 80
mL容量瓶中，分别加入5% NaNO2溶液0.6 mL，摇匀，
放置6 min后各加入10% Al(NO3)3溶液0.6 mL，摇匀，
放置6 min，再分别加入4% NaOH溶液8.0 mL，再加水
至刻度，摇匀，放置10 min，在510 nm波长处测定吸
光度，以吸光度（A）为纵坐标，芦丁质量浓度（c）
（mg/mL）为横坐标，绘制芦丁标准曲线，见图1。
图1 芦丁标准曲线
芦丁回归曲线方程为：y=11.925x-0.013 1，R2=
0.999 6，在0.008 mg/mL~0.048 mg/mL质量浓度范围内
有良好的线性关系。
1.2.2 单因素试验
准确称取10.0 g干燥粉碎的喜树叶，加入石油醚
（60 ℃~90 ℃）300 mL回流脱脂6 h。脱脂后粉末干
燥，用一定体积分数的乙醇，在设定的试验条件下
（考察料液比、提取次数、乙醇体积分数、提取温度
和提取时间5个因素）回流提取，将提取液抽滤，将
滤渣按第一次提取条件再提取一定次数，合并滤液浓
缩至约30 mL，转移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至
刻度，摇匀作为样品溶液。取样品溶液1.0 mL，转移
至25 mL容量瓶中，再用甲醇定容至刻度，摇匀，取
该溶液2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，按照标准曲线绘
制方法操作，测定吸光度，根据芦丁标准曲线计算出
测定稀释后样品溶液总黄酮质量浓度（c）。然后计
算样品中总黄酮的提取率。
总黄酮提取率（mg/g）= c×N×V
m （1）
式中：c-稀释后样品溶液总黄酮质量浓度（mg/
mL）；N-稀释倍数：312.5；V-最初样品定容体积
（50 mL）；m-样品质量（10.0 g）。
1.2.3 响应面试验
在单因素试验的基础上，选取出乙醇体积分数
（A）、料液比（B）和提取温度（C）3个对喜树叶
黄酮提取影响比较显著的因素，在固定提取时间90
min、提取次数2次的条件下，根据Box-Beknhen试验
设计原理，以总黄酮提取率为响应值，采用经典的3
因素3水平的响应面试验表，进行响应面试验确定喜
树叶中黄酮提取的最佳工艺[15-16]。Box-Behnken 试验
设计因素水平见表1。
2 结果与讨论
2.1 单因素试验
2.1.1 料液比的对提取率的影响
取样品10.0 g，乙醇体积分数70%，料液比分别
为1︰10，1︰20，1︰30，1︰40，1︰50（g/mL）提
取，恒温70 ℃，回流提取2次，每次120 min的条件提
取测定喜树叶总黄酮含量，考察料液比对喜树叶总黄
酮提取率的影响。结果如图2所示，在一定范围内随
着料液数值的增大黄酮的提取率呈增加趋势，随后基
本稳定，到料液比为1︰50（g/mL）时，提取率最大。
考虑到生产成本，宜选取料液比1︰40（g/mL）。
表1 响应面试验因素水平表
因素 水平-1 0 1
A 乙醇体积分数 /% 50 60 70
B 料液比/(g·mL-1) 1︰30 1︰40 1︰50
C 提取温度/℃ 70 80 90
图2 料液比对总黄酮提取率的影响
2.1.2 提取次数对提取率的影响
取样品10.0 g，乙醇体积分数70%，料液比1︰40
（g/mL），恒温70 ℃，按每次120 min回流提取，分
别提取1，2，3，4次提取测定喜树叶总黄酮含量，考
察提取次数对喜树叶总黄酮提取率的影响。结果如图
3所示，在一定范围内，提取次数越多提取率越大，
提取次数为4次时提取率最大。实际上可以看出，提
取2次时喜树叶总黄酮已基本溶出较完全，为了节省
时间和节约溶剂，从工业成本和提取周期角度来看，
宜选取提取2次。
图3 提取次数对总黄酮提取率的影响
2.1.3 乙醇体积分数对提取率的影响
取样品10.0 g，分别以体积分数为50%，60%，
70%，80%，90%的乙醇溶液为提取溶剂，料液比1︰
40（g/mL），恒温70 ℃，回流提取2次，每次120 min
的条件提取测定喜树叶总黄酮含量，考察乙醇体积分
数对喜树叶总黄酮提取率的影响。结果如图4所示，
提取率随乙醇体积分数递增呈先增后减的变化趋势，
在乙醇体积分数为60%左右时，提取喜树叶总黄酮的
效果更佳。
工艺技术
《食品工业》2014 年第35卷第 2 期 81
图4 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响
2.1.4 提取温度对提取率的影响
取样品10.0 g，乙醇体积分数70%，料液比1︰
40（g/mL），回流提取2次，每次120 min，分别于50
℃，60 ℃，70 ℃，80 ℃，90 ℃的条件提取测定喜树
叶总黄酮含量，考察提取温度对喜树叶总黄酮提取率
的影响，结果如图5所示，提取率先随着提取温度的
提高而提高，在提取温度为80 ℃时，喜树叶总黄酮的
提取率达到最高。
图5 提取温度对总黄酮提取率的影响
2.1.5 提取时间对提取率的影响
取样品10.0 g，乙醇体积分数70%，料液比1︰40
（g/mL），恒温70 ℃，回流提取2次，分别每次回流
提取30 min，60 min，90 min，120 min，150 min的条
件提取测定喜树叶总黄酮含量，考察提取时间对喜树
叶总黄酮提取率的影响。图6显示提取时间在60~120
min之间时间对喜树叶总黄酮提取率的总体影响不是
很大，提取时间达90 min以后提取率增量就很少了。
图6 提取时间对提取率的影响
2.2 响应面设计试验结果及分析
2.2.1 Box-Benhnken 设计方案及试验结果
在单因素试验的基础上，选取出乙醇体积分数
（A），料液比（B）和提取温度（C）3个对喜树叶
黄酮提取影响比较显著的因素，在固定提取时间90
min，提取次数2次的条件下，以总黄酮提取率为响应
值，进行响应面试验。试验设计及试验结果见表2。
采用Design Expert 8.0.5.0软件对表2中试验结果
进行多项拟合回归，得到喜树叶黄酮提取率（Y）对
乙醇体积分数（A），料液比（B），提取温度（C）
的二次多项回归模型方程：Y=60.96-2.30A+0.58B+
1.43C+1.02AB+2.71AC-0.64BC-6.54A2-3.57B2-
3.33C2。
表2 响应面分析试验设计及结果
试验
号
A乙醇体
积分数/%
B料液比/
(g·mL-1)
C 提取
温度/℃
提取率实测值/
mg·g-1
提取率预测
值/mg·g-1
1 1 2 3 52.059 6 52.11
2 2 1 3 55.183 1 55.54
3 3 3 2 49.733 0 50.14
4 3 2 3 53.998 5 52.93
5 3 1 2 46.242 9 46.95
6 2 2 2 60.514 2 60.96
7 1 3 2 53.416 8 52.71
8 2 3 1 54.192 5 53.83
9 2 3 3 54.774 2 55.43
10 2 2 2 60.500 9 60.96
11 2 1 1 52.059 6 51.41
12 2 2 2 61.830 9 60.96
13 2 2 2 60.978 6 60.96
14 1 2 1 53.610 8 54.67
15 1 1 2 53.998 5 53.59
16 3 2 1 44.691 8 44.64
2.2.2 响应面回归模型的方差分析
为了检验回归方程的有效性，进一步确定各因素
对总黄酮提取率的影响程度，对回归模型进行了方差
分析，结果见表3。
从表3可知，模型的F=41.16，p=0.000 1＜0.01，
差异极显著；失拟项的p值为0.140 9，不显著，决定
系数R2=0.984 1，响应值的变化有98.41%来源于所选
因素，即来源于乙醇体积分数，提取温度和料液比，
说明模型拟合度好，回归方程能很好的描述各因素与
响应值之间的关系，该试验方法可靠[17]。
表3 响应面设计回归方程的方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 p 显著性
模型 363.02 9 40.34 41.16 0.000 1 **
A 42.42 1 42.42 43.26 0.000 6 **
B 2.68 1 2.68 2.74 0.149 1
C 16.42 1 16.42 16.75 0.006 4 **
AB 4.14 1 4.14 4.22 0.085 6
AC 29.47 1 29.47 30.06 0.001 5 **
BC 1.62 1 1.62 1.65 0.246 7
A2 170.82 1 170.82 174.23 <0.000 1 **
B2 51.06 1 51.06 52.08 0.000 4 **
C2 44.38 1 44.38 45.27 0.000 5 **
残差 5.88 6 0.98
失拟项 4.71 3 1.57 4.04 0.140 9
纯误差 1.17 3 0.39
总和 368.90 15
注 : “**”( p＜0.01) 为极显著 ; “* ”( p ＜0.05) 为显著。
回归模型中一次项A和一次项C，交互项AC，二
次项A2，B2和C2的p值均小于0.01，说明乙醇体积分
数，提取温度，乙醇体积分数和提取温度的交互项
以及3个因素的二次项都具有显著影响；而其他交互
项，料液比及缺失项显著性较差。表明试验因素对响
工艺技术
《食品工业》2014 年第35卷第 2 期 82
应值不是简单的线性关系，而是一种非线性关系[17]。
响应曲面坡度越陡峭，表明响应值对于操作条件
的改变越敏感； 反之曲面坡度越平缓，操作条件的改
变对响应值的影响也就越小[17]。图7~图9 直观地反映
了各因素交互作用对响应值的影响，乙醇体积分数和
提取温度交互作用曲面陡峭，表明其对总黄酮提取率
的交互作用明显。各因素的效应关系为：A（乙醇体
积分数）＞C（提取温度）＞B（料液比）。
图7 料液比与乙醇体积分数对总黄酮提取率的交互
作用
图8 提取温度与乙醇体积分数对总黄酮提取率的交互
作用
图9 料液比与提取温度对总黄酮提取率的交互作
2.2.3 最佳工艺条件
用Design-Expert 8.0.5.0 软件对二次多项式回归
方程进行计算，得到最佳的提取条件为乙醇体积分数
58.60%，料液比1︰40.47（g/mL），提取温度81.53
℃，预测提取率为61.24 mg/g。但考虑到实际操作的
局限性，将乙醇回流提取喜树叶黄酮的提取工艺修正
为：乙醇体积分数60%，料液比1︰40（g/mL），提
取温度82 ℃。根据此条件并在提取时间90 min，提取
次数2次条件下进行了3次平行验证试验，得到黄酮的
实际平均提取率为60.78 mg/g，与理论预测值61.24 mg/
g接近，表明建立的数学模型对喜树叶黄酮提取工艺
具有实用价值。
3 结论
利用响应面设计优化提取喜树叶中总黄酮的
工艺，得到的最佳工艺条件为：料液比1︰40（g/
mL），提取温度82 ℃，提取时间90 min，乙醇体积分
数60%，在此条件下理论提取率为61.24 mg/g，与实测
值60.78 mg/g基本相符，说明本试验的模型拟合程度
高，准确有效，可用于喜树叶黄酮提取工艺的优化
筛选。
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