全 文 ：浙江省自然科学基金资助课题
采用组织培养技术快速增殖猫人参的实验研究
胡 科 徐晓甜 杨阿聪 指 导:丁志山、石森林教授
( 1. 浙江中医学院生命科学系, 310053, 浙江杭州 / /第一作者男, 1982 年生, 2000 级生物科学专业本科生)
摘 要:猫人参作为民间常用草药, 其来源为猕猴桃科植物大籽猕猴桃 ( Actinidia macrosperma C. F .
Liang) 112, 具有解毒消肿祛风除湿的功效。
关 键 词:猫人参; 组织培养
中图分类号: R - 33 文献标识码:A 文章编号: 1009 - 5276( 2004) 04 - 0622 - 03
猫人参作为民间常用草药, 其来源为猕猴桃科植物
大籽猕猴桃( Actinidia macrosperma C. F. Liang ) 112, 具有
解毒消肿祛风除湿的功效, 在临床用于治疗深部脓肿, 骨
髓炎, 风湿痹痛,疮疡肿毒, 肝硬化黄疸腹水等,现民间常
用于治疗各类肿瘤11~ 42。随着猫人参临床应用日益增
多, 其生药用量也相应增加, 而野生资源毕竟有限, 目前
浙江省内的猫人参已经基本被采掘一空, 临床应用的猫
人参多从江西或安徽购入, 且伪品较多152。为此, 笔者拟
通过组织培养的方法来达到快速繁殖猫人参的目的, 以
满足日益增加的临床需求。
1 材料和方法
材 料 猫人参来源: 采自富阳, 健康、生长旺盛的
野生猫人参枝条, 经浙江中医学院来平凡教授鉴定为大
籽猕猴桃( Actinidia macrosperma C. F . Liang)。
主要试剂 6 - 苄基嘌呤 ( 6 - BA)中国医药 (集团)
上海化学试剂公司, 批号: F20001122; 吲哚丁酸( IBA )中
国医药(集团)上海化学试剂公司, 批号: F20010108, 1 -
萘乙酸 ( NAA )中国医药 (集团)上海化学试剂公司, 批
号: F20010915; 赤霉素纯品 ( GA 3 )上海溶剂厂, 批号:
0010109; 蔗糖,化学纯, 中国上海试剂一厂, 批号: 79 - 12
- 06; 琼脂,福建省惠安化工厂, 批号: 021028。
主要仪器 电子天平,型号: JA1003, 上海天平仪器厂;
超净台,型号: SW -CJ - IF,苏州安泰空汽技术有限公司。
方 法 培养基配制: 根据 MS 配方配制, 调 PH5. 8
~ 6. 0,分装后 115 e 、30min 高压蒸气灭菌。
枝条的处理:取枝条剪成长 8~ 10cm, 带 2~ 3 个芽
的插穗,用 500mg /L IBA 浸泡 10min, 扦插于 25e 的室
内槽中, 塑料薄膜保湿,自来水喷雾 2 次 /d。20d 后扦插
的枝条抽出 5~ 10cm 长的嫩枝条, 剪取嫩枝条, 无菌水
冲洗 3 遍后, 用 75% 酒精消毒 15s, 到时即取出置于
0. 1%HgCl2 溶液中消毒 5min 取出,无菌水冲洗 4 遍。
接种:把枝条切成每个长约 2cm、带 1 个芽点的茎
段, 接种于培养基中, 每瓶三个茎段。(外植体切去创口
处约 0. 3cm 的茎段以除去 Hg2+ 对外植体的影响, 发根
培养切取增殖无菌枝条扦插。)
培养: 接种后放于温室 24 ~ 26 e 、光照 2500LX、
12h /d 的条件下培养,剔除污染植株,并作定时观察。
2 结果和分析
外植体的筛选 初生茎尖、初生茎段、一年生茎段、
二年生茎段,接种在 MS+ 2mg / L 6 - BA+ 0. 2mg /L IBA
( pH5. 8)的基本培养基上。其接种情况、芽分化和生长
特点见表 1, 从表中可以看出, 初生茎尖生长最快, 接种
4d 后就表现出生长、成活率为 100% , 初生茎段的萌芽率
为 94% ,侧芽萌发较茎尖慢 ,一般为 11d, 并在切口处形
成少量的愈伤组织, 而一年生茎段和二年生茎段侧芽的
萌发率为 77%以下, 侧芽萌发时间也较长, 切口处无愈
伤组织形成并且污染率较高。据此我们得出初生茎尖为
最佳的外植体增殖材料,初生茎段次之。
表 1 不同外植体的分化情况
结 果 材料外植体初生茎尖初生茎段一年生茎段二年生茎段
接种材料数(个) 50 50 43 39
产生愈伤组织数(个) 45 50 27 11
芽分化的材料数(个) 50 47 33 28
芽分化率( % ) 100 94 77 72
芽开始分化时间( d) 4 11 15 17
以上培养基 pH5. 8,添加 30g /L蔗糖 8g /L 琼脂
增殖培养基的筛选 不同激素配比对增殖的影响
MS+ 2mg / L 6 - BA+ 0. 2mg /L IBA( pH5. 8)培养的猫人
参生长速度还不够理想且节间不明显。由于初生茎尖数
量较少并且为了保持猫人参遗传的相对稳定性, 我们选
用初生茎段为增殖实验材料, 在 MS 中添加不同浓度的
IBA、6 - BA、GA 3三种激素,采用 L9( 34)方法来筛选激素
配比适当的培养基。结果见表 2, 相对其他组, 7、9 组愈
伤组织生长的比较好,且较易诱导丛生芽, 3、6 组在新长
的侧枝上侧芽分化较明显, 而 2、4、8组侧芽生长较快、侧
枝长、叶片大、数多、色绿, 且愈伤组织也较小, 在这三组
中以第 4 组的芽分化率高,侧枝生长最快,其培养基是茎
段增殖的较理想培养基。
蔗糖浓度对增殖的影响 作为碳源和能源的蔗糖,
对猫人参的生长可能起着一定的作用, 据此思想,笔者设
计了以 MS+ 2. 0mg /L 6 - BA+ 0. 3mg / L IBA+ 1. 5mg /
L GA 3为基础, 添加三种不同浓度的蔗糖来进行培养基
的筛选。从表 3 中可以看出茎段在第 1 组培养基中较早
表现出了自养生活,这对发根培养较有利,但存在生长缓
慢、茎短, 此浓度不适用于茎段增殖。第三组培养基中茎
第 22卷 第 4期
2 0 0 4 年 4 月
中 医 药 学 刊
CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol. 22 No. 4
Apr . 2 0 0 4
中医药
622
学刊
DOI：10.13193/j.archtcm.2004.04.44.huk.024
段较嫩, 叶数少,叶片呈半透明状、狭小,但较易诱导愈伤
组织。综合侧芽萌发时间、萌发的侧枝长度、直径和侧枝
进行生根培养的难易等因素, 我们认为 30g /L 的蔗糖浓
度是茎段增殖的较理想浓度。
表 2 不同激素配比侧芽的萌发情况
组数 /因素 6 - BA IBA CA 接种个数 芽分化数(个) 分化率( % ) 侧芽萌发情况
1 1. 0 0. 3 0. 5 62 57 92
侧芽萌发快,节间不明显,叶片大、色较
绿。
2 1. 0 0. 2 1. 0 64 64 100
侧芽萌发快,叶片多,叶色绿,侧枝伸长
快, 4周后侧枝平均长 3cm
3 1. 0 0. 1 1. 5 67 64 96 侧芽萌发较快, 4周后侧枝长约 2cm
4 2. 0 0. 3 1. 5 70 70 100
侧芽萌发最快, 有少量的愈伤组织,数
多、色绿, 4周后侧枝平均长 3. 5cm
5 2. 0 0. 2 0. 5 64 61 95 侧芽萌发快,有少量愈伤组织
6 2. 0 0. 1 1. 0 63 61 97
侧芽萌发较快,有少量愈伤组织形成,叶
片少
7 3. 0 0. 3 1. 0 68 61 90
侧芽萌发较慢,侧枝伸长慢,愈伤组织直
径平均 0. 8cm
8 3. 0 0. 2 1. 5 65 56 86
侧芽萌发快,节间较长, 4周后侧枝平均
长 3cm
9 3. 0 0. 1 0. 5 68 59 87 侧芽萌发慢,愈伤组织直径平均 1. 0cm
以上培养基 pH5. 8,添加 30g /L 蔗糖, 8g /L琼脂
表 3 不同蔗糖浓度增殖情况
组数 /因素蔗糖浓度
( g/ L)
萌芽
时间 14d 后生长情况 30 d后生长情况
1 15 9
叶色较绿、较伸展, 茎长
0. 7cm左右
叶数较多, 茎长 2. 5cm、较
老、较粗、开始生根
2 30 6
叶色绿、伸展、茎长 2. 0cm
左右
叶数多, 茎长 3. 5cm、粗、稍
嫩
3 45 4
叶呈半透明、卷曲, 茎长
2. 5cm左右 叶数少,茎长 4. 2cm,嫩弱
以上培养基 PH5. 8 8g /L 琼脂
发根培养基的筛选 不同浓度配比的激素对植株发
根的影响: 为了获得生根迅速、根系发达的培养基我们采
用了以 1 /2MS 为基础培养基, 添加不同比例的 NAA 和
IBA, 5d 后发现, 3、4 组枝条切口处有不同程度的膨大,
25d 后的结果见表 4, 第 4 组诱导的根数目最多和发根时
间最短, 但根细长分支较少、生长一般, 而第 3 组发根时
间比第 4 组晚 2d, 但所诱导的根比第 4 组的粗壮、根系
发达、生长较好, 1、2 两组发根时间长、生根率比 3、4 两
组低。上述结果说明 3 组为这四组中最优的发根培养
基, 但在这些培养基中都存在着诱导的根从离扦插处较
远的节上发出这一现象, 这可能与激素的运输和激素在
一定部位所积累的量有关。
表 4 不同培养基的 25d后发根情况
组号 培养基
接种材料
数(个)
生根材料
数(个)
平均一个材料
生根数(条)
平均根长
( cm)
生根率
( % )
1 1mg /L NAA 40 28 2. 1 1. 5 70
2 1mg /L NAA+ 1mg /L IBA 40 37 2. 5 2. 1 93
3 1mg /L NAA+ 2mg /L IBA 40 40 3. 2 2. 8 100
4 1mg /L NAA+ 5mg /L IBA 40 40 5. 7 2. 4 100
不同浓度的蔗糖对植株发根的影响: 在筛选出激素
配比合适的培养基基础上我们对蔗糖浓度进行了适当的
调整,发现蔗糖浓度低于 10g /L, 发根时间较长、生长缓
慢。当浓度高于 40g / L时, 其诱导不定根时间较短,但根
较细且根毛少, 不适合移栽, 而处于 15g /L 到 25g /L 这
一间隔的蔗糖浓度较适合发根培养, 发根的时间一般为
7d,比添加 30g /L 的蔗糖提前了 2~ 3d, 20d 后根长平均
可达 2. 5cm,但不影响根的诱导率。
以 4cm 长的培育枝条为材料添加 0. 5g / L活性炭和
30mg / L的蔗糖, 培养基 PH6. 0 8g / L琼脂
移 栽 为提高移栽成活率和移栽后猫人参能够快
速生长,移栽时选在培养室内揭开培养瓶盖, 放置 4d 后
取出用自来水冲洗去根部的琼脂, 避免损伤根。测量根
的长度和数目后用 2000 倍高锰酸钾浸泡 1min, 稍晾干
移栽到 25 e 通风较好的苗圃沙床中, 为保持较高的湿
度,喷雾 3 次 /d,不易过多,否则容易烂苗, 这阶段的管理
是试管苗能否成活的关键,当长出新叶后,可视植株生长
情况适当追以淡肥,这样有利于猫人参更快生长, 30d 后
移植到大田。本实验移苗 280 株, 成活 263 株, 成活率
94% ,此次实验我们还发现 280 株中以根长 1~ 2cm、根
数 2~ 3 根的 101 株猫人参全部成活。
3 讨 论
猫人参作为民间药, 其临床应用已得到各方面的肯
定和关注。猫人参使用初期为猕猴桃科的大籽猕猴桃
( Actinidia macrosperma C. F . Liang) , 后期随着临床应用
的增加导致大量采挖致使此种野生数量减少而改用对萼
猕猴桃( Actkinidia valvata Dunn)代替112。采用组织培养
快速增殖猫人参尚未见文献报道, 在此研究中我们筛选
出了较好的增殖培养基( MS+ 2. 0mg /L 6 - BA+ 0. 3mg /
L IBA+ 1. 5mg /L GA3+ 30mg /L 蔗糖和发根培养基 ( 1 /
2MS+ 1mg /L NAA + 2mg /L IBA + 0. 5g / L 活性炭+
15mg /L 的蔗糖) , 为保护野生猫人参资源和获得大量猫
人参种苗作为初步的研究, 使猫人参从野生变家种成为
一种可能,不仅保护了生物多样性, (下转第 639 页)
第 4 期 胡 科等: 采用组织培养技术快速增殖猫人参的实验研究
中医药
623
学刊
两组病例治疗前后颅内各血管血流速度相比较有显
著性差异( P < 0. 001) ,两组间比较, 治疗前后无明显差
异( P > 0. 05) ,两种药物均可改善病人颅内血管的异常
舒缩功能。
表 5 收缩期血流速度增快者颅内各血管血流速度(n= 102)
分 组 MCA ACA PCA治疗前 治疗后 治疗前 治疗后 治疗前 治疗后
治疗组 120. 4 ? 8. 71 109. 8 ? 8. 81 97. 1 ? 7. 82 78. 4 ? 8. 61 89. 4 ? 8. 31 74. 8 ? 7. 51
对照组 121. 6 ? 7. 42 108. 4 ? 6. 62 95. 8 ? 8. 13 80. 6 ? 7. 82 88. 6 ? 7. 63 76. 3 ? 6. 82
正 常参考值 80~ 110 50~ 90 50~ 90
随访结果 疗程结束后 6 个月, 对所有痊愈和显效
病人进行随访, 共有 88 例, 其中 11 例因住地远离医院且
家中无电话、14 例因住地搬迁、10 例因外出无法联络故
均失访, 共随访病人 53 例, 其中治疗组 36 例, 痊愈者 17
例; 对照组 17 例,痊愈者 8例。结果显示:治疗组痊愈病
例有 4 例复发, 显效病人中有 8 例症状加重,占所有随访
病例的 33. 33% ;对照组中痊愈病例中有 4 例复发,显效
病人中有 5 例症状加重, 占所有随访病例中的52. 94%。
治疗组远期疗效亦优于对照组。
不良反应 两组病人服药期间无恶心、呕吐、全身皮
疹、心悸、胸闷等症状, 治疗前后查血常规、肝肾功能等均
无异常。
3 讨 论
偏头痛是一种良性反复发作的一侧搏动性头痛或
(和)神经功能障碍, 其病理机制不完全清楚, 目前, 多认
为本病是一种脑功能失调, 血管最终参与,由刺激引起大
脑皮质部神经元去极化导致皮质电活动抑制,由刺激局
部向周围组织呈波浪式扩展的一种脑电病理生理性改
变。5 - HT 明显减低、脑干的持续激活可能是偏头痛的
致病因子, 三叉神经血管系统受刺激,神经源性炎症的出
现, 细胞外高钾,钙通道异常, 均可诱发扩散性抑制而导
致偏头痛的发作。122
本病因其病程长, 病情缠绵,症状重, 疗效差,且反复
发作持续不解, 属祖国医学/ 头风病0范畴。本病初起多
为感受风邪, 渐至风邪留恋,郁而化热, 或肝郁气滞,或风
热伏留,化热化火,终至脑脉痹阻, 阻遏清阳, 蒙蔽清窍,
而致头痛。本病病机特点是气郁血阻、风火痰热。132证属
本虚标实, 病机关键是气血逆乱、络脉失和, 病位在头, 脏
腑属肝胆。142因此,本病的治疗当遵前人: 头无寒疼腹无
热痛及病初在气、久病入络之说的原则, 以祛风清热、通
络止痛为法。头痛宁胶囊是导师杨秀清在前人经验基础
上,结合自己的临床经验, 研制出治疗偏头痛的中成药。
头痛宁胶囊由陈士铎5辨证录#头痛篇6中所载的/ 散偏
汤0加减化裁而成 ,药用川芎、白芷、藁本、蔓荆子、柴胡、
香附等等,共奏祛风通络、散郁止痛之功。152药理研究显
示,该药对实验性疼痛小鼠及大鼠的痛阈均可明显提高,
具明显的镇痛作用,且有剂量依赖性。
我们在本研究中发现, 头痛宁胶囊总疗效及疼痛强
度变化与对照组相比均有显著性差异( P < 0. 05) , 且头
痛宁胶囊效快,服药后 3h 即有大部分病例头痛缓解, 随
访半年,痊愈病人复发及显效病人症状加重者占随访病
人的 33. 33% , 对照组为 52. 94%。因此, 治疗组无论近
期疗效还是远期疗效疼痛缓解程度均优于对照组, 且无
明显毒副反应。本研究中病人头痛发作中脑血流异常以
血管痉挛为多,与文献报道一致162,但仍有部分病人颅内
血管扩张,颅内血管舒缩功能异常, 导致偏头痛发作中血
液动力学的变化, 引起头痛发作。两组药物对病人颅内
血管血液动力学改变均有明显的改善 ( P < 0. 001) , 两
组间无明显差异( P > 0. 05) , 两药物均可显著改善颅内
血管舒缩功能异常,阻断偏头痛发作时的病理过程,其作
用机制尚待进一步研究证实。
参考文献
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(上接第 623页)也为以后对猫人参作深入的研究和新药
开发作了初期的准备。
本研究还存在一些问题, 在我们初步研究中发现愈
伤组织的增殖诱导丛生芽数目比茎段增殖要多, 但不知
道会不会改变其遗传性状从而导致其药用价值改变, 在
培养基中添加有机附加物可能会进一步促进生长, 猫人
参是雌雄异株, 雌株或雄株猫人参可能对培养基会有不
同的需要, 从经济上考虑多激素一次培养比单激素多次
培养合算, 但扩增速度还未作定论。
以上问题都有待于做进一步研究。
参考文献
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第 4 期 洪文媛等: 头痛宁胶囊治疗偏头痛 94 例分析
中医药
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学刊