全 文 ：猫人参注射液体外抗肝癌实验研究
万旭英 张亚妮 张 晨
上海长海医院 上海 200433
摘要 目的:观察单味猫人参注射液在体外对肝癌细胞的抑制作用。方法:噻唑蓝还原法(MTT法)检测猫人参注射液对体
外培养的人肝癌细胞株 SMMC-7721、小鼠肝癌细胞株H22 、大鼠肝癌细胞株CBRH-7919 的生长抑制作用。结果:体外实验结果
表明:250mg ml浓度猫人参注射液对 H22 、CBRH-7919、SMMC-7721 肝癌细胞株均有抑制作用 , 抑制率分别 63.68%、41.51%、
32.92%, IC50分别为:107.70mg ml、519.49mg ml、667.56mg ml;在 24h , 48h , 72h三个时相 , 对小鼠 H22肝癌细胞的生长抑制作用存在
较明显的时效关系 , 在 72h 内 16.88mg ml～ 250mg ml浓度内药物浓度与抑制作用有正相关趋势 ,其相关系数为 0.91。结论:猫人
参注射液对不同肝癌细胞株有一定的抑制作用。
关键词 猫人参 肝癌 噻唑蓝还原法
Experimental Study on Anti-hepatocarcinoma Effect of Maorenshen injection in vitro Wan Xuying , Zhang Yani ,
Zhang Cheng Changhai Hospital , Shanghai (200433)
Objective:To observe the the growth inhibition of Maorenshen injection on live cancer cell line in vitro.Methods:MTT
assay was used to examine the growth inhibition of Maorenshen injection on human live cancer cell line(SMMC-7721),
mice live cancer cell line(H22)and rat live cancer cell line(CBRH-7919).Results:Maorenshen injection had potent anti-
tumor efficacy to three varieties of liver cancer cell lines.The inhibition rates of Maorenshen injetion onH22 ,CBRH-7919 ,
SMMC-7721 cell lines were 63.68%,41.51%,32.92%respectively.The IC50 of Maorenshen injection on H22 ,CBRH-
7919 ,SMMC-7721 cell lines were 107.70mg nl ,519.49mg ml ,667.56mg ml respectively.It also had time-dependent re-
lationship to H22 during 24 ,48 ,72 hours.At the doses ranged from 16.88mg ml to 250mg ml ,drug concentration had posi-
tive correlation to inhibition of H22 ,R=0.91.Conclusion:Maorenshen injection had the potent antitumor activity against liv-
er cancer cell in vitro.
Key words Maorenshen , liver cancer ,MTT
猫人参是猕猴桃科植物对萼猕猴桃(镊合猕猴
桃)(Actinidia valvala dunn)的根 ,味苦 、涩 、性寒。归
肺 、胃经 。具有清热解毒 、消肿疖 、祛风除湿的功效 ,
主要用于骨髓炎 、疮疡脓肿 、风湿痹痛 、肝硬化黄疸
腹水 、麻风病等 , 在江浙一带常用于治疗消化道肿
瘤[ 1 ～ 3] 。我科自拟以猫人参为主的抗肝癌方治疗肝
癌疗效明显 ,至于单味猫人参的抗肿瘤作用 ,国内外
文献未见报道。本实验采用多种肝癌细胞株 ,进行
体外细胞培养 ,在MTT 方法测定其对肝癌细胞的杀
伤率 ,计算 IC50 。
1 实验材料
1.1 药物和试剂 猫人参注射液:由长海医院药学
部制剂室 ,经一定工艺制成猫人参注射液 ,为棕黄色
澄明液体 ,每支 2ml ,含生药 5g ml(浓度:500%),批
号:021216。四甲基氮唑蓝:美国 Sigma公司产品 ,取
25mgMTT 溶于 5mlPBS 中 ,振荡器震荡溶解 ,滤器过
滤备用 。RPMI1640培养基 ,谷氨酰胺:美国 Gibco 公
司;小牛血清:杭州四季青生物公司;二甲基亚砜
(DMSO):江苏珙生化工厂;Hepes缓冲液:德国 merck
产品;RPMI1640培养液的配制:RPMI1640干粉 10.4g
L ,Hepes 4.74g L , L-谷氨酰胺 0.3g-L ,NaHCO32.0g
L ,青霉素 10u L ,链霉素 10万 u L;细胞消化液的配
置:NaCL100Mm L ,EDTA0.25Mm L ,蛋白酶 0.1mg ml。
1.2 仪器仪器 CO2 细胞培养箱:德国 Hereaus 产
品;超净工作台:苏州净化仪器设备厂;KA-1000离
心机:上海安亭科技仪器厂;微量可调加样器:法国
GLISON公司;96孔培养板:丹麦 NUNCLON 公司;酶
联免疫检测仪:上海 BIO-RAD公司;倒置相差显微
镜;上海光学仪器厂 。
1.3 瘤株 人肝癌细胞株 SMMC-7721 、小鼠肝癌
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浙江中医学院学报 2004年 3月第 28卷第 2期
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实
验
研
究
DOI :10.16466/j.issn1005-5509.2004.02.029
细胞株 H22 、大鼠肝癌细胞株 CBRH -7919引自中国
科学院上海细胞研究所。
2 实验方法
2.1 细胞培养 肿瘤细胞株置于体积分数为 10%
小牛血清的 RPMI -1940 培养基 ,在体积分数 5%
CO 2 ,37℃,饱和湿度下传代培养 ,细胞贴壁生长 ,每 2
～ 3天换培养液 ,细胞传代时用体积分数为 0.25%胰
蛋白酶和体积分数为 0.02%EDTA的消化液后传代 ,
每日在倒置显微镜下观察细胞生长情况及形态改
变 。小鼠肝癌细胞 H22为悬浮生长的细胞 ,其余细胞
为贴壁生长 。
2.2 猫人参注射液对不同肝癌细胞株的生长抑制作
用 取对数生长期的肝癌细胞株 SMMC-7721 、H22 、
CBRH-7919 ,分别用体积分数为 10%小牛血清的 RP-
MI1640培养液制成单细胞悬液 ,细胞以 1×104 孔的密
度接种于96孔板 ,每孔中分别加入培养基 160μl ,在体
积分数 5%CO2 ,37℃,饱和湿度下培养 24h细胞 ,然后
将不同浓度猫人参注射液 40μl加入实验组的相应孔
中。猫人参注射液共设7个浓度 ,即药物浓度为1000 、
500 、250 、125 、67.5、33.75 、16.88mg ml ,每个浓度设 6个
复孔 ,阴性对照组为等体积的肿瘤悬液 ,空白对照孔为
不加细胞的培养液。在体积分数的MTT ,在 37℃,饱
和湿度下培养 72h ,实验终止前4h ,加入 20μl质量浓度
为 5mg ml的MTT ,在 37℃继续培养4h ,将96孔板置于
离心机 5min ,去上清 ,每孔加入二甲基亚砜 150μl ,震荡
混匀 ,使沉淀充分溶解 , 10min后于酶标仪上测定吸光
度A值 ,测定波长为 490nm ,按下列公式计算抑制率和
半数抑制浓度(IC50)。
抑制率(IR)=(对照组 A值 -实验组 A 值) 对
照组A值×100%
半数抑制浓度(IC50)计算方法:用对数机率单位
法 ,以直线回归方程计算肿瘤细胞生长抑制率为
50%的药物浓度 ,即为 IC50 。
2.3 猫人参注射液对小鼠肝癌 H22细胞时效 —量效
关系 实验方法与给药同实验方法 2.2 ,设三个时间
点:24h 、48h 、72h。
2.4 统计方法 多样本比较用单因素方差分析 ,两
两比较采用 Newman-Keuls检验。
3 结果
3.1 猫人参注射液对不同肝癌细胞株的生长抑制作
用 实验结果表明:在 72h , 250mg ml浓度猫人参注
射液对H22 、CBRH-7919 、SMMC-7712肝癌细胞株均
有不同程度的抑制作用 , 抑制率分别 63.68%、
41.51%、32.9%,且对 H22肝癌细胞株较敏感 ,与比较
CBRH -7919 、SMMC -7721 有统计学意义(P <
0.05), IC50 分 别 为:107.70mg ml 、 519.49mg ml 、
667.56mg ml。(见表 1和图 1)。
3.2 猫人参注射液作用于小鼠H22肝癌细胞的时效 、
量效关系 250mg ml 浓度的猫人参注射液在 24h ,
48h ,72h三个时相 ,对小鼠 H22肝癌细胞的生长抑制
作用存在较明显的时效关系:随着作用时间的延长
对肿瘤细胞的杀伤作用亦增强 , 48h ～ 72h 各浓度猫
人参注射液对肿瘤细胞的抑制率均在 30%以上 ,24h
表 1 猫人参注射液对不同肝癌细胞半数抑制浓度
肿瘤细胞类型 IC50(mg ml)
H22 107.70
CBRH-7919 519.49
SMMC-7721 667.56
与H22比较 , ＊P<0.05
图 1 猫人参注射液 72h对不同
肝癌细胞株的抑制作用
图 2 猫人参注射液对H22细胞株
不同时间的抑制作用
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浙江中医学院学报 2004年 3月第 28卷第 2期
万旭英,等: 猫人参注射液体外抗肝癌实验研究
图 3 72h不同浓度猫人参注射液对H22
肝癌细胞株的抑制作用
图 4 猫人参注射液浓度与抑制率的相关性
内猫人参注射液对小鼠 H22肝癌细胞的杀伤作用不
明显(见图 2);在 72h内 16.88 ～ 250mg ml浓度内有
一定的正线性相关量效关系趋势 , 其相关系数为
0.91 ,经 t 检验后有统计学意义。大于 250mg ml浓
度 ,抑制作用不随浓度的增加而增强(见图 3 ,图4)。
4 讨论
猫人参为地方性民间用草药 , 《中国药典》未曾收
录 ,其成分和药理作用目前尚不清楚 ,并未见有关单味
猫人参抗肿瘤作用的研究。近年来 ,认为猫人参的近
缘种植物———猕猴桃属植物中的中华猕猴桃 、毛花猕
猴桃 、软枣猕桃等有一定的抗肿瘤作用[ 4] 。猕猴桃根
的水提液 ,体外细胞毒实验对白血病细胞和结肠癌细
胞株的抑制率分别为 54.24%和 60.1%。中华猕猴桃
的根中提取的多糖复合物对肿瘤细胞有直接的杀伤作
用[ 5 ,6] 。我们在长期的临床实践中 ,用猫人参治疗肝
癌取得较好的疗效 ,为进一步探讨单味猫人参抗肝
癌作用的有效性 ,我们此前经不同的提取工艺及分
离方法对该植物的抗肿瘤有效部位进行了筛选 ,初
步研究猫人参抗肿瘤作用的有效部位是猫人参水提
液部分 ,并制成猫人参注射液。
肝癌细胞的发生和发展与肿瘤细胞的分化及增
殖过度有关 ,异常增殖是肿瘤细胞特征之一 ,抑制肿
瘤细胞生长是治疗肿瘤的有效途径 ,也是抗癌药物
的基本要求 。本实验首先选择了肝癌细胞株作抗癌
活性筛选 。采用四唑盐(MTT)比色法测定猫人参注
射液的抗癌活性 。MTT 法简单 、快捷 、敏感 、结果准
确可靠 ,被国内外广泛用于化疗药敏试验及抗癌新
药筛选[ 7 ,8] 。
实验结果表明:250mg ml浓度猫人参注射液对
H22 、CBRH-7919 、SMMC-7721肝癌细胞株在 72h 均
有抑制作用 ,抑制率分别 63.68%、41.51%、32.92%,
且对 H22肝癌细胞株较敏感 ,与 CBRH-7919 、SMMC
-7721比较有统计学意义(P <0.05), IC50分别为:
107.70mg ml 、 519.49mg ml 、 667.56mg ml;在 h24h 、
48h 、72h三个时相 ,对小鼠 H22肝癌细胞的生长抑制
作用存在较明显的时效关系:随着作用时间的延长
对肿瘤细胞的杀伤作用亦增强 ,48 ～ 72h 各浓度猫人
参注射液对肿瘤细胞的抑制率均在 30%以上 ,24h内
猫人参注射液对小鼠 H22肝癌细胞的杀伤作用不明
显;在 72h内 16.88 ～ 250mg ml浓度内有正相关趋势 ,
其相关系数为 r为 0.91;大于 250mg ml浓度 ,抑制作
用不随浓度的增加而增强。猫人参对不同肝癌细胞
株敏感性不同 ,可能与肝癌细胞的生物学特性不同
有关 。
参考文献
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(收稿日期 2003-09-11)
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浙江中医学院学报 2004年 3月第 28卷第 2期
万旭英,等: 猫人参注射液体外抗肝癌实验研究