全 文 ：2010 年 8 月 Vol． 28 No． 8
August 2010 Chinese Journal of Chromatography 809 ～ 812
技术与应用 DOI:10． 3724 /SP． J． 1123． 2010． 00809
* 通讯联系人:孙力军，博士，主要研究方向为生物技术． Tel: (025)85289850，E-mail:hanchuansun@ 126． com．
基金项目:国家科技支撑计划项目(No． 2006BAD07A04)和江苏省自然科学基金项目(No． BK2008095)．
收稿日期:2010-04-20
高速逆流色谱法分离纯化续随子种子中的七叶内酯
余 霞1，2， 张卫明2， 石雪萍2， 孙力军2*
(1． 南京师范大学生命科学学院，江苏 南京 210046;2． 南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042)
摘要:建立了高速逆流色谱(HSCCC)技术分离纯化续随子种子中七叶内酯的方法。将续随子种子的乙酸乙酯萃取
物直接进行高速逆流色谱分离，考察了不同溶剂系统的分离效果。结果表明，最佳的溶剂系统为氯仿-甲醇-水(体
积比为 4∶ 3∶ 2) ，以其上相为固定相，下相为流动相。从 200 mg续随子种子乙酸乙酯萃取物中分离得到 80 mg七叶
内酯，纯度为 99. 04%。HSCCC技术可高效分离纯化续随子种子中的七叶内酯，为得到高纯度的七叶内酯提供了制
备技术。
关键词:高速逆流色谱;七叶内酯;续随子种子
中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:1000-8713(2010)08-0809-04
Isolation and purification of esculetin from the seeds of
Euphorbia lathyris L． using high-speed
counter-current chromatography
YU Xia1，2，ZHANG Weiming2，SHI Xueping2，SUN Lijun2*
(1． College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210046，China;
2． Institute for the Comprehensive Utilization of Wild Plants，Nanjing 210042，China)
Abstract:A method for the isolation and purification of esculetin from the seeds of Euphorbia lathyris L．
was developed using high-speed counter-current chromatography (HSCCC)． The ethyl acetate extract of
the seeds of Euphorbia lathyris L． was separated by the HSCCC directly． Different solvent systems were
investigated，and the results showed that the best solvent system was the two-phase solvent system com-
posed of chloroform-methanol-water (4∶ 3∶ 2，v /v /v)． The lower phase was used as the mobile phase and
the upper phase was used as the stationary phase． A total of 80 mg esculetin with the purity of 99. 04%
was successfully obtained from 200 mg crude extract of the seeds of Euphorbia lathyris L． The results in-
dicate that optimized HSCCC offers a preferred method for the preparation of esculetin from the seeds of
Euphorbia lathyris L．
Key words:high-speed counter-current chromatography (HSCCC) ;esculetin;seeds of Euphorbia lathy-
ris L．
续随子(Euphorbia lathyris L．)属大戟科大戟属
植物。续随子的干燥成熟种子(即千金子)是我国
传统中药材，文献记载始见于《开宝本草》［1］。千金
子具有逐水消肿、破血消癥作用，主治水肿、痰饮、积
滞、胀满、二便不通、血瘀经闭，外治顽癣等［2］。文
献报道多为续随子种子中脂肪酸类物质的相关研
究［3 － 5］和千金子炮制的相关研究［6，7］。七叶内酯即
6，7-二羟基香豆素，为简单的香豆素类化合物(结构
式见图 1)。药理实验表明:七叶内酯具有抗炎、抗
菌止咳、祛痰、平喘等药理作用［8］。现代研究证明:
续随子种子中含有香豆素类成分，其中七叶内酯具
有促进血液循环的作用，动物实验结果表明其具有
增加尿量和促进尿酸从组织中排出的效果，这与中
医的逐水消肿作用一致［9］。
关于七叶内酯的分离纯化，通常采用硅胶柱色
谱法［10 － 14］，但结果差异较大。在使用柱色谱法分离
纯化物质时，样品在固定相的吸附是导致样品回收
率低的一个重要因素。高速逆流色谱(high-speed
色 谱 第 28 卷
图 1 七叶内酯的化学结构式
Fig． 1 Chemical structure of esculetin
counter-current chromatography，HSCCC)是一种基于
运转螺旋管内两相溶剂的单向性流体动力学现象而
获得高效率分离的色谱系统，是一种连续的无需任
何固体支持物的高效、快速的液-液分配色谱分离技
术。它不使用固相载体作固定相，克服了固相载体
带来的样品不可逆吸附、污染、失活和变性等缺点，
并且分离量大，样品无损失，回收率高，节约溶剂，而
且分离物能达到相当高的纯度。因此，HSCCC 已广
泛用于分离天然产物中的有效成分［15］和中国传统
中药的研究［16 － 19］，如苯丙素类物质［16］、香豆素类物
质［17］、萘醌素类物质［18］、黄酮类物质［19］。本研究采
用 HSCCC的分离方法，简便、快速、有效地分离纯化
了续随子种子中的七叶内酯。
1 实验部分
1． 1 仪器与试剂
TBE-300 高速逆流色谱仪(螺旋管行星式串联
3 柱逆流色谱仪，管径 1. 9 mm，柱体积 300 mL，进样
圈体积 20 mL) ，TBP-50A型双柱塞恒流泵(上海同
田生物技术有限公司) ，TBD-2000 型紫外检测器
(上海金达生化仪器有限公司) ，TC-1050 型恒温循
环器(上海同田生物技术有限公司) ，Agilent 1200
型高效液相色谱(HPLC)仪(美国 Agilent 公司) ，旋
转蒸发器 RE-2000(上海亚荣生化仪器厂)。
HPLC分析用甲醇为色谱纯(美国 Tedia公司) ，
高速逆流色谱和提取用试剂均为分析纯(南京化学
试剂有限公司)。
续随子种子为南京野生植物综合利用研究院选
育的高油优良品种，经钱学射研究员鉴定。
1． 2 方法
1． 2． 1 粗提物的制备
取续随子种子，经粉碎机粉碎，过 40 目筛。称
取 500 g干燥粉末，加入 1 000 mL 75%乙醇回流提
取 3 次，每次 2 h，过滤后合并滤液。将滤液减压浓
缩至浸膏后，加入热水，制成水悬浮液，然后依次用
等体积的正己烷萃取 7 次，乙酸乙酯、正丁醇各萃取
1 次。萃取后减压浓缩各相萃取液，实验所用样品
为乙酸乙酯相萃取产物。
1． 2． 2 溶剂体系和样品液的配制
在分液漏斗中配制氯仿-甲醇-水(体积比为 4∶ 3
∶ 2)两相溶剂体系，充分振荡后在室温下静置过夜。
使用前分别取上相和下相，超声脱气 30 min。
取 200 mg续随子种子的乙酸乙酯相萃取物，依
次加入 6 mL甲醇、8 mL 氯仿和 4 mL 水溶解样品，
备用。
1． 2． 3 HSCCC分离样品
以 10 mL /min 的流速将溶剂体系的上相注入
HSCCC分离管中，待上相充满整个管路后调整主机
转速为 800 r /min，再以 1. 5 mL /min流速注入下相;
待流动相(即下相)从柱口流出，两相在分离管中达
到动态平衡后，由进样口注入 18 mL样品液，于 254
nm波长下检测，记录色谱图，根据色谱图收集目标
成分。
1． 2． 4 纯度分析
应用 HPLC 对制备得到的样品进行纯度分析。
所用色谱柱为 Zorbax Eclipse XDB-C18 柱(150 mm
×4. 6 mm，5 μm) ，检测波长 254 nm，测定温度 25
℃，进样量为 10 μL。流动相为甲醇和 0. 4%磷酸水
溶液，流速为 0. 8 mL /min;梯度洗脱程序:0 ～ 20
min，10%甲醇 ～35%甲醇;20 ～ 30 min，35%甲醇 ～
50%甲醇;30 ～40 min，50%甲醇 ～10%甲醇。
2 结果与讨论
2． 1 样品前处理方法的选择
对比了不同浓度乙醇的回流提取效果以及各萃
取溶剂的萃取次数对产物收率的影响。实验结果显
示，75%乙醇的提取率要高于 95%和 70%乙醇的提
取率。所以本文采用 75%乙醇，料液比 1∶ 2，回流提
取 3 次，每次 2 h。由于续随子种子的含油量高达
45% ［20］，因此去除脂肪酸甘油酯类物质对后续实验
很关键。预实验表明:用正己烷至少萃取 7 次才能
基本去除脂肪酸甘油酯类物质。
2． 2 HSCCC分离条件的选择
在高速逆流色谱中，溶剂系统的选择至关重要，
合适的溶剂系统是其分离的关键。本实验依据所分
离化合物的特性及 HSCCC 分离香豆素的相关报
道［21，22］，考察了不同溶剂体系中样品的分配系数，
以此来优选续随子种子中七叶内酯的最佳溶剂体系
的配比。按溶剂体系配制一定体积的上相、下相溶
剂，平衡好后，各取相同体积的上相、下相溶剂放置
于同一容器中。加入一定量的样品，剧烈振摇后静
置，待上相与下相分层后，取相同体积的上相和下相
样品液，注入 HPLC 仪测定目标成分在上相和下相
中的浓度 CS 和 CM，用来计算分配系数 K (K = CS /
CM) ，以选取合适的溶剂系统
［23 － 25］。一般情况下，
·018·
第 8 期 余 霞，等:高速逆流色谱法分离纯化续随子种子中的七叶内酯
分配系数 K值在 0. 5 ～ 1 之间能得到令人满意的分
离效果［26］。采用体积比为 4∶ 3∶ 2 的氯仿-甲醇-水溶
剂体系时七叶内酯的分配系数 K = 0. 85(见表 1) ，
因此本文选择此溶剂体系进行 HSCCC 分离。实验
过程中，还对流动相的流速进行了优化，最终选择流
动相的流速为 1. 5 mL /min。
表 1 续随子种子粗提物中七叶内酯在不同溶剂体系中的分配系数
Table 1 Partition coefficients (K)of esculetin in the crude extract from the seeds of
Euphorbia lathyris L． in different two-phase solvent systems
No． Solvent system K
1 n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (3∶ 5∶ 3∶ 5，v /v /v /v) 2． 47
2 n-hexane-ethyl acetate-methanol-water (3． 4∶ 5∶ 3． 4∶ 5，v /v /v /v) 0． 37
3 n-hexane-methanol-water (5∶ 5∶ 5，v /v /v) 6． 44
4 light petroleum-ethyl acetate-methanol-water (5∶ 5∶ 7∶ 4，v /v /v /v) 5． 92
5 chloroform-methanol-water (4∶ 3∶ 2，v /v /v) 0． 85
2． 3 HSCCC分离制备结果
采用 HSCCC对续随子种子的乙酸乙酯萃取物
进行了分离，固定相保留率为 70%，分离时间为 5 h，
HSCCC色谱图见图 2;根据 HSCCC 图谱手动收集，
收集了 5 个组分(见图 2 中的组分 I ～ V)。将各收
集组分减压浓缩干燥并对各收集物进行 HPLC
分析。
图 2 续随子种子粗提物的高速逆流色谱图
Fig． 2 HSCCC chromatogram of the crude extract
from the seeds of Euphorbia lathyris L．
HSCCC conditions:solvent system，chloroform-methanol-water (4∶
3∶ 2，v /v /v) ;the upper phase as stationary phase，the lower phase as
mobile phase;flow rate，1. 5 mL /min;revolution speed，800 r /min;
detection wavelength，254 nm;retention of the stationary phase，70%
．
对组分 V进行减压浓缩，得到淡黄色粉末状物
质 80 mg(进样量为 200 mg) ，收率为 40%。对组分
V进行 HPLC 检测(谱图见图 3) ，采用峰面积归一
化法测定其纯度为 99. 04%。
对组分 V进行结构鉴定。其为淡黄色粉末，易
溶于二甲基亚砜(DMSO)。飞行时间质谱(TOF
MS)鉴定结果:m/z 201. 09 ( ［M + Na］+ ) ;m/z
177. 13 ( ［M － H］－，相对丰度为 100%)。核磁共振
氢谱(1H-NMR) (500 MHz，DMSO)鉴定结果:δ:
6. 169(1H，d，J = 9. 5 Hz，H-3) ，6. 714(1H，s，H-
5) ，6. 980(1H，s，H-8) ，7. 871(1H，d，J = 9. 5
图 3 (a)续随子种子粗提物和(b)HSCCC
分离得到的七叶内酯的 HPLC谱图
Fig． 3 HPLC chromatograms of (a)the crude extract
of the seeds of Euphorbia lathyris L． and (b)
the prepared esculetin by HSCCC from the
crude extract
Hz，H-4) ，9. 402(1H，s，6-OH) ，10. 211(1H，s，
7-OH)。以上波谱数据与文献［12，13，27］报道一
致，故鉴定组分 V为七叶内酯。
经减压浓缩和 HPLC 分析测定后，HSCCC 分离
所得组分 I ～ IV 中七叶内酯的含量少且成分复杂，
有待于进一步的分析研究。
上述实验结果表明，利用 HSCCC对七叶内酯进
行大量制备分离的方法切实可行。七叶内酯易溶于
三氯甲烷、甲醇、乙醇等有机溶剂的特性，使得氯仿-
甲醇-水(4 ∶ 3 ∶ 2，v /v /v)溶剂体系中的下相可以很
好地溶解粗提物中的七叶内酯，这可能是该溶剂体
系的优越处所在。
·118·
色 谱 第 28 卷
3 结论
建立了高速逆流色谱从续随子种子中分离制备
七叶内酯的方法。该方法具有简便、快速、节省溶剂
等特点，具有较好的应用价值，且对于后续的续随子
种子的药理研究和综合利用都具有非常重要的参考
价值。
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