全 文 ：文章编号:0490-6756(2001)05-0752-04
野花生豆凝集素半胱氨酸残基的研究
汪新艳 , 周红 , 刘一勇 , 吴传芳 , 吕辉 , 鲍锦库＊
(四川大学生命科学学院 ,成都 610064)
摘要:将野花生豆经浸取 、硫酸铵分级沉淀 、猪胃粘蛋白-Sepharose 4B 亲和层析和 Sephacryl S-200 HR分
子筛层析后 , 可得到对人类 A型血专一凝集的野花生豆凝集素(Crotalaria mucronata Lectin , CML).纯化的
CM L在 PAGE 和 SDS-PAGE 中均显示单一蛋白带.在含 8mol/ L 脲和不含脲的缓冲体系中 , 分别用 NEM 修
饰 CML 中的半胱氨酸残基 ,经计算被修饰巯基数目分别为 3.1个和 3.2 个 ,且修饰后的 CML 的活性仍不丧
失.通过 NR/ R单向 SDS-PAGE和 NR/ R双向对角线 SDS-PAGE 研究 ,发现 CML 不含二硫键 , 表明 CML 中
的半胱氨酸残基既与 CML 的凝集活性无关 ,也不形成稳定蛋白质结构的二硫键.
关键词:野花生豆凝集素;半胱氨酸;巯基;二硫键
中图法分类号:Q51　　　文献标识码:A
野花生豆凝集素(Crotalaria mucronata Lect in , CML)是从野花生豆中分离纯化的一种表观分子量为
103KD且含两个相同亚基的糖蛋白 ,对它的分离纯化 、亚基组成 、色氨酸修饰与荧光光谱研究结果已有报
道[ 1 ,2].半胱氨酸残基在蛋白质分子中有着重要地位.一方面它是某些蛋白质发挥生物学功能所必需.另一
方面 ,它们可形成二硫键 ,而二硫键在蛋白质分子折叠与去折叠中具有重要作用.在许多凝集素比如蓖麻凝
集素 、相思豆凝集素中 ,都含有半胱氨酸残基[ 3] ,并发挥着重要作用.我们以下报道在快速 、简便纯化 CML
的基础上 ,对半胱氨酸残基所进行的研究 ,以揭示其在 CML中的作用.
1　材料与方法
1.1　材料
野花生豆种子采自福建省;新鲜正常人 A 型血采自成都市第六人民医院;Sephacry l S-200 HR购自
Pharmacia公司;SDS-PAGE低分子量标准为上海丽珠东风生物技术有限公司产品;N-乙基顺丁烯二酰亚胺
(NEM)为上海东风生化试剂厂产品;β-巯基乙醇(β-ME)为国产分析纯;其余试剂均为分析纯.
1.2　方法
1.2.1　蛋白质浓度的测定　用 Folin-酚试剂测定 ,以牛血清白蛋白作标准.
1.2.2　CML 活性测定　按文[ 3]的方法进行.
1.2.3　CML 的分离纯化 　亲和层析样品按文[ 1] 的方法制备.Sephacryl S-200经清洗后装柱(100cm ×
1.6cm),以生理盐水平衡.将亲和层析样品用生理盐水溶解(浓度约为 2%),平衡后上柱(约 10mL),生理盐
水洗脱 ,分部收集.流速 12mL/h ,3mL/管 ,测定 280nm 处光吸收值 ,以人类 A型血红细胞检查凝集活性 ,合
并活性部分 、透析 、冷冻干燥后 ,进行以下各项测定.
1.2.4　CML纯度鉴定　聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)按文[ 4] 的方法进行.采用不连续系统 ,分离胶浓度
7.5%,浓缩胶浓度 4%,考马斯亮蓝 R-250染色 , 7%乙酸溶液中保存;SDS-PAGE 按 Laemmli系统[ 5]进行.
采用非连续系统 ,分离胶浓度 10%,浓缩胶浓度 4%,染色 、保存与 PAGE同.
1.2.5　CML 与 NEM 反应　按 Robert[ 6 , 7]等的方法进行 ,即取 0.864mg CML ,用生理盐水配制成 2mL 溶
液 ,在室温下加入 10μL NEM 溶液(浓度为 0.1mmol/L)与 CML 进行反应 ,反应 5min后 ,测定 300nm 处的
收稿日期:2000-10-18作者简介:汪新艳(1976-), 男 , 1999 级硕士研究生.＊通讯联系人
2001年 10月
第 38卷第 5期
四川大学学报(自然科学版)
Journal of Sichuan University (Natural Science Edition)
Oct.2001
Vol.38　No.5
光吸收值 ,以后每隔 5min加入 10μL NEM 溶液 ,反应后测定 300nm 处的光吸收值 ,直至加入 NEM 溶液 ,使
其在 300nm 处的光吸收值不再下降为止 ,按下式计算 CML 分子中的巯基数:c(-SH)=ΔA300nm/ε=
ΔA300nm/620(ε为 NEM 在 300nm 处的摩尔消光系数).
将上述在 300nm 处光吸收值不再变化的 CML ,经 Sephadex G-25柱 ,除去过量的 NEM ,分部收集样品 ,
测定反应前后凝集活性.另取一份样品 ,加入 8mol/ L 的脲 ,调 pH 值为 7.0 ,进行反应.反应后 ,透析除去脲 ,
测定凝集活性.
1.2.6　NR/R单向 SDS-PAGE　在 Laemmli[ 5]方法的基础上略作改进 ,即将两份同一样品 ,分别经含 β-ME
(R ,还原)和不含 β-ME(NR ,非还原)的样品处理液处理 ,在相同胶上进行 SDS-PAGE ,并比较电泳结果.
1.2.7　NR/R双向对角线 SDS-PAGE　参照文[ 8] 的方法进行 ,第一向为 10%SDS-PAGE(9.5cm ×6.5cm
×0.75mm 板胶),样品处理液为 62.5mmol/L Tris-HCl , 2%SDS , 10%甘油 , pH6.8.第二向为 10%SDS-
PAGE(9.5cm ×6.5cm×1mm 板胶),样品处理液为第一向处理液中加入 5%β-ME ,样品经第一向样品处理
液在室温下处理 1h后进行电泳.第一向结束后 ,按加样孔切下胶条 ,置于第二向样品处理液中 ,在室温下浸
泡 90min ,然后把胶条置于第二向胶上进行第二向电泳.按文[ 4]方法进行银染 ,高水中保存.
2　结果
2.1　Sephacryl S-200层析
结果如图 1所示 ,层析洗脱得到 3个峰.其中峰Ⅰ为活性峰.
图 1　Sephacry l S-200 分子筛层析纯化野花生豆凝集素
柱床:100cm×1.6cm ,流速:12m L/ h , 3mL/管 ,峰Ⅰ为活性峰
2.2　CML 的纯度鉴定
将分子筛层析峰 Ⅰ进行 PAGE和 SDS-PAGE实验 ,纯化的 CML 均为一条单一蛋白带.表明 CML 经过
上述分离纯化步骤后 ,可获得单一样品(图 2).
2.3　NEM 对 CML 分子的修饰
N EM 在 300nm 处有吸收值 ,当 NEM 与巯基反应产生一种很稳定的衍生物时 ,会导致 300nm 处的吸收
值下降.因此 ,测定 300nm 处的 ΔA 值 ,就可计算被修饰的巯基数.在反应体系中无脲时 ,当向体系中加入
160μL NEM 后 , A300nm下降 0.017后不再下降 ,按文[ 6]的方法计算 , CML 中约有 3.2 个巯基被修饰.在反
应体系中含8mol/ L 脲时 ,向体系中加入 160μL NEM 后 , A300nm下降 0.016后不再下降.经计算 ,脲变性条件
下 ,CML中约有 3.1个巯基被修饰.这个结果表明 ,在无脲条件下 ,CML 中的巯基可被全部修饰.活性测定
发现两种条件下修饰的 CML 的活性均未改变 ,表明 CML 中的巯基与其活性无关 ,同时 , CML 对脲变性是
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可回复的.
图 2　聚丙烯酰胺电泳图谱和 SDS-聚丙烯酰胺电泳图谱
(a)凝集素粗品(b)亲和层析样品(c)S-200分子筛层析的第 1个峰
2.4　NR/R单向 SDS-PAGE
将两份同样的样品经过不同处理液处理后 ,在胶板上位于同一水平线上 ,判定 CML 中无二硫键存在
(图 3).
图 3　N R/ R单向 SDS-PAGE和 NR/ R双向对角线 SDS-PAGE 结果
电泳方向:第一向从左(阴极)至右(阳极), NR;第二向从上(阴极)至下(阳极), R
2.5　NR/R双向对角线 SDS-PAGE
既无链内又无键间二硫键的分子位于对角线上(两向电泳中分子迁移率相等);存在键内二硫键的分子
位于对角线上方(第一向泳动快 ,第二向泳动慢);存在链间二硫键的分子由于第二向电泳时被还原 ,分子变
成小的肽链而位于对角线下方.
CML 位于对角线上 ,因此不含二硫键 ,牛血清白蛋白因含有数对链内二硫键位于对角线上方 ,胰蛋白酶
抑制剂在第一向中出现两条带 ,导致在第二向中出现两个斑点 ,兔磷酸化酶在第二向中丢失(图 3 ,图 4).
由于 NR/R单向 SDS-PAGE的结果 ,两份相同样品处在同一水平线上.因此 ,判定 CML 分子中不含二
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硫键.
图 4　NR/ R双向对角线 SDS-PAGE 痕迹图
样品-分子量标准蛋白:A.兔磷酸化酶(97 , 400);a.牛血清白蛋白(66 , 200);b.兔肌动蛋白(43 , 000);c.
野花生豆凝集素;d.牛碳酸酐酶(31 , 000);e.胰蛋白酶抑制剂(20 , 100);f.鸡蛋清溶菌酶(14 , 400)
3　讨论
通过 NEM 在无脲和含有 8moL/L 脲的缓冲体系中 ,对巯基进行修饰 ,结果 NEM 只能修饰大约 3个巯
基 ,这表明 CML 的巯基全部位于 CML 分子表面或处于 NEM 能够进入的浅表部位.在 CML 处于天然状态
下 ,NEM 就可以修饰其所有巯基.修饰巯基后 , CML 仍有活性 ,表明巯基并非 CML 凝集活性所必需.二硫
键是凝集素分子中重要的侧链基团 ,在蛋白质分子各级结构中有特殊重要的作用.但 CML 中的半胱氨酸残
基并不彼此形成二硫键 ,这就与相思豆凝集素和蓖麻素凝集素不同 ,后两者都含有重要的二硫键.由此看来 ,
CML 中的半胱氨酸残基既不是CML 凝集人类 A型血红细胞所必需 ,又不形成二硫键 ,它在 CML 分子结构
与功能中扮演的角色有待更深入的研究并加以阐明.
参考文献:
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THE STUDYON CYTEINES IN CROTALARIA MUCRONATA LECTIN
WANG X in-yan , ZHOU Hong , LIU Yi-yong , WU Chuan-fang , LU Hui , BAO Jin-ku
(College of Life Science , Sichuan University ,Chengdu 610064 ,China)
Abstract:Crotalaria mucronata lectin(CML)was purified f rom seeds of Crotalaria mucronata by ex trac-
tion , fraction with(NH4)2SO4 ,hog gastric mucin-Sepharose 4B af finity chromatography and followed by gel fil-
tration of Sephacryl S-200 HR.CML agglutinates type A human red blood cells specially.The purifed CML
gave one band on acrylamide gel elect rophoresis and on SDS acrylamide gel elect ropho resis.The purif ied CML
modif ied by N-ethymaleimide in the physiological saline containing 8mol/L urea or not has agglutinate activity.
There are 3.1 sulfhydryl groups in CML modif ied w ith 8mol/L urea and 3.2 sulfhydry l g roups in CML modified
w ithout urea.The trials of N R/R single-dimensional SDS-PAGE and N R/R two-dimensional SDS-PAGE prove
that CM L has not disulfide bond.The cysteines in CML are no essential fo r it s activity and don t form disulfide
bond.
Key words:Crotalaria mucronata lectin;cysteine;sulfhydryl g roups;disulfide bond
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