全 文 ：2 27
·实验研究 ·
排钱草总生物碱对肝纤维化大鼠工 、 班型胶原
m R N A 表达的影响 ’
钟 鸣` 余胜 民` 农朝赞2 潘莉莉2
1
. 广西民族医药研究所 (广西 南宁 , 53 0 0() l)
杨增艳 , 黄琳芸 , 陈少锋 ,
2
. 广西民族医院
摘要 目的 : 探讨排钱草总生物碱对肝纤维化大鼠肝组织 I 、 班型胶原 n识叫 A 表达的影响 。 方法 : 采用逆转录
定量 PC R 方法测定不 同 .hJ 童排钱草总生物碱对大鼠肝组织 I 、 1 型胶原 n识 N A 的相对表达值。 结果 : 高、 中剂量组
大鼠肝组织 I 、 m型胶原 m丑 N A表达显著低于模型组 , 尸 < 0 . 05 。 与正常时照组相比差异无显著性意义 。 结论 : 排钱
草总生物碱能显著降低猪血清所致免疚性肝纤维化大风肝脏 I 、 皿型胶原 m RN A 的表达 。
关键词 药理学 ; 排钱草总生物碱 /药效学 ; 肝纤维化 ; 胶原 ; 大鼠
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c t s o f D e s m诫 i u n P u l c h e l l u m ( L . ) B e n t h T o t a l A l k a lo id s on OC I一 1 a n d
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胶原是肝纤维化时肝脏细胞外基质的主要成分 ,
本研究 旨在观察排钱草总生物碱对 I 、 班型胶原
m R N A 表达的影响 。
材料和方法
实验动物 SP F 级雌性 W i st a r 大白鼠 , 体重
( 180 士 12 9 ) , 由广西医科大学实验动物中心提供 , 动
物合格证桂动许字 ( 2 000) 第 001 号 。
1
.
2 实验分组及动物模型的制作 除 10 只作正常组
( F 组 ) 外 , 其余 50 只采用腹腔注射猪血清的方法造
模 l1[ 。 模型大鼠随机分组为模型对照组 ( E 组 ) 、 排
钱草总生物碱高剂量组 ( A 组 , 30 gtn 众g ) 、 排钱草
总生物碱中剂量组 ( B 组 , 20 grn 人 g ) 、 排钱草总生
物碱低剂量组 ( C 组 , 10 mg 人 g ) 、 秋水仙碱阳性对
照组 ( D 组 , 0 . 1哩八 g ) 。 在造模同时 , A 、 B 、 C 、
D 组大鼠灌胃给药 ; E 、 F 组大鼠灌以等体积蒸馏水 ,
l 次 d/ , 连续 8 周 。
1
.
3 肝组织总 R N A 的提取 采用 aT kar 公司生产
的一步法总 RN A 提取试剂盒 , 即 T R I ZO L 试剂提取
组织总 R N A , 采用分光光度计测定提取的总 R N A 含
量及纯度 , A 2 60 / A 280 值在 1 . 8一 2 . 0 之间 。
1
.
4 主要试剂 R N A 酶抑制剂 , dN TP , 01 190 D T ,
M M L V 均为 eF mr en t as 公司产品 , T a q 酶为 M I3 I公
司产品 , 琼脂糖为华美生物工程公司产品。
1
.
5 主要仪器 美国 压 e km an D U ~ 64 0 紫外分光光
度计 , 德 国 iB om et ar 公 司 -T G r a d ien t hT e~ bl oc k
D N A 扩增仪 , F uj if lm 公 司凝胶成像系统 (盯 I-
.
J上且Jl
· 基金项目 : 国家自然科学基金资助课题 (两 : 3 02 60 12 3)
中西医结合肝病杂志 20 3年第 1 3卷第 5 期 7 2 3
50 0 )
。
1
.
6 引物 参照文献〔 2一 5〕 , 由上海生工生物工程公
司合成 。 引物序列如下 : 大鼠 。 1工型胶原 (引 lage n
工) 引物 , 上 游 : 5’ 一C义三T T I石 G A G A G A G C A
1’G A GG 3’ , 下游 : 5’ ~ T r r G G G G A A A T T G A G
丁T l , C凌弘 3’ 。 它们分别与大鼠 工型胶原 a1 链 cD N A
的第 394 1一 3960 位和第 4 4 3 5一 4 5 4 位碱基相对应 ,
可产生 1个 sl 4 bp 的 D N A 片段 。 班型胶原 (6 nag en
1 ) 引物 , 上游 5 ’ ~ A T G G T G G C I , T T C A G T T C A
GC 3’ , 下游 5’ ~ T GG G G T T T C A G A G A G I , IT G G
3
’ 。 它们分别与大鼠 1 型胶原 al 链 cD N A 的第 15 09
一 15 28 位和第 19 3 3一 19 14 位碱基相对应 , 可产生 1
个 4 2 5b p 的 D N A 片段 。 G AP D H 引物 , 上游 5’ 一G A C
A T C A A G A A G G T G G T G A A O已 3’ , 下游 : 5’ ~ T G T
CA T T G A G A G C A A T GC CA G G 3’ 。
1
.
7 cD N A 合成 采用 20 川逆转录反应体系 , 内含
5 X b u ft e r 4拜l 、 dN T P Z拜l ( 1 0m M ) 、 0 11即 E n , ( 15
p ir me sr ) l阳 m/ I、 MM V I拜 I ( ZOOU今 I ) 、 RN A 酶抑
制剂 2拼 l ( 2 0 U今 l ) R N A 4阳 、 4 2℃ 反应 1 小 时 ,
9 5℃ 5 分钟灭活 M MV 。
1
.
8 共扩增定量 P C R6[] PcR 反应体系为 50 川 , 内
含 10 X b u fe r s 拜l , 4 X dN TP 4拜l ( 2
.
5 n 1M )
, 。 l一 I
( co l
一皿 ) 、 G A p D H 引物上下游各 l 拜l ( 20拼M ) , cD -
N A 2
.
5拌l , aT q 酶 0 . 5拜l ( SU ) , M gC I: 5拌l ( 2 5m M ) ,
用水补至 50 闪。 PCR 反应在 0
.
2m【薄壁管中进行 ,
用 P CR 仪扩增 。 P C R 反应参数为 : 94 ℃预变性 2 分
钟 : 4℃变性 3 0 秒 ; 5 5℃ 退火 30 秒 ; 7 2℃ 延伸 5 0
秒 , 30 个循环 ; 72 ℃后延伸 7 分钟 。
1
.
9 扩增产物分析 扩增产物在 1 . 2 % 琼脂糖凝胶
上进行电泳 , 肠1一 工、 oC l一 1 和 G A P D H 的扩增产物
分别为 s l 4 b p 、 4 2 5b p 和 14 s b p 。 扩增产物以凝胶成
像系统进行分析 , 用 6 1一 I ( 6 卜m ) G/ AP D H 的比
值表示 肠 l一 工 (肠 l一班) 的相对表达水平 。
1
.
10 统计学方法 结果 以 王士 : 表示 , 应用单因素
方差分析进行统计学处理 。
2 结果
排钱草总生物碱高 、 中 、低 3 个剂量均有降低 肠】-
工和 Cb l一 m的作用 ,结果分别见图 1 、图 2 和表 1 。
3 讨论
肝纤维化的显著特征性改变是肝细胞外基质
( E CM ) 的生成增多和异常沉积 。 E CM 包括胶原 、
非胶原糖蛋白以及蛋白聚糖三大类成分 。 目前已确定
有 I 、 班 、 W 、 V 、 VI 、 X VI 、 X 姗型 7 种肝内胶
1 1 1 ! 1 1 1
M别kr 亡rS 空 模 阳 低 中 高
图 1 排钱草总生物碱对 Cb l一工m RN A 表达的抑制作用
M . 服e sr 空 模 阳 低 中 高
图 2 排钱草总生物碱对 伪卜nI mR N A 表达的抑制作用
表 1 排钱草总生物碱对伪卜 I 和 引 一 m相对表达值的影响 《王士 : )
组别
A 组
B 组
C 组
D 组
E 组
F组
工型胶原 m R NA
0
.
5 6 5 0 土 0 . 14 9 0 .
0
.
5 90() 士 0 . 17 0 5 .
0
.
6 7 7 3士 0 . 2 0 12
0
.
4 9 8 2 士 0 . 16 9 5 份
0
.
8 3 2 3 士 0 . 0 9 9 9
0
.
6 84 2 士 0 . 0 5 2 2 .
m型胶原 n识凶 A
0
.
8 7 2 6 士0 . 16 5 4 奋
0
.
9 2 3 6 土0 . 14 14 .
1
.
0 3 7 7 士 0 . 2 64 9
0
.
8 5 7 0 土0 . 2 18 0 .
1
.
2 3 7 6 士0 . 2 6 6 9
0
.
9 74 1士0
.
14 4 4
.
与模型组相比 , 荟 P ( 0 . 0 5 , 黄 铸 P < 0 . 0 1
原 。 肝纤维化时 , E CM 的量和质均发生显著变化 ,
以胶原为主的 E C M 成分较正常时大量增加 , 各种胶
原之间 , 糖蛋白之间及蛋白聚糖之间的比值也异常。
就胶原而言 , 在纤维化早期 VI 型胶原较多 , 纤维化晚
期则表现为 工型和 班型胶原含量较多 。 肝星状细胞
(H SC ) 是产生胶原的主要来源 。 正常情况下 , H SC
处于静息状态 , 肝脏在受损后 , H S C 被激活转化为
肌成纤维样细胞 , 其胞浆脂滴丢失 、 形态改变 、 表达
平滑肌 -a 肌动蛋白和多种细胞因子及其受体 , 并大量
增殖 , 合成以 工、 皿型胶原为主的多种 EQ M 。 H SC
的激活最终可造成 E C M 在肝内过量沉积 , 是肝纤维
2 7 4
化发生的中心环节 。 工、 皿型胶原在肝内的分布有所
不同 , 工型胶原分布于纤维间隔 , 班型胶原分布于网
状纤维 。 对胶原合成的研究主要集中于对胶原基因的
调节作用 , 包括细胞核内的遗传信息复制与转录 ,
功R N A 入胞质经修饰 、 翻译合成前 。 肤链 , 脯氨酸
和赖氨酸被经化 , 经氛酞残基糖化 , a 肤链 3 条链结
合形成 3 股螺旋结构 ; 新合成的前胶原在胞外间隙 ,
前胶原氨肤酶和校肤酶裂解前胶原使其转变为原胶
原 , 并聚合成胶原纤维 ; 在单胺氧化酶作用下 , 胶原
纤维共价交联形成稳定的不溶性胶原参与 E Q M 的组
成 。 肝纤维化时除 H S C 对胶原 m R N A 的表达明显增
加外 , 一些细胞因子可在转录水平调节或通过转录后
机制起作用 。
许多中药能够通过多环节 、 多位点阻断肝纤维化
的形成 , 因此值得深人研究 。 排钱草 比艳`从叔 iu m
uP hlc el
u m
,
( L
.
) 刀沙之ht l 为广西民间常用草药 , 具
有清热利湿 、 祛风 、 活血祛痕 、 软坚散结的功效 , 其
抗肝纤维化的功效已经前期的研究得到证实 v[] , 排
钱草总生物碱能显著降低肝纤维化大鼠血清 A L T 、
II A
、
7
一球蛋白及肝组织 H即 含量 , 能显著提高肝纤
维化大鼠肝脏抗氧化能力和诱导 7 一干扰素的产生 ,
具有较强的抑制肝星状细胞活化与胶原合成的作用 ,
抑制胶原合成机制待阐明。 本实验结果表明 , 肝纤维
化大鼠肝组织 工型和班型胶原 切丑N A 的表达明显增
加 , 而排钱草总生物碱能显著降低其表达 , 可能是其
抗肝纤维化的主要作用机制 。
参考文献
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(上接第 271 页 ) 进一步深人 , H BV 感染发病机制将
更加明了 , 从而为乙型肝炎的个体化诊疗提供可靠的
依据 。
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M曰 , 19 9 2 , 1 : 17 5 ( 2 ) : 4 9 5一 502
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(收稿 日期 : 20 03 一 06 一 is 编样 : 姚昌嫂 )