全 文 ：分子植物育种，2008年，第6卷，第2期，第393-398页
MolecularPlantBreeding,2008,Vol.6,No.2,393-398
新思路、新技术、新方法
NovelThinking&Technology
葎草DNA的提取及AFLP标记反应体系的建立
肖理慧 1 高武军 1,2* 张小莉 2 卢龙斗 1 邓传良 1 路淑霞 1
1河南师范大学生命科学学院,新乡,453007;2河南大学生命科学学院,开封,475001
*通讯作者,gao.wujun@yahoo.com.cn
摘 要 本文对CTAB法、改良CTAB法和SDS法提取雌雄异株植物葎草(HumulusscandensL.)基因组的方
法进行了比较分析，并在此基础上对影响葎草AFLP扩增的关键因素模板浓度、酶切时间、选择性扩增模板浓
度进行了优化。结果表明，改良的CTAB法更适合葎草基因组DNA的提取；同时利用AFLP分子标记技术，采
用EcoI-MseⅠ酶切组合，共筛选27对引物组合，确定了适用于葎草AFLP反应的最佳酶切连接、预扩和选扩
体系。同时发现2对引物组合E-ACG+M-CTA和E-AAC+M-CAC共扩增出5条雌雄性别特异条带。
关键词 葎草,DNA提取,AFLP反应体系的建立
DNAExtractionandEstablishmentofAFLPMarkerReactionSystemof
Humulusscandens
XiaoLihui1 GaoWujun1,2* ZhangXiaoLi2 LuLongdou1 DengChuanliang1 LuShuxia1
1ColegeofLifeSciences,HenanNormalUniversity,Xinxiang,453007;2ColegeofLifeSciences,HenanUniversity,Kaifeng,475001
*Corespondingauthor,gao.wujun@yahoo.com.cn
Abstract TheoptimizedAFLP (amplifieddragmentlengthpolymorphism)analysissystemwasestablishedby
comparingandanalysingthemethodsofCTAB (cetylrimethylammoniumbomide),improvedCTABandSDS
(sodiumdodecylsulfate)usedforgenomicDNAextractionoffemaleandmaleleavesofadioeciousHumulus
scandensandbystudyingtheessentialfactors(i.e.thedensityofthegenomicDNAtemplate,thetimeofthere-
strictionreactionandthedensityoftheselectiveexpandingtemplate)thatinfluencedtheresultsofAFLPmethod.
TheresultsindicatedthatthemethodofimprovedCTABshouldbemoreappropriateforHumulusscandensge-
nomicDNAextraction.BytheAFLPtechnique,usingMseI-EcoRIenzyme-cutingcombination,theoptimalre-
striction-ligasereactionsystem,pre-expandingsystemandselectiveexpandingsystemweredeterminedandtwo
pairsofprimers(i.e.E-ACG+M-CTAandE-AAC+M-CAC)withfivedistinctiveAFLPsex-markerswereselected
from27pairsofprimercombination.
Keywords HumulusscandensL.,DNAextraction,EstablishmentofAFLPreactionsystem
葎草(HumulusscandensL.)又名拉拉秧、拉拉藤，
是桑科(Moraceae)葎草属(Humulus)植物，雌雄异株，
其性别由基因平衡控制，雌性性染色体组成为XX，雄
性为XY1Y2(Parker,1990;王连军等,2007)，是研究雌
雄异株植物性别决定机制的有利材料。近年来虽然有
关葎草的生药鉴定(严寒静,2004)、特异蛋白(李东栋
等,2006)等方面的研究已见报道，但是关于其性别决
定机制方面的研究却仍未见更加详细的报道。
AFLP技术是由Vos等(1995)发明的一种DNA
基金项目：本研究由河南省教育厅自然科学基金(2006180014)和新乡市科技攻关项目(07N050)资助
指纹技术，该技术自诞生以来已经成功用于多种植
物的高密度遗传图谱的构建、分子标记的筛选以及
遗传多样性的研究。并且在多种雌雄异株植物芦笋
(Spadaetal.,1998)、大麻 (Peiletal.,2003)、无花果
(Parishetal.,2004)、叶蓼(StehlikandBlatner,2004)
中获得了性别连锁的标记。但AFLP技术往往受多
种因素(尤其是实验材料的C值等)的影响，且该技术
环节多，要求严格，因此根据实验材料进行AFLP技
术体系优化是必要的。
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
本研究对葎草 DNA提取方法以及影响 AFLP
技术的关键因素进行优化，旨在建立适宜于葎草性
别连锁标记分析的AFLP技术体系，为进一步利用
葎草进行性别决定机制的研究以及控制葎草对农田
的危害提供新的技术思路。
1材料和方法
1.1植物材料
供试葎草(HumulusscandensL.)材料取于河南师
范大学校生物园地，已知性别的雌雄葎草各10株，
取其嫩叶洗净后分装，硅胶干燥后保存备用。
1.2实验药品仪器
主要试剂：CTAB，SDS，PVP(polyvinypyroli-
done)，EcoRⅠ，MseⅠ，T4ligase，Taq聚合酶，dNTP(de-
oxyribonucleotidetriphosphate)，MgCl2，甲叉双丙烯
酰胺等试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。接
头、引物(表 1)由宝生物工程(大连)有限公司合
成。
主要仪器：DNA扩增仪 (PTC-100,MJResearch
公司,美国)，离心机(Sigma3K230型,美国)，变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳系统装置(Bio-Rad公司,美国)，高
速台式离心机(Eppendorf,德国)。
表1葎草AFLP分析的限制性酶切位点、接头及引物序列
Table1Restrictionsites(symbols↓↑includetheactualcutingsites),adapterandprimersequencesusingAFLP
限制性内切酶
Restrictionenzymes
酶切位点
Restrictionsites
接头序列
Adapters
预扩增引物
Preamplificationprimers
选择性扩增引物
Selectiveamplificationprimers
EcoRⅠ
5-G↓AATTC-3
3-CTTAA↑G-5
5-CTCGTAGACTGCGTACC-3
5-AATTGGTACGCAGTC-3
E-A:5-GACTGCGTACCAATTCA-3
E-ACG:5-GACTGCGTACCAATTCACG-3
E-AAC:5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3
E-ACT:5-GACTGCGTACCAATTCACT-3
E-AGG:5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3
E-ACA:5-GACTGCGTACCAATTCACA-3
E-AGC:5-GACTGCGTACCAATTCAGC-3
E-ACC:5-GACTGCGTACCAATTCACC-3
E-AAG:5-GACTGCGTACCAATTCAAG-3
MseⅠ
5-T↓TAA-3
3-AAT↑T-5
5-GACGATGAGTCCTGAG-3
5-TACTCAGGACTCAT-3
M-C:5-GATGAGTCCTGAGTAAC-3
M-CAG:5-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3
M-CAA:5-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3
M-CCA:5-GATGAGTCCTGAGTAACCA-3
M-CAC:5-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3
M-CTG:5-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3
M-CTC:5-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3
M-CTT:5-GATGAGTCCTGAGTAACTT-3
M-CTA:5-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3
M-CAT:5-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3
注:引物只列出单链序列
Note:Analysisthatonlysinglestrandedprimersareshown
1.3葎草基因组DNA提取
研究采用3种方法提取葎草DNA，CTAB法和
SDS法参照邹喻萍等(2001)的方法。
改良CTAB法的具体步骤如下：取适量叶片放
入研钵中，加液氮迅速磨成粉末，转入离心管中；加入
预热至65℃的CTAB抽提缓冲液，65℃温浴60min；加
入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1,V/V/V)，10000×g，
室温下离心10min；取上清液，加入等体积的氯仿:异
戊醇(24:1,V\V)，混匀，10000g，室温下离心10min；
取上清液，加2倍体积的预冷的无水乙醇，-20℃静置
1h；用细玻璃棒挑出絮状DNA沉淀，放入1.5mL离
心管，用75%的酒精漂洗两次，干燥。加入500μLl×
TE缓冲液，10000×g离心10min，将上清液转入新离
心管中，加入Rnase(10mg/mL)，37℃保温1h；取上清
液，用等体积的氯仿:异戊醇抽提；取上清液，加入2倍
体积的预冷的无水乙醇，-20℃静置1h。7000×g离心
10min，弃去上清液，沉淀用75%的乙醇漂洗3次，干
燥。TE溶解，-20℃下储存备用。
将提取的 DNA在紫外分光光度计下测定
OD260、OD280进行质量检测，每一方法重复3次。将
DNA原液稀释后，用0.5×TBE，0.8%琼脂糖凝胶，5
V/cm电泳0.5h进行电泳检测。
1.4AFLP反应体系模板DNA浓度的优化
葎草雌雄 DNA池 AFLP反应体系的建立参照
394
葎草DNA的提取及AFLP标记反应体系的建立
DNAExtractionandEstablishmentofAFLPMarkerReactionSystemofHumulusscandens
Vos等(1995)的方法，建立AFLP反应体系(表2)，将
改良CTAB法提取的雌雄两个DNA池的DNA，用
1×TE稀释并标定到50ng/μL作为模板，比较不同模
板浓度(50ng、100ng、150ng、200ng、250ng、300ng)
对AFLP反应的影响。
1.5AFLP反应体系酶切时间的优化
用限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ进行模板DNA
的酶切，将酶切时间分别设为4h，6h，8h，10h(表3)。
酶切的过程中进行接头的复性，复性的热循环条件为
65℃10min，37℃10min，25℃10min，4℃25min。酶
切完成后进行连接反应，每个酶切体系中加入20μL
的连接反应体系，25℃连接2h或室温下放置过夜。连
接完成后，将连接产物稀释10倍，进行预扩增反应。
预扩增反应条件为 94℃ 30s，56℃ 1min，72℃
1min，共20个循环。预扩增完成后，将预扩增产物用
1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，5V/cm电泳30min。
1.6AFLP反应体系选择性扩增模板浓度的优化
在选择性扩增反应程序不变的情况下先用一对
引物组合优化模板浓度，对预扩增后的产物分别稀
释10倍、30倍、50倍、70倍、90倍进行选择性扩增
(表3)。选择性扩增的反应程序采用“touch-down”策
表2葎草AFLP反应体系
Table2AFLPreactionsystemsofHumulusscandensL.
酶切体系
Systemsofrestrictionreaction
4.0μL10×TBufer
0.3μLEcoRⅠ /(10U/μL)
0.3μLMseⅠ(10U/μL)
5μLDNA(50ng/μL)
10.4μLddH2O
总体积20μL
Totalvolume20μL
连接体系
Systemsofligasereaction
4.0μLT4Bufer
1.0μLMseⅠadapter
1.0μLEcoRⅠadapter
0.1μLT4Bufer(3U/μL)
14μLddH2O
总体积20μL
Totalvolume20μL
预扩增体系
Systemsofpreamplification
5.0μL酶切连接模板
TemplateDNAofligation
2.0μLMseⅠprimer(25ng/μL)
2.0μLEcoRⅠprimer(25ng/μL)
0.6μLMgCl2(50mmol/L)
0.08μLTaqDNApolymeras(5U/μL)
1.0μLdNTPs(2mmol/L)
2.0μL10×PCRBufer
7.32μLddH2O
总体积20μL
Totalvolume20μL
选扩增体系
Systemsofselectiveamplification
5.0μL预扩增模板
TemplateDNAofpreampifiation
6.0μLMseⅠpromer(10ng/μL)
2.0μLEcoRⅠprimer(10ng/μL)
0.6μLMgCl2(50mmol/L)
0.2μLTaqDNApolymeras(5U/μL)
2.0μLdNTPs(2mmol/L)
2.0μL10×PCRBufer
2.2μLddH2O
总体积20μL
Totalvolume20μL
表3AFLP反应体系中优化的关键影响因素
Table3TheoptimalessentialfactorsintheAFLPreactionsystem
因素
Factors
模板DNA的浓度(ng/μL)
TemplateDNAConcentration
酶切反应的时间(h)
Restricationreactiontime
选择性扩增模板浓度(ng/μL)
Templateconcentrationofse-
lectiveampifiation
略。程序如下：
第1个循环 94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 1min；
第 2~13个循环，DNA退火温度每次递减 0.7℃，其
余步骤同第一个循环；第14~36个循环，退火温度为
56℃，其余步骤同第一个循环。
选择性扩增产物(AFLP产物)先在1.2%的琼脂
糖凝胶中进行电泳检查。
1.7AFLP扩增产物的凝胶电泳及银染
用70mL6%的聚丙烯酰胺，加400μL10%过硫
酸胺、40μLTEMED制胶，聚合3h以上，55W预电
泳30min，80W恒功率电泳2.5h左右。点样前在选
择性扩增产物中加入等体积甲酰胺染液 (98%甲酰
胺,10mmol/LEDTA,0.125%溴酚蓝,0.125%二甲苯
腈)，95℃变性5min。电泳后的银染程序参照Bassam
等(1991)的方法进行。
2结果与分析
2.1葎草基因组DNA提取的优化
葎草作为一种可以药用的植物其次生代谢物质
如色素、单宁等含量较高，这些物质在PCR扩增时
可以抑制TaqDNA聚合酶的活性。为了获得适应于
梯度
Concentration
gradients
50,100,150,
200,250,300
4,6,8,10
30,50,70,90,
110
最佳反应条件
Optimalsystem
50
6
50
395
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
葎草AFLP技术体系的高质量的模板DNA，采用了
三种方法进行葎草基因组DNA的提取。其中SDS
法和 CTAB法所获得的 DNAOD260/OD280偏低 (表
4)，DNA样品受蛋白质及其他杂质污染较重。采用改
良 的 CTAB法 提 取 的 葎 草 基 因 组 DNA，其
OD260/OD280比值平均值为1.73(表4)，表明蛋白质等
杂质去除较干净，DNA纯度较高，用1%琼脂糖凝胶
检测，提取的DNA无降解，点样孔干净，并且分子量
大小一致，纯度符合AFLP要求 (图1)。其次改良
CTAB法在改良过程中充分考虑提取过程的简单
化，在保证提取DNA质量的前提下，最大可能缩短
实验程序和降低实验成本。
表4不同提取方法所得DNA的检测结果
Table4ThedetectiveresultsofHumulusscandensL.leavesby
diferentisolationmethods
方法
Methods
CTAB法
MethodofCTAB
改良CTAB法
ImprovedCTAB
SDS法
MethodofSDS
重复
Replucation
1
2
3
1
2
3
1
2
3
OD260
0.049
0.065
0.055
0.057
0.045
0.052
0.063
0.071
0.066
OD280
0.031
0.042
0.038
0.032
0.026
0.031
0.041
0.045
0.045
OD260/OD280
1.577
1.545
1.447
1.774
1.743
1.677
1.537
1.578
1.467
图1改良CTAB法提取的葎草基因组DNA0.8%琼脂糖凝胶
电泳图
Figure1GenomicDNA0.8%agarosegelelectropherogramspic-
tureofHumulusscandensL.useingimprovedCTABmethod
2.2模板DNA的浓度
本研究中设置了50~300ng6个葎草DNA模板
浓度的处理，6个处理中均能得到清晰的 AFLP图
谱，表明葎草AFLP体系对50~300ng范围内的模板
DNA浓度变化并不敏感。
2.3DNA模板的酶切时间
为建立适合葎草DNA的酶切时间体系，本实验
用限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ进行模板DNA的
双酶切，分别设计了4h、6h、8h和10h的酶切时
间。结果表明，酶切时间为4h时酶切不完全；当酶切
时间延长为8h时却产生了“star”活性，降低特异性。
DNA模板酶切时间为6h的效果最佳，酶切片段在
500bp以下形成高密度区域，表明6h的酶切时间可
以完全消化模板DNA(图2)。
图2葎草基因组DNA经PstⅠ/MseⅠ双酶切6h的1.2%琼脂
糖凝胶电泳图谱
注:M:分子量标准DL2000;1~3:雌性单株;4~6:雄性单株
Figure21.2%agarosegelelectrophoregramsofEcoRI/MseIdi-
gestedgenomicDNAfor6hofHumulusscandensL.
Note:M:MolecularmarkerDL2000;1~3:Femaleplants;4~6:
Maleplants
2.4预扩增产物和选扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测
预扩增既可以检测酶切与连接的效果，又可以
直接影响选择性扩增的结果，因此是AFLP技术体
系中重要的环节之一。预扩增产物的电泳结果表明，
预扩增片段范围较大，一般在100~500bp之间，扩增
信号较强，雌雄株间相对一致(图3)。表明此前进行
的基因组DNA的提取和酶切连接操作符合要求。
选择性扩增产物(AFLP产物)在1.2%的琼脂糖
凝胶中进行电泳检查。AFLP产物长度集中于
100~500bp，与预期长度范围一致(图4)，表明扩增成
功，可用于后续的聚丙烯酰胺凝胶电泳与银染检测。
图3 葎草基因组DNA预扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳图谱
注:M:分子量标准DL2000;1~3:雌性单株,4~6:雄性单株
Figure31.5%agarosegelelectrophoregramsoftheresultsof
preamplificationofHumulusscandensL.
Note:M:MolecularmarkerDL2000;1~3:Femaleplants;4~6:
Maleplants
396
2.5AFLP选择性扩增体系中模板浓度的优化
把AFLP预扩增产物稀释不同的倍数进行选择
性扩增，结果发现，模板浓度过高(模板稀释倍数低于
图4葎草选择性扩增产物电泳图
注:M:分子量标准DL2000;1,3:雌性单株;2,4:雄性单株
Figure4Selectiveamplificationproductselectrophoregramsof
HumulusscandensL.
Note:M:MolecularmarkerDL2000;1,3:Femaleplants;2,4:
Maleplants
图5葎草的AFLP扩增6%PAGE电泳结果
注:A:预扩增模板梯度优化扩增图谱 (泳道1、3、5稀释30倍;泳道7、9、11稀释70倍;泳道2、4、6、8、10、12稀释50倍）;B:引
物组合E-ACG+M-CTA扩增图谱;C:引物组合E-AAC+M-CAC扩增图谱;箭头所示为雌雄连锁标记
Figure5AFLP6%denaturingpolyacrylamidesequencinggelelectrophoregramsofHumulusscandensL.
Note:A:FingerprintpaternofpreampifiationtemplateDNAconcentrationgradientsoptimization(Lanes1,3,5:dilute30times;Lanes
7,9,11:dilute70times;Lanes2,4,6,8,10,12:dilute50times);B:AmpifiationfingerprintpaternofprimerpairE-ACG+M-CTA;C:
AmpifiationfingerprintpaternofprimerpairE-AAC+M-CAC;Arowindicatelinkagemarkerofmaleorfemaleplants
30)，DNA条带多集中在泳道上部；而模板浓度过低
(模板稀释倍数高于70)未能很好的扩增出条带，影
响结果的分析。本试验中预扩增产物稀释50倍为最
佳模板浓度(图5A)。银染检测，每个样品平均产生
40条左右条带，条带大小多在100~500bp之间，与
琼脂糖电泳检测结果一致。
2.6性别连锁的AFLP标记的获得
本研究利用建立的技术体系进行了 27对引物
组合的筛选，发现2对引物组合E-ACG+M-CTA和
E-AAC+M-CAC条带清晰，多态性和稳定性好，每对
引物组合扩增的条带为30条左右。获得3条雄性连
锁和2条雌性连锁的AFLP标记(图5B,5C)。
3讨论
AFLP是一种结合了RFLP和PCR的优点的新
的DNA分子标记技术，具有高效、快速、稳定、可靠
A B C
葎草DNA的提取及AFLP标记反应体系的建立
DNAExtractionandEstablishmentofAFLPMarkerReactionSystemofHumulusscandens
397
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
等特点(Smithetal.,1994)，但是AFLP技术实验技术
过程繁琐，所用药品和仪器多，具有明显的实验材料
特异性。因此，本文针对葎草的AFLP技术中的几个
关键环节进行优化处理，获得了对其进行AFLP分
子标记分析的优化程序。
3.1模板DNA对葎草AFLP扩增的影响
模板DNA对AFLP扩增的影响主要表现在模
板DNA的质量及使用浓度两个方面。而高质量的
DNA具有明显的实验材料的特异性，葎草组织富含
多糖、鞣质等粘液状及树脂状杂质。这些物质极易褐
化且与DNA结合不易分离，影响限制性内切酶与模
板DNA的结合以及DNA聚合酶的活性。PVP有很
强的结合多酚的能力，结合后可防止酚类氧化成醌
类，避免溶液变褐而具有抗氧化作用，也可防止
DNA酶降解DNA；酚类物质广泛分布于植物体内重
要的次生物质之一，是芳族环上的氢原子被羟基或
功能衍生物取代后生成的化合物。在DNA提取中酚
类物质经氧化后易与DNA共价结合引起褐变从而
干扰内切酶及聚合酶的活性。因此通过加入抗氧化
剂如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、谷胱苷肽、维生素C
等可以起到防止酚类干扰的作用。
3.2AFLP技术对葎草性别连锁标记分离的有效性
通过分子标记技术比较雌雄基因组差异可以获
得雌雄单性性别形成的有效信息，其中AFLP标记由
于多态性稳定性好也广泛用于雌雄异株植物的性别
相关的研究。在芦笋中获得的3个AFLP标记可以可
靠的进行雌雄株性别的鉴定 (Reamon-Bütnerand
Jung,2000)。在大麻中通过AFLP发现了性染色体上
的假常染色体区(pseudoautosomalregion,PAR)(Peil
etal.,2003)。一些雌雄异株的AFLP性别连锁的标记
被证明是一些串联重复的非编码DNA片段(Stehlik
andBlatner,2004)。显然，这些研究结果说明AFLP可
以用来进行雌雄异株植物性别差异机制的研究。本文
利用AFLP获得了葎草性别连锁的标记，这些标记可
以更好的揭示葎草单性性别的遗传差异。
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