全 文 ：些塑丝竺塑塑垫色业卫竺些丝吵 丛 e叱尹竺理n少. 娜坐胜
[文章编号 1 16 7 1一公抖6 (2 03 )3 0 一加39 一6 0
* 创含4 纤*
抗癌药用植物猫人参 ( A et 1n 1 d1a m a 。 r。s p erma )离体再生系统的建立
姜维梅 ’ 丁炳扬 ’ 朱学南2
气浙江大学生命科学学院 杭州3 10 12 )
2
(杭州植物园 杭州3 103 1 )
【摘 要』 中药猫人参 , 又名大籽称猴桃 ,是著名抗癌 药用植物 , 其野生资源已近枯竭 。 本文选用猫人参
的茎段 ( 至少带一个节 ) 、 叶片作为外植体 , 筛选 出了适合猫人参从启动 、 快繁直至 生根等各个 阶段的最
适培养基 , 在实验室建立 了程序简单 、 重复性好 的再生系统 , 实现 了猫人参组 培苗 的快速 繁殖 。 以 茎段
作为外植体效果较好 , 既容易消毒 , 同时又能很快诱 导腋芽萌发 ; 以叶片作为外植体 , 能成功诱导 出愈
伤组 织 ,但此愈伤组 织的分化能力极低 。 以茎段作为外植体获得的无 菌培养物在不同发育 阶段适宜 的
培养基组成 : 外植体启动培养基为 MS + BA S 协m ol / L十NAA I 林m ol / L ; 最适增殖培养墓为 MS+ BA
2 卜m o l / L+ GA 1 . 5 林m o l / L+ Z T 4 林m o l / L , 3 5 d 繁殖系数为 9一 1 0 ; 最适生根培养墓为 1 / 2
MS+ 工BA Z 卜m 01 / L , 生根率达 1 0 0% , 培养 3 5 d, 平均苗高 6 . 2 8 c m ,平均移栽成活率为 9 1%。
【关健词』 大籽称猴桃 ; 组织培养 ; 植株再生系统 ; 快速繁殖
猫人参是浙江省 的地方传统用药 ,其实
际来源为称猴桃科植物大籽称猴桃扭。 it in id a
~
m甲 e
~
C
.
F
.
iL an 助的根 。 主产于浙江
富阳 、 临安 、杭州 、 江山等地 ,在湖北 、 江西和
安徽等省也有分布川 。 其根皮呈红棕色 , 俗称
“ 红货 ” , 具有解毒消肿 、 祛风除湿的功效 。 临
床上用于治疗深部脓肿 , 骨髓炎 ,风湿痹痛 ,
疮疡肿毒 ,肝硬化黄疽腹水等 , 民间常用于治
疗各类消化道肿瘤 l2[ 。
随着猫人参临床应用的 日益增多 , 其生
药材用量也相应增加 , 仅浙江省的年使用量
即可达 10 吨 , 其中半数 以上用于肿瘤治疗 ,
成为继藤梨 (中华称猴桃 )根之后的又一个来
自称猴桃科的抗癌药物 。 猫人参 目前依赖野
生 , 由于药用部位在根部 , 并且用量较大 , 由
此导致滥采滥挖现象严重 , 正宗 “ 红货 ” 几乎
告罄 13 。
为了满足临床大量用药的需要 , 我们对
猫人参进行 了离体快繁的研究 , 以期能迅速
扩大种苗和种植面积 , 以改变现在药源紧缺
的局面 。 这对保障临床用药 、 开发利用我省
特有的药源 、 促进效益农业的发展 , 有着十分
重要的科学意义和实用价值 。
, 材料与方法
1
.
1 材料
材料取 自杭州植物园 , 经浙江大学郑朝
宗教授鉴定确定为大籽称猴桃植株 。 外植体
为茎段和叶片 , 茎段取自当年生半木质化的
枝条 。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 无菌材料的获取 枝条取 回后 ,用流水
冲洗干净 , 切成带芽的茎段和把叶片切成 1 . 5
x 1
.
5 c m 的切块 , 置于三角瓶中 , 70 %酒精处
理 3s0 e C ,再无菌水冲洗后用 0 . 1%升汞表面
消毒 12 而 n , 无菌水冲洗 4 一 5 次后 , 无菌条件
收稿 日期 : 2 0 3 年 9 月 2 日
作者简介 :姜维梅 l( 97 0一 )女 , 山东人 ,硕士 ,讲师 , 主要从事植物形态解剖与植物组织培养方面的研究 。
中国医学生物技术应用杂志 T heC hi ne se Ae a dei meM e di e alM a邵 z i ne O O f r s ani sm s
下分别接种于起始培养基中 。
. 2 1
.
2培养基及培养条件 ( ) l起始培养基 :采
用 M S为基本培养基 , 附加成分为 BA S林m ol /
L
,
N A IA 林m ol/ L
,
Z6T 林m ol/ L
, 蔗糖浓度 3% ,
p H S
.
8
, 琼脂 .0 邸% ,在 1 个大气压下灭菌
20订一i , i 。
(2) 增殖 与分化培养基 : 为了观察植物激
素对腋芽增殖生长的影 响以及外源激素对叶
片外植体愈伤组分化和不定芽形成的影响 ,
我们设计 了二组共 6 种培养基 , 以 M S作为
基本 培养基 , 附加 不同浓度 B A 、 IA A 、 NA A 、
GA
3等 。
(3) 生根培 养基 : 以 M S 为基本 培养基 , 附
加不同浓度的 BI A 、 N A A 及 I A A 。
(4 )培养条件 :培养室温度 25 月℃ , 每天
光照 16 h ,光强 2 00 一 3 0 00 l x 。
1
.
.2 3 数据统计 所有实验均重复 3 次 ,实验
结果基本一致 ,表中所列数字为三次实验的
平均值 。 茎段腋芽萌发率在培养后 1d5 统
计 ,其余的培养物均在培养后 3 5d 统计 。
2 结 果与分析
2
.
1 外植体 的选择
以茎段作为外植体 ,在 3 种培养基上均
能诱导腋芽萌发 , 其中以 l 号培养基的培养
效果最好 ,单独添加 BA 或 Z T 腋芽也能萌
发 , 但最早萌发时间和萌发率均不及 B A 与
N A A 联用 (见表 1) 。
表 1
T a b l e l
不 同激素对茎段外植体腋芽的启动与 萌发的影响
H o mr
o n e s e
fe
e t o n ax i l l
: ,叮 b u d i n i t ia t i o n a n d s p or u t i n g
起始培养基 (林 , , 10 1/ L ) 接种茎段数 最早萌发时间 ( d) 萌发率 (% )
20
1
.
M S+ B A S+ N A A I
2
.
M S+ B A二亏
3
.
M S+ Z T ( ,
以叶片切块作为外植体 ,在 3 种培养基
仁均能诱导愈伤组织 ,一般在接种 巧 天后 ,
叶片四周开始 出现淡绿色的愈伤组织 , 并逐
渐 向四周扩散 , 约需 4 周左右叶片才能完全
愈伤组织化 (见表 2)
T a b le Z
表 2 叶片外植体愈伤组织的诱导
C a l l u s i r一d u e ti o n for m
rh e le
a f e x P l a n r o f A e t in i di a m ac or
￡p e砚 a
起始培养基 (脚on l/ )L 接种叶片数 目 愈伤组织诱导率 (% )
1
.
M S+ B A S 十N A A I
2
.
M S+ BA S
3
.
M S+ ZT ( )
5 1
.
34 3
,
7 6 7
.
8
愈伤组织生长状况
绿 较硬 量多
淡绿色 较硬 量少
绿色 较硬 量多
20
茎段基部在上述 3 种 培养 基中也会形成
愈伤组织 , 培养 2 周后基部完全愈伤组织化 ,
而叶片要 4 周才能完全愈伤组织化 。 这一 现
象与张远记 I’l 以组培苗叶片 、茎段作为外植体
的培养结果相似 。
2
.
2 植物激素对一腋芽增殖 生长 的影响
将起始培养基上得到的无菌腋芽切下转
人新鲜的 M S 培养基附加 不同浓度 的植物激
素的增殖培养基上 , 以观察腋芽增殖情况 。 结
果见表 3
由表 3 可以看出 : 腋芽茎段增殖 以 5 号
培养 基 的繁殖 系数最 高 , 达到 1 , 6 倍 , 植株
中国医学生物技术应用杂志 T h eCh in es eAa e d emi eM e di a el
表 3植物激素的配合使用对芽增殖生长 的影响
T a b l eI 3 n l fu n e e eo fh om rn o
s ew i th di e fr e
n t en o e en t l’ a li on on
p r o li e fa r ti on g r ow th o fbu ds
培养基组成 (林 m o l /) L 接种芽数 增殖芽数 增殖倍数 平均苗高 (。 m
2 8 59 46 3
内J9 7哎以6 42 31 9 6 0巧2 0
4
.
M S+ B A Z+ IO AA
.
6
5
.
M S+ B A Z+ 3 G A+ ZT 4
6
.
M S+ B A Z+ G AI
.
5+ T Z4
7
.改良 M S (?N) + 6 B A+ N A AI
4
.
2 7 x
1 l
.
6 0
x
9
.
8 0 x
6
.
6 7 x
平均高度达到9 .2 8 cm ;但叶片颜色黄绿 , 可
能是 由于培养基中赤霉素浓度过高 , 导致植
株生长过快 。 6 号培养基中植株生长健壮 , 叶
片颜色深绿 。 4 号培养基 中 , 植株生长矮壮 ,
但增殖系数较低 。 7 号培养基中生长的植株 ,
茎段基部有较大的愈伤组织 , 植株颜色淡绿 。
综合茎段 在上述 4 种培养基中的生 长表 现 ,
以 6 号培养基最为适合 , 既能达到高的繁殖
系数 , 同时又能保证植株生长健壮 。
2
.
3 叶片愈伤组 织分化
将在起始培养基上产生的叶片切块愈伤
组织移人分化培养基 中 , 2 周后仅在 少数愈
伤组织上可见有少量芽点分化 , 最终在能分
化的愈伤组织上仅诱导出 1一 3 棵苗 (表 4) , 这
表明叶愈伤组织分化能力低下 。
表 4 叶片愈伤组织在不同培养基上分化芽的能力
aT b le4 Sha
o t er g e n e ar t i n g ab i l i yt of l e af e al hi s on di fe er nt me d i
a
培养基组成 (林m o l / L ) 接种愈伤组织块数 愈伤组织的芽分化率 (% )
7
.改 良 M S ( ? N )+ B A 6+ N AA I
8
.
M S + B A S十ZT’4 + N A A
9
.
M S十ZT 10
l 5
l 8
l 5
O
1 1
.
1
6
.
7
因此 , 猫人参组培快繁的外植体最好选
择茎段 , 叶子虽然能诱导 出愈伤组织 , 但愈伤
组织不定芽的分化率极低 , 其原 因还有待进
一步探讨 。 而且还由于通过愈伤组织 阶段产
生的不定芽容易发生遗传变异 , 因此 , 为 了获
得大量与亲本遗传性状一致的个体 , 生产上
应 以带一个节的茎段繁殖为主 。
2
.
4 生根及移栽
当试管 内小苗高达 cI m 一 2 c m 时 , 将其
转人生根培养基中 , 培养 30 d 后 即可形成有
根的完整植株 。 为 了筛选合适的生根培养基 ,
我们以 M S 为基本培养基 , 探讨了不同生长
素及其组合对试管苗生根的影响 (表 5 ) 。
表 5 不 同培养基及其生长素组合对试管苗生根的影响
T a b l e 5 Ifln
u e n e e o f d ife er
n t m e d i a a n d p la n t gr o w t h er 即 Iat o sr on tu b e 一 p lan t or ot i n g
培养基组成 (林m o l / L ) 接种芽苗数 生根的植株数 生根率 (% ) 植株生长高度 (。 m )
10
.改良 M S (? N 、 F e )+ N A AO . 5 30 2 8 9 3 . 3 4 . 84
1 l
.
M S + IB A Z+ I AA 6 30 2 6 8 6
.
7 3
.
3 6
1 2
.
? M S+ I B AZ 4 0 4 0 1o 6
.
2 8
4 2
上述三种生 .根培养基中 , 以 or 号和 12
号效果较好 , 苗基部发根多 , 根粗 长 , 苗也长
得较高 ,植株生 长健壮 。 1 号培养基上生长
的植株较矮 , 叶片伸展较大而颜色黄绿 , 有的
仅在芽苗基部产生 3一 4 条长度 约为 I c m 的
短根 , 此种植株移栽不易成活 。
驯化与移栽 :采用常规炼苗法 。 将 已长根
的试管苗移人人工 气候室 , 自然光下 壮苗
15 一20 天后 , 打开容器皿盖 , 让小苗逐渐适应
自然条件 。 炼苗 7 d 后 , 用清水仔细洗去组培
苗根部的培养基 , 然后将苗木定植于灭过菌
的栽培基质中 (菜园土 :膨胀珍珠岩 二:2 1) 。 注
意遮荫保湿 ,尤其是在移栽后 10 天 内要做到
全天遮荫 , 晴天时注意喷水 。 约 1个月后植株
成活 , 移栽成活率可 达 91 % 。
原因很可能是内在的 。 盛夏取材时植株生长
旺盛 , 进人 10 、 1 月取材时植株 已处于生长
末期 , 细胞分裂速度减慢 , 这一供体生长发育
状况上的差异可能会和接种材料污染率上升
有关 。 当然真正的原因还有待进一步的研究 。
3 讨论
3
.
1 外植体 的灭 菌与外植体 的取材时间
为防止某些侵人材料内部的病菌影响初
代培养 ,我们将经过升汞灭 菌的外植体 , 用头
抱拉定 ( 14 . 3林m ol /)L 溶液浸泡 s m in ,无菌水冲
洗后接种于培养基中 。 结果发现 , 用此方法处
理后 , 猫人参灭 菌效果 明显 , 使污染率降低 ,
很快得到了初代L培养物 。 这样利用抗生素处
理外植体 比在培养 中加人抗生素效果要好 ,
因为有资料表明培养基中较长时间存在抗生
素对植物 的生长有抑制作用 , 能抑制根的生
长以及使细胞叶绿素含量降低等 l5] 。
我们将取 自 7 月 、 8 月 、 9 月 、 10 月 、 1 月
的一年生半木质化的枝条常规方法消毒 后 ,
接种 于起始培 养 中 , 结果发现 取 自 7 月 、 8
月 、 9 月 的枝条 与叶片接种 培养的污染率为
38 %
, 而取 自 l1C 、 1 月的枝条接种 污染率高
达 87 % , 这 与陈维伦等网的报 告一致 。 由于
10
、
n 月 的气温 已 明显低于 7 、 8 、 9 月 , 我们
的操作规程和技术也是稳定有效的 , 而 10 、
1 月取材的污染率竟会升高到 87 % , 因此其
3
.
2 猫人参快繁的继代 时间与次数
在娇猴桃 的组培快繁中经常遇到的问题
是要不断新建初代培养物 以更新试管母本 。
这是 由于随着继代次数的不断增加 , 试管苗
增殖能力下降而生根时间延长阴 。 我们在培养
过程中注意到在猫人参的组培快繁中也存在
类似问题 。 把第 5 次继代培养物得到 的茎段
切割后进行扩大繁殖 , 其增殖系数即由初代
时的 10 左右下降到 5 . 8 ,并且植株生长缓慢 。
因此猫人参快繁 的继代次数应控制在 10 代
以内 。 每次继代时间以 35 天为宜 。 造成这种
情况的原因可能是与培养体本身的生理状况
(如激素 )变化有关 ,这在木本植物的培养中经
常见到 。 我们在实验中发现 ,在相邻的两次继
代过程中采用将植物激素的浓度先降低后升
高的处理方法 , 可缓解上述情况的发生 。 这可
能是 由于长期在一种培养基中生长 , 植物体
内累积 了过高浓度的细胞分裂素和 /或改变
了对外源细胞分裂素的敏感性 , 从而引发生
长抑制现象 。
3
.
3 猫人参愈伤组 织的分化
在称猴桃组织培养中 , 有报道茎段的愈
伤组织能分化成苗 , 而叶片产生的愈伤组织
则不分化 8IJ , 也有 叶片和茎段愈伤组织均能诱
导植株再生的报告 4I] 。 在我们的研究 中 , 大籽
称猴桃 的茎段基部及叶片均容易诱导出愈伤
组织 , 但两种来源的愈伤组织的芽分化率均
极低 , 也不容易分化根 。 这除了与愈伤组织 自
身的基因型和外植体类型有关外 , 培养基的
组成和培养条件应该也是重要的可调控的影
响因素 。 因此有关猫人参愈伤组织 的分化条
中国医学生物技术应用杂志 T h eh Cin es e Ae ad em i e Med i el a Mf O O飞 n ais m s
件和规律需要进一步研究 。 还由于其药用部
分集中在根部 , 如果其愈伤组织成功地分化
的根仍能保持有效的药用成分 , 这对于发根
农杆菌转化应用于猫人参将有十分良好的前
景 , 这将为生物技术在 中药的研究开发 中开
辟一条新路 。
总之 , 有关称猴桃的组培研究的报告相
当多 , 大多是关于食用称猴桃品种改 良和种
质资源保存的研究 。 目前 , 组培已成功的赫猴
桃种类有 中华称猴桃 (A . 。 hi sn o is) 9[] 、 美味称
猴桃 (A . de il 一 c动。 al) lo] 、 毛花称猴桃体 . o ir -
翻咐人al) ,`〕、 软枣称猴桃 (A忿寥“ a) f’] 、 狗枣称猴桃
(A e ti n i而 k o lo m ik ra) “ 2J 、 葛枣赫猴桃 (A .尹。勺爹
伽 )l3] 和多花称猴桃 (A . lat 如 il衅 l4] 等 , 未见大籽
称猴桃组培的研究报告 。 我们的研究将为猫
人参的商品化开发奠定基础 。 而猫人参的大
规模种植 , 不仅可以挽救这一因滥采滥挖而
濒临灭绝的物种 , 而且可 以保证临床用药的
需要 , 这对浙江省经济的发展也将起到显著
的推动作用 。
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