全 文 ：收稿日期:2015-12-03
项目基金:广东地方习用中药饮片质量标准研究(20134815026)
作者简介:杨丽莹(1991-)，女，在读硕士研究生，专业方向:中药资源与质量研究;E-mail:lyiyoung@ 126. com。
* 通讯作者:李书渊，Tel:13660399909，E-mail:1018720684@ qq. com。
落葵薯 DNA条形码筛选及其近缘植物的分子鉴定
杨丽莹1，苏荣坤2，蔡宇忆1，叶永浩1，李书渊1*
(1. 广东药科大学，广东 广州 510006;2. 香港大学，香港)
摘要 目的:利用 DNA条形码鉴定落葵薯及其近缘植物。方法:对来自不同产地的 28 份落葵薯及其近缘植
物的核基因 ITS序列和 ITS2 序列、叶绿体基因 matK 序列、psbA-trnH 序列和 rbcL 序列进行 PCＲ 扩增并测序，比较
不同序列的 PCＲ成功率及测序成功率，对各序列进行种内和种间变异分析，Barcoding gap 检验，以及构建 NJ 树聚
类分析，评估不同序列对落葵薯及其近缘植物的鉴别能力。结果:经 PCＲ扩增、测序后发现落葵 psbA-trnH 序列出
现碱基缺失事件，其他序列均扩增、测序成功;matK序列和 rbcL序列的测序成功率均为 100%，ITS 序列和 ITS2 序
列的测序成功率分别为 78. 75%和 64. 28%;4 条序列中，ITS序列和 matK序列的种内和种间距离分别在 barcoding
gap检验中明显分离;从 NJ树来看，ITS序列、matK 序列均可区分落葵薯及其近缘植物。结论:建议采用 ITS 序列
及 matK序列作为落葵薯及其近缘植物鉴定的 DNA条形码。
关键词 落葵薯;DNA条形码;ITS;ITS2;matK;rbcL;pbsA-trnH
中图分类号:Ｒ282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2016)06-1236-05
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2016. 06. 09
DNA Barcode Screening and Identifying for Anredera cordifolia and Its Ｒelated Species
YANG Li-ying1，SU Ｒong-kun2，CAI Yu-yi1，YE Yong-hao1，LI Shu-yuan1
(1. Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China;2. Hong Kong University，Hong Kong，China)
Abstract Objective:To identify Anredera cordifolia and its closely related species using the DNA barcode. Methods:28 individu-
als of Anredera cordifolia and its close related species were collected from different habitats. ITS and ITS2 of ribosomal DNA，matK，rbcL
and psbA-trnH of chloroplast DNA were amplified and sequenced. The amplification and sequencing success rate，barcoding gap，and NJ
trees were used to evaluate the efficiency of species identification. Ｒesults:After amplified and sequenced，base deletion was occurred in
psbA-trnH sequences of Basella alba. The sequencing success rates of matK，rbcL，ITS and ITS2 were 100%，100%，78. 75% and
64. 28%，respectively. Among the four DNA barcoding sequences，ITS and matK had remarkable barcoding gap. The NJ tree showed that
Anredera cordifolia could differed obviously from its closely related species by ITS and matK. Conclusion:The sequences of ITS and
matK provide an effective and fast tool for the identification and authentication of medicinal plant of Anredera cordifolia and its related
species.
Key words Anredera cordifolia (Tenore)Steenis;DNA barcode;ITS;ITS2;matK;rbcL;psbA-trnH
落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 为落
葵科落葵薯属多年生缠绕藤本植物，载于《云南思
茅中草药选》，以珠芽入药，名藤三七，具有补肾强
腰、散瘀消肿的功效，主治腰膝痹痛、病后体弱、跌打
损伤、骨折。研究表明，落葵薯含有多糖、黄酮、皂
苷、维生素〔1，2〕等成分。另有药理研究表明，藤三七
具有抗氧化和抗 HIV活性〔3，4〕。
落葵薯原产于南美洲热带地区，20 世纪 70 年
代引入中国，目前在我国广东、福建、江苏、浙江等地
均有栽培，药材资源丰富。《中国植物志》落葵科共
有 2 属 3 种，分别为落葵属的落葵 Basella alba L. ，
落葵薯属的落葵薯及短序落葵薯 Anredera scandens
(L. )Moq. 。2007 年，皱果薯属的美洲落葵 Ullucus
tuberosus Caldas在云南部分地区引种成功〔5〕，但暂
未收录入《中国植物志》。随着近年来关于落葵薯
的研究、产品开发逐渐增多，快速、准确鉴定落葵薯
有着重要意义。落葵科植物在营养期外形相似，建
立 DNA条形码能快速、准确地鉴别落葵薯及其近缘
植物，有助于落葵薯的基础研究及开发利用，指导正
确用药。此外，落葵薯在南昆士兰、克罗地亚等多个
暖温带地区形成生物入侵〔6〕，建立 DNA条形码可助
相关部门开展防止和控制工作。
本实验以核基因 ITS、ITS2，以及叶绿体基因
matK、psbA-trnH、rbcL 作为 DNA 条形码的候选序
列，对落葵薯及其近缘植物的鉴别能力进行比较分
析，考察不同 DNA条形码候选序列对落葵科植物的
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鉴别能力，建立一种落葵科药材的高效鉴别方法。
1 仪器与材料
1. 1 试剂与仪器 植物 DNA 提取试剂盒、2 × Taq
PCＲ Master Mix(广州东盛生物科技有限公司);
Tris-饱和酚(合肥志宏生物技术有限公司);引物由
华大基因广州分公司合成;PCＲ仪(美国 Bio-Ｒad 公
司);低温高速离心机(德国 Sigma-Aldrich 公司);
HHS型电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司)。
1. 2 样品 18 批落葵薯样品为采集，8 批落葵样
品为采集或购买，经笔者李书渊教授鉴定，分别为落
葵科植物落葵薯 Anredera cordifolia(Tenore)Steenis
和落葵 Basella alba L. 的叶片，经硅胶干燥后保存
备用。2 批短序落葵薯经河北大学生命科学院赵金
莉教授鉴定，为落葵科植物短序落葵薯 Anredera
scandens (L. )Moq. 的茎叶，经粉碎处理。样品来源
信息见表 1。
表 1 落葵薯及其近缘植物来源信息表
序号 基原植物 拉丁学名及编号 采集或购买地 采集日期
1 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 1 云南昆明 2014. 10. 10
2 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 2 广东广州 2014. 09. 22
3 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 3 香港 2014. 10. 09
4 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 4 广东深圳 2014. 06. 09
5 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 5 福建厦门 2014. 05. 20
6 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 6 广东广州 2014. 09. 21
7 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 7 广东广州 2014. 06. 10
8 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 8 广东深圳 2014. 11. 03
9 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 9 广东江门 2014. 11. 03
10 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 10 广东广州 2014. 11. 24
11 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 11 广东广州 2014. 11. 25
12 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 12 广东云浮 2014. 12. 31
13 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 13 日本岐阜 2015. 01. 06
14 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 14 广东肇庆 2015. 03. 16
15 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 15 广东广州 2015. 03. 28
16 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 16 广东珠海 2015. 04. 12
17 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 17 广东珠海 2015. 04. 13
18 落葵薯 Anredera cordifolia (Tenore)Steenis 18 广东开平 2015. 04. 18
19 落葵 Basella alba L. 1 广东广州 2014. 10. 11
20 落葵 Basella alba L. 2 广东广州 2014. 10. 12
21 落葵 Basella alba L. 3 广东广州 2014. 10. 14
22 落葵 Basella alba L. 4 海南儋州 2014. 11. 15
23 落葵 Basella alba L. 5 海南儋州 2014. 11. 16
24 落葵 Basella alba L. 6 海南儋州 2014. 11. 16
25 落葵 Basella alba L. 7 广东从化 2014. 11. 29
26 落葵 Basella alba L. 8 广东佛山 2014. 04. 30
27 短序落葵薯 Anredera scandens (L. )Moq. 1 河北保定 2015. 07. 10
28 短序落葵薯 Anredera scandens (L. )Moq. 2 河北保定 2015. 04. 11
2 方法
2. 1 DNA提取 植物叶片用 75%乙醇擦洗表面
后，置于 － 86 ℃的冰箱中冷冻 25 min，取出，迅速研
磨，取样约 10 mg，使用试剂盒法(东盛植物基因组
提取试剂盒)提取总 DNA。
2. 2 PCＲ扩增及测序 聚合酶链式反应(PCＲ)在
PCＲ仪上进行。反应体积为 25 μL，内含 2 × Taq
PCＲ Master Mix 12. 5 μL、5 μmol /L 引物各 2 μL、模
板 DNA约 20 ～ 100 ng，并用超纯水补足体积。各引
物序列及反应条件见表 2〔7〕。
2. 3 序列系统分析方法 测序后所得峰图使用
CodonCode Aligner V5. 1. 5(CodonCode Co. ，USA)进
行校对，切除序列两侧低质量区。利用软件 MEGA
6. 0(Molecular evolutionary genetics analysis)完成多
序列比对、变异位点信息分析、K-2P 遗传距离计算
等分析，用邻接法(NJ)构建系统发育树。
3 结果与分析
对来源不同的 18 份落葵薯、2 份短序落葵薯及
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表 2 所用引物序列及相关 PCＲ反应条件
名称 方向 扩增引物 反应条件
ITS ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTTAACAAGG
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
ITS2 ITS2F ATGCGATACTTGGTGTGAAT
ITS3Ｒ GACGCTTCTCCAGACTACAAT
matK 3F-KIM GCTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG
1Ｒ-KIM TCCTCCGCTTATTGATATGC
psbA-trnH fwd GTTATGCATGAACGTAATGCTC
rev CGCGCATGGTGGATTCACAATCC
rbcL rbcLa-F ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
rbcLa-Ｒ GTAAAATCAAGTCCACCＲCG
95 ℃，3 min。95 ℃，30 s;56 ℃，50 s;72 ℃，90 s;38 个
循环。72 ℃，10 min
94 ℃，5 min。94 ℃，30 s;56 ℃，30 s;72 ℃，45 s;40 个
循环。72 ℃，10 min
95 ℃，4 min。95 ℃，30 s;55 ℃，60 s;72 ℃，80 s;38 个
循环。72 ℃，10 min
95 ℃，4 min。94 ℃，30 s;55 ℃，60 s;72 ℃，60 s;38 个
循环。72 ℃，10 min
95 ℃，4 min。94 ℃，30 s;55 ℃，60 s;72 ℃，60 s;35 个
循环。72 ℃，10 min
8 份落葵样品的核基因 ITS、ITS2 序列和叶绿体基因
matK、psbA-trnH、rbcL 序列进行序列比对，将其在
NCBI上进行 BLAST 相似性检索，均有较好的匹配
程度，确认所测序列为目标序列，检索比对结果表明
测序结果准确可靠。
3. 1 序列及变异 经序列扩增，琼脂糖凝胶电泳
后，落葵 psbA-trnH 序列的长度在凝胶上显示约为
250 bp，落葵薯和短序落葵薯的序列长度显示约为
500 bp。经测序发现，落葵 psbA-trnH序列分别在第
119 ～ 124 bp、145 ～ 199 bp、212 ～ 444 bp处出现碱基
缺失，这是造成凝胶电泳结果显示序列长度不一致
的原因。且 psbA-trnH序列测序结果出现重复及杂
合等问题，因此认为落葵薯及其近缘植物不宜用
psbA-trnH序列进行鉴定。
去除序列低质量区域后，采用 Mega 6. 0 软件分
析落葵薯及其近缘植物各序列的测序成功率、变异
位点、信息位点，结果见表 3。其中 matK序列最长，
ITS2 序列最短;ITS2 的测序成功率最低，为
64. 28%，落葵的 ITS2 测序结果出现杂合，测序质量
低，matK序列和 rbcL序列测序成功率为 100%;rbcL
序列的变异位点及信息位点所占比例较少，其信息
位点仅有 4 个，占 0. 77%，说明落葵薯及其近缘植
物的 rbcL序列相对保守，该序列对落葵薯及其近缘
植物的鉴别能力有限。
表 3 序列碱基组成及变异率
序列名称 全长 /bp 测序成功率 /% 变异位点 信息位点
ITS 509 78. 75 21. 22 15. 32
ITS2 431 64. 28 40. 60 28. 07
matK 730 100 5. 75 5. 48
rbcL 522 100 0. 77 0. 77
3. 2 不同 DNA条形码候选序列 barcoding gap检验
理想的 DNA条形码序列，种间遗传变异应明显大
于种内变异，并在两者之间形成一个明显的间隔区，
即 Barcoding gap。落葵薯及其近缘植物 4 个序列的
种内、种间变异分布见图 1。ITS序列的种内遗传距
离范围是 0. 0000 ～ 0. 0800，种间遗传距离范围是
0. 0801 ～ 0. 2000，matK序列的种内遗传距离范围是
0. 0000 ～ 0. 0100，种间遗传距离范围是 0. 0301 ～
0. 0500，上述两序列的种内遗传距离范围与种间遗
传距离范围分离，存在明显 Barcoding gap，且种间遗
传距离明显大于种内遗传距离，适用于鉴定落葵薯
及其近缘植物;ITS2 序列的种内遗传距离范围是
0. 0000 ～ 0. 2500，种间遗传距离是 0. 0501 ～ 0. 4500，
rbcL序列的种内遗传距离范围是 0. 0000 ～ 0. 0100，
种间遗传距离是 0. 0000 ～ 0. 0100，两序列的种内遗
传距离范围与种间遗传距离范围重叠，无 barcoding
gap，不适用于鉴定落葵薯及其近缘植物。
3. 3 落葵薯及其近缘植物鉴定分析 采用邻接法
(Neighbour-Joining)对落葵薯及其近缘植物进行鉴
定研究，分别基于 ITS序列和 matK序列构建 NJ树，
见图 2、3。结果表明，ITS 序列及 matK 序列均可区
分落葵薯及其近缘植物。由图 2、3 可见，落葵薯与
短序落葵薯各自聚为一支，两分支聚合后再与落葵
分支汇合，与传统植物分类结果吻合。该结果表明
表明，ITS序列及 matK序列均可准确地将落葵薯与
其近缘植物区分。
4 讨论
4. 1 各候选序列对落葵薯及其近缘植物的鉴别能
力 psbA-trnH序列是进化速率最快的叶绿体基因
间隔区之一，片段两端有保守的序列可设计通用引
物，但目前使用 psbA-trnH 序列最大的困难是非同
属物种间的对比，该区域存在着频繁的插入或缺失
事件，这使得扩增产物存在较大的长度差异〔8〕。落
葵的 psbA-trnH 序列就存在着大量的碱基缺失，因
此，该序列不宜用于落葵薯及其近缘植物的鉴定。
ITS序列为核基因的一段，除哺乳类动物成熟
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图 1 落葵薯及其近缘植物 4 个序列的种内和种间变异分布图
A. ITS序列 B. ITS2 序列 C. matK序列 D. rbcL序列
图 2 基于 ITS序列构建的落葵薯及其近缘植物
的 NJ树(bootstrap 1000 次重复)
的红细胞外，细胞中均有该片段，因此，植物保存不
当或提取前未对样品进行清洁均可能带入污染，经
PCＲ后得到含杂质的样品序列，测序时会出现杂合
或结合问题。ITS序列的测序成功率相对较低，但
图 3 基于 matK序列构建的落葵薯及其近缘植物
的 NJ树(bootstrap 1000 次重复)
ITS序列具有非常保守的通用引物序列，序列间存
在着丰富的变异。落葵薯属的落葵薯与短序落葵薯
分别聚为一支，聚合后再与落葵聚为一支，该分析结
果与植物传统分类结果吻合。因此 ITS 序列适合作
为落葵薯及其近缘植物的 DNA条形码。
ITS2 是目前植物及中药 DNA 条形码鉴定最常
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用的序列，具有片段短，引物高度保守等优点，但在
落葵薯及其近缘植物鉴别中，ITS2 的种内遗传距离
与种间遗传距离出现重叠，没法准确鉴别，且 ITS2
测序结果并不理想，容易出现杂合，测序成功率低。
matK 序列进化速率较快，引物的通用性是
matK序列作为 DNA条形码的限制因素。本实验用
3F-KIM、1Ｒ-KIM作为引物，扩增得到落葵薯及其近
缘植物的 matK 序列，测序成功率高，有适当的变异
位点和信息位点，能提供丰富的鉴别信息，通过遗传
距离构建 NJ树，结果与传统植物分类一致，matK序
列能准确区分落葵薯及其近缘植物。
rbcL序列是叶绿体基因，不容易受菌类污染，测
序成功率高，但在本研究中其变异位点和信息位点
少，种内遗传距离与种间遗传距离出现重叠，没出现
barcoding gap。不适合用于落葵薯及其近缘植物的
鉴定。
本实验评价 5 条 DNA 条形码序列区分落葵薯
及其近缘植物的能力。综上所述，建议以 ITS 序列
为主，以 matK 序列为辅，二者共同用于鉴定落葵薯
及其近缘植物。
4. 2 实验方法讨论及展望 DNA 条形码技术不受
物种发育阶段(叶片、种子、花、果实)和药材形态
(原药材或粉末)的限制，具有较强的通用性。本实
验运用落葵薯及其近缘植物的原植物及粉末初步建
立了 DNA条形码鉴别体系，但由于药材粉末无法用
75%乙醇消毒，容易出现序列杂合，使测序成功率降
低。今后的实验可偏向解决药材粉末 DNA 序列测
序成功率偏低的问题。DNA 条形码是区分中药来
源，鉴别中药真伪的新方法，作为传统中药鉴定的补
充和拓展，建立中药 DNA 条形码对快速、准确鉴别
中药有应用意义。
参 考 文 献
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