全 文 ：四 川 大 学 学 报 （医 学 版 ）
Ｊ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖ（Ｍｅｄ　Ｓｃｉ　Ｅｄｉ）
　２０１６；４７（１）：１４ －１８　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
葎草花粉主要变应原Ｈｕｍ　ｓ１的表达、纯化与结构预测＊
刘　昀，孙秀珍，徐　晶，吴媛媛
西安交通大学第二附属医院 呼吸科 （西安７１０００４）
　　【摘要】　目的　克隆、表达、纯化葎草花粉主要变应原 Ｈｕｍ　ｓ１，预测、分析其蛋白结构及功能，为评估该重组
变应原的诊断及治疗效果奠定基础。方法　采用ＰＣＲ扩增目的基因 Ｈｕｍ　ｓ１，并将 Ｈｕｍ　ｓ１通过ＫｐｎⅠ／ＸｈｏⅠ
位点克隆到ｐＥＴ３２ａ表达载体，转化到克隆菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α，用ＰＣＲ验证重组载体，并将表达载体转化至表达菌
株Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ－２１，ＩＰＴＧ诱导表达目标基因，利用快速蛋白液相色谱技术纯化融合蛋白，并对表达蛋白的结构与功
能进行预测分析。结果　成功构建原核表达质粒ｐＥＴ３２ａ－Ｇ２，并表达纯化葎草花粉主要变应原 Ｈｕｍ　ｓ１，纯度达
９０％以上。分析其结构含有３个潜在的抗原表位，２个ＥＦ－手型结构域，成功构建其三维模型。ＥＬＥＳＡ试验证明
重组蛋白能与葎草花粉过敏患者血清结合，具有免疫学活性。结论　成功构建了葎草花粉变应原 Ｈｕｍ　ｓ１的原核
表达载体，表达并纯化了重组蛋白，并通过生物信息学方法获得了目的蛋白的抗原表位和三维结构模型，为进一步
开展重组疫苗研究奠定了基础。
【关键词】　葎草花粉　重组变应原　基因克隆
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍ　ｓ１，ａ　Ｍａｊｏｒ　Ａｌｅｒｇｅｎ　ｏｆ　Ｈｕｍｕｌｕｓ　Ｓｃａｎｄｅｎｓ　ＬＩＵ　Ｙｕｎ，
ＳＵＮ　Ｘｉｕ－ｚｈｅｎ，ＸＵ　Ｊｉｎｇ，ＷＵ　Ｙｕａｎ－ｙｕａｎ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ，ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｘｉ’
ａｎ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ　７１０００４，Ｃｈｉｎａ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｈｕｍ　ｓ１，ａ　ｍａｊｏｒ　ａｌｅｒｇｅｎ　ｏｆ　Ｈｕｍｕｌｕｓ　Ｓｃａｎｄｅｎｓ，ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ，ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ．
Ｉｔｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ａ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｉｎｔｏ
ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ａｎｄ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｅｆｆｉｃａｃｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｌｅｒｇｅｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅ　ｗａｓ　ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ
ａｎｄ　ｓｕｂ－ｃｌｏｎｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｐＥＴ３２ａｔｈｒｏｕｇｈ　ＫｐｎⅠ／ＸｈｏⅠ ｓｉｔｅ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗａｓ
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｉｎｔｏ　ｃｌｏｎｅ　ｓｔｒａｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α．Ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＰＣＲ　ｗａｓ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ
ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｔｒａｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ－２１．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ＩＰＴＧ，ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｆａｓｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　
Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＥＴ３２ａ－Ｇ２ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ．Ｈｕｍ　ｓ１ｗａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ．Ｔｈｅ
ｐｕｒｉｔｙ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｃｅｅｄｅｄ　９０％．Ｉｔ　ｈａｓ　ｔｈｒｅｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｅｐｉｔｏｐｅｓ　ａｎｄ　ｔｗｏ　ＥＦ－ｈａｎｄ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ｄｏｍａｉｎｓ．Ａ　ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｏ　ｈａｖｅ
ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｗｉｔｈ　ＥＬＥＳＡ　ｓｈｏｗｉｎｇ　ｇｏｏｄ　ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　ｓｅｒａ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｈｏ　ｗｅｒｅ　ａｌｅｒｇｉｃ　ｔｏ
Ｈｕｍｕｌｕｓ　Ｓｃａｎｄｅｎｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　Ｈｕｍ　ｓ１ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ，ｗｉｔｈ　ｉｔｓ　ｅｐｉｔｏｐｅ　ａｎｄ　ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｂｅｉｎｇ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｂｙ
ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．Ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ａ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖａｃｃｉｎｅｓ．
【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】　　Ｈｕｍｕｌｕｓ　Ｓｃａｎｄｅｎｓ　　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｌｅｒｇｅｎ　　Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｅ
　　支气管哮喘是呼吸系统常见病，近年来在我国
的发病率有随着环境污染的加重而逐年增高的趋
势。而目前哮喘的治疗主要依赖于激素，特异性免
疫治疗（脱敏治疗）是唯一针对哮喘病因的治疗方
法，也是患者可以脱离激素的希望，其疗效已得到肯
定［１］。现临床上用于脱敏治疗的变应原疫苗多为粗
制或纯化的变应原浸液，因其成分复杂，有引起严重
过敏反应的风险。重组变应原疫苗因其成分明确，
而且其组成成分可以精确定量并标准化，减少了不
＊ 国家自然科学基金（Ｎｏ．８１１０２２５２）资助
良反应的发生，应用其替代纯化变应原疫苗用于哮
喘患者的脱敏治疗成为目前研究的热点。国内有人
应用重组尘螨变应原疫苗用于哮喘动物模型的脱敏
治疗，取得较好疗效［２］；国外有研究者在２０１２年首
次将重组变应原疫苗用于临床试验［３］。葎草花粉是
中国大多数地区哮喘患者的主要花粉致敏原，本课
题组近３０年的吸入变应原调查结果也显示葎草花
粉是西安地区的夏秋季的主要花粉致敏原［４ －７］。本
课题组在既往调查研究的基础上已构建了葎草花粉
ｃＤＮＡ表达文库［８］，筛选并获得了多个葎草花粉主
要变应原ｃＤＮＡ克隆［９］，本研究主要目的是对筛选
DOI:10.13464/j.scuxbyxb.2016.01.004
第１期 刘　昀等：葎草花粉主要变应原 Ｈｕｍ　ｓ１的表达、纯化与结构预测
出的葎草花粉主要变应原 Ｈｕｍ　ｓ１进行表达、纯化
及结构预测，为评估该重组变应原的诊断及治疗效
果奠定基础。
１　材料及方法
１．１　材料
１．１．１　菌株和质粒　菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ－２１及Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＨ５α为本实验室保存，表达质粒ｐＥＴ３２ａ购自
Ｐｈａｍａｃｉａ公司，ｐＴｒｉｐＩＥ×２阳性噬菌粒为本实验室
筛选出的阳性克隆剪切而成的噬菌粒。
１．１．２　主要试剂　ＫｐｎⅠ、ＸｈｏⅠ购自Ｐｈａｍａｃｉａ
公司，Ｔ４ ＤＮＡ 连 接 酶、Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚 合 酶 为
Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品，Ｈｉｓ－ｔａｇ亲和层析柱及 Ｑ柱为
ＧＥ公司预装柱，ＰＣＲ引物由上海生工合成。
１．１．３　患者血清　８例葎草花粉特异性过敏患者
血清来源于西安交通大学第二附属医院变态反应室
２０１０～２０１４年收集的葎草花粉过敏患者血清库。
葎草花粉过敏的诊断标准：①葎草花粉变应原皮内
试验风团直径≥组胺对照的风团直径；②ＣＡＰ变应
原体外检测系统检测血清葎草花粉特异性ＩｇＥ
（ｓＩｇＥ）为２级及以上。
１．２　方法
１．２．１　含Ｈｕｍ　ｓ１基因表达质粒的构建　合成表
达载体亚克隆所需的引物（Ｇ２），引物序列（５′－３′）
Ｇ２－Ｆ：ｇｇＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧ
ＣＴＧＡＡＧＴＴＡＡＡＧＡＡＧ，Ｇ２－Ｒ：ｃｃｇＣＴＣＧＡＧＴＴ
ＡＴＴＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＡＴＴＧ，上下游引物分别引入
ＫｐｎⅠ／ＸｈｏⅠ酶切位点；①以阳性噬粒ｐＴｒｉｐＩＥ×
２为模板，ＰＣＲ法扩增目的基因Ｈｕｍ　ｓ１，ＰＣＲ产物
引用ＫｐｎⅠ／ＸｈｏⅠ双酶切后与同样经ＫｐｎⅠ／Ｘｈｏ
Ⅰ双酶切的ｐＥＴ３２ａ表达载体，在Ｔ４ＤＮＡ连接酶
的作用下连接。将目的基因通过ＫｐｎⅠ／ＸｈｏⅠ位
点克隆到ｐＥＴ３２ａ表达载体，并且在基因的Ｎ端加
入肠激酶酶切位点；②将构建好的ｐＥＴ３２ａ－Ｇ２质粒
转化到感受态克隆菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５α，并培养扩增，
随机挑取克隆作为模板，以ｓ１－Ｆ／Ｔ７ｔｅｒ为引物，用
ＰＣＲ验证重组载体；③选择ＰＣＲ阳性克隆送测序
检测，并培养抽提质粒。
１．２．２　融合蛋白的表达　①将５ｎｇ　ｐＥＴ３２ａ－Ｇ２质
粒转化到表达菌株Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬ－２１，并蓝白斑筛选阳
性克隆；②分别挑选３个白色克隆，用ＬＢ培养基扩
增这些克隆，每小时取少量菌液，应用分光光度计测
定细菌生长浓度（以空白ＬＢ为对照调零，波长为
６００ｎｍ），并在光密度值（ＯＤ６００）达到０．８左右时加
入ＩＰＴＧ至终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ，诱导表达３ｈ或
１６ｈ，并通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达情况，结果显示
在３ｈ和１６ｈ均有蛋白表达，且１６ｈ表达量较３ｈ
大，故选择１６ｈ诱导表达；③选择有明显目标蛋白
表达的菌株，使用ＬＢ培养基，摇瓶培养１Ｌ培养
液。３７℃培养约６ｈ，当细菌 ＯＤ６００达到０．８加入
ＩＰＴＧ至终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ，继续诱导表达１６ｈ
（过夜）；④用高速冷冻离心机离心收集培养好的菌
体。
１．２．３　目标蛋白的纯化　①将１．２．２中表达后的
菌体重新悬浮于Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）缓冲液中，应用
超声破菌。离心，１５　０００ｒ／ｍｉｎ，２０ｍｉｎ，电泳检测。
目标融合蛋白在破菌上清中。将上清转入干净的试
剂瓶，弃去沉淀。②利用快速蛋白液相色谱（ＡＫＴＡ
Ｅｘｐｌｏｒｅｒ　１００，ＧＥ）纯化融合蛋白。先利用 Ｈｉｓ－ｔａｇ
亲和层析柱初步纯化融合蛋白，上样及平衡缓冲液
为缓 冲 液 Ａ：５０ ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ，０．５ ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ，ｐＨ８．０；洗脱缓冲液为缓冲液Ｂ：５０ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，０．５ ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，０．５ ｍｏｌ／Ｌ 咪唑，
ｐＨ８．０，用５０ｍＬ缓冲液Ａ平衡柱子，然后上样，再
用０～１００％缓冲液Ｂ梯度洗脱，收集目标组分；③
利用重组肠激酶对融合蛋白进行酶切，３７℃水浴过
夜；④利用 Ｈｉｓ－ｔａｇ柱和Ｑ柱对酶切后目标蛋白进
行纯化，Ｈｉｓ－ｔａｇ柱上样及洗脱同上，收集穿透液，再
经Ｑ柱纯化，Ｑ柱上样及平衡缓冲液为缓冲液 Ａ：
５０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．０；洗脱缓冲液为缓冲
液 Ｂ：５０ ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，
ｐＨ８．０，用５０ｍＬ缓冲液Ａ平衡柱子，然后上样，再
用０～１００％缓冲液Ｂ梯度洗脱，收集目标组分。
１．２．４　目的基因编码蛋白结构的生物信息学分析
应用Ａｎｔｈｅｐｒｏｔ软件预测Ｈｕｍ　ｓ１基因编码蛋白的
亲、疏水性，二维结构及抗原性；ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ分析
蛋白结构域，应用ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ同源建模软件，
构建目标蛋白三维模型，并用ＳＷＩＳＳ－ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ
软件观察三维模型。
１．２．５　ＥＬＩＳＡ试验鉴定表达蛋白的免疫学特性　将
表达并纯化的融合蛋白分别经１∶１０、１∶１００，
１∶１　０００稀释后，包被ＥＬＩＳＡ板，并应用正常人血清
１∶１００作为阴性对照，葎草花粉过敏患者血清１∶１００
稀释后加入ＥＬＩＳＡ板孵育１ｈ，洗板后，加羊抗人
ｓＩｇＥ反应后显色，酶标仪上４５０ｎｍ测定ＯＤ值。
２　结果
２．１　融合蛋白的表达
５１
四川大学学报（医学版） 第４７卷
选择有明显目标蛋白表达的菌株，并选择１６ｈ
作为诱导时间，ＩＰＴＧ诱导融合蛋白的表达，电泳检
测表达情况，结果显示在２６×１０３ 处有融合蛋白的
表达，蛋白相对分子质量与预计值（２６．３×１０３）相
符，且存在于裂解液上清中，见图１。应用凝胶电泳
图像分析系统计算出目的蛋白约占总蛋白的３５％
以上 ，说明Ｈｕｍ　ｓ１基因在ｐＥＴ３２ａ－Ｇ２表达载体
系统中得到高效表达。
图１　目标蛋白表达结果
Ｆｉｇ　１　Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａ：Ｔｈｅ　ｌｙｓａｔｅ　ｏｆ　ｗｈｏｌｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；Ｂ：Ｔｈｅ
ｌｙｓａｔｅ　ｏｆ　ｗｈｏｌｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；Ｃ：Ｔｈｅ　ｓｅｄｉｍｅｎｔ　ｏｆ　ｗｈｏｌｅ
ｂａｃｔｅｒｉａ　ｌｙｓａｔｅ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；Ｄ：Ｔｈｅ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｏｆ　ｗｈｏｌｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ
ｌｙｓａｔｅ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；ＭＫ：Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｒｋｅｒ
２．２　目标蛋白的纯化
融合蛋白经酶切并 Ｈｉｓ－ｔａｇ柱纯化后的结果见
图２，电泳结果表明融合蛋白被酶切后呈现出２条
相对分子质量分别为１６×１０３ 及１０×１０３ 的蛋白条
带，目标蛋白存在于 Ｈｉｓ柱穿透液。图３显示了经
Ｑ柱纯化后的目标蛋白，经Ｐｉｘｅｌ　Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ软件计
算目标蛋白纯度达９０％以上。
图２　融合蛋白酶切及Ｈｉｓ柱纯化酶切后目标蛋白结果
Ｆｉｇ　２　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｄｉｇｅｓｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　Ｈｉｓ　ｃｏｌｕｍｎ
Ｉ：Ｔｈｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｅｆｏｒｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；Ｊ：Ｔｈｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ
ａｆｔｅｒ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；Ｋ：Ｔｈｅ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｉｓ　ｃｏｌｕｍｎ；Ｌ：Ｔｈｅ
ｅｌｕａｎｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｉｓ　ｃｏｌｕｍｎ　１；Ｍ：Ｔｈｅ　ｅｌｕａｎｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｉｓ　ｃｏｌｕｍｎ　２；ＭＫ：
Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｒｋｅｒ
２．３　目的基因编码蛋白结构的生物信息学分析
　　用Ａｎｔｈｅｐｒｏｔ软件对Ｈｕｍ　ｓ１基因编码蛋白进
行分析，结果见图４，显示其有３个潜在的抗原表
位，分别为１～９位、１７～２４位及３６～５６位氨基酸
（黄色突出部分），肽链的二级结构（图５）以α－螺旋
为主（７６％），片层与转角结构非常少。亲、疏水性分
布 较 均 匀，为 膜 表 面 蛋 白，无 跨 膜 结 构。
ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ分析出Ｈｕｍ　ｓ１基因编码蛋白含有２
个钙结合蛋白的ＥＦ－手型结构域。ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ
图３　目标蛋白经Ｑ柱纯化后电泳图及纯度分析
Ｆｉｇ　３　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　Ｑ　ｃｏｌｕｍｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｎ：Ｔｈｅ　ｆｕｓｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｆｔｅｒ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ；Ｏ：Ｔｈｅ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｑ　ｃｏｌｕｍｎ；１：Ｔｈｅ　ｅｌｕａｎｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｑ　ｃｏｌｕｍｎ　１；２：Ｔｈｅ
ｅｌｕａｎｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｑ　ｃｏｌｕｍｎ　２；３：Ｅｌｕａｎｔ　ｏｆ　Ｑ　ｃｏｌｕｍｎ　１；ＭＫ：Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｍａｒｋｅｒ；Ｓ：Ｅｌｕａｎｔ　ｏｆ　Ｑｃｏｌｕｍｎ　２
图４　Ｈｕｍ　ｓ１基因编码蛋白抗原性、疏水性、跨膜结构预测
Ｆｉｇ　４　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ，ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｂｙ　Ｈｕｍ　ｓ１ｇｅｎｅ
１：Ｔｈｅ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ；２：Ｔｈｅ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ；
３：Ｔｈｅ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
图５　Ｈｕｍ　ｓ１基因编码蛋白二级结构预测及比例
Ｆｉｇ　５　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ
ｅｎｃｏｄｅｄ　ｂｙ　Ｈｕｍ　ｓ１ｇｅｎｅ
Ｂｌｕｅ：Ｈｅｌｉｘ；Ｙｅｌｏｗ：Ｓｈｅｅｔ；Ｇｒｅｅｎ：Ｔｕｒｎ；Ｌｉｇｈｔ　ｂｌｕｅ：Ｃｏｉｌ
６１
第１期 刘　昀等：葎草花粉主要变应原 Ｈｕｍ　ｓ１的表达、纯化与结构预测
同源构建出三维目标蛋白模型（图６），以２ｏｐｏＢ为
模板，序列同源性５８％，Ｅ－ｖａｌｕｅ：１．８２ｅ－１５，分辨率
１．７５Ａ，说明构建的三维模型稳定，可靠。
２．４　ＥＬＩＳＡ试验鉴定表达蛋白的免疫学特性
ＥＬＩＳＡ试验显示表达的目的蛋白与８例葎草
花粉过敏患者血清ｓＩｇＥ均能特异性结合，具有良好
的免疫学活性（图７）。
图６　Ｈｕｍ　ｓ１基因编码蛋白二级结构预测
Ｆｉｇ　６　Ｐｒｅｄｉｃｉｔｏｎ　ｏｆ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｂｙ
Ｈｕｍ　ｓ１ｇｅｎｅ
图７　表达的目的蛋白与８例葎草花粉过敏患者血清特异性ＩｇＥ结
合ＥＬＩＳＡ实验
Ｆｉｇ　７　Ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＩｇＥ　ＥＬＩＳＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ
ｕｓｉｎｇ　ｓｅｒｕｍ　ｓａｍｐｌｅ　ｏｆ　ｅｉｇｈｔ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｈｏ　ｗｅｒｅ　ａｌｅｒｇｉｃ　ｔｏ
Ｈｕｍｕｌｕｓ　Ｓｃａｎｄｅｎｓ
１－８：Ｔｈｅ　ｓｅｒｕｍ　ｏｆ　ｅｉｇｈｔ　ｐａｔｉｅｎｔｓ
３　讨论
本课题组的既往研究发现葎草花粉是西安地区
主要的气传花粉致敏原［１０］，我们将葎草花粉变应原
提取液用于过敏性哮喘患者过敏原的诊断及特异性
免疫治疗，曾取得较好疗效。但因为粗制变应原提
取液成分复杂，有引起严重过敏反应的风险，国家已
严格限制粗制变应原在过敏性疾病的诊断及治疗中
的应用。因此，寻找新的、安全性更高的变应原产物
用于过敏性疾病的诊断及治疗，成为目前变态反应
研究的热点。
变应原提取液的的纯度及质量决定了过敏原诊
断的准确性及特异性免疫治疗的疗效及副作用，天
然变应原提取液成分非常复杂，除包含有主要致敏
蛋白、多种次要致敏蛋白，还包含有多种杂质，其组
分难以精确标准化及定量，其应用于过敏性疾病的
特异性免疫治疗，不仅有诱发严重过敏反应的危险，
也有诱导新的过敏产生的风险，使患者对原来不过
敏的成分反而产生过敏，从而加重过敏性哮喘的症
状，因此粗制变应原提取液的应用受到限制［１１］。而
详细了解变应原的成分及组分，解读变应原致敏组
分的基因及分子结构，制备重组变应原疫苗用于过
敏性疾病的诊断及特异性免疫治疗，为变态反应性
疾病的特异性免疫治疗提供了新的思路［１２，１３］。在
近十年来，国内外有关重组变应原的研究取得了很
大的进展，杨属、梯牧草、悬铃木属、车前属、松属、橄
榄属等多种花粉变应原的致敏蛋白成分已被确
定［１４］，多种变应原的主要致敏蛋白（如Ｂｅｔ　ｖ１，Ｂｌａｇ
２及Ａｒａ　ｈ１等）的三维结构已被成功构建，桦树花
粉的ＩｇＥ结合位点、Ｔ细胞活化位点已被明确定位，
从而重组合成低致敏性花粉变应原疫苗用于脱敏治
疗［１５，１６］。
本研究在既往研究的基础上，对从葎草花粉
ｃＤＮＡ表达文库中筛选到的一个新发现的葎草花粉
ｃＤＮＡ序列（将此基因命名为Ｈｕｍ　ｓ１）进行了表达、
纯化及结构预测分析。为获得大量高纯度的变应
原，我们采用了ｐＥＴ表达系统，结果获得占总蛋白
量３５％的目的蛋白，蛋白相对分子质量与预计值相
符，表明目标蛋白在此表达系统内高效表达，经 Ｈｉｓ
柱和Ｑ柱纯化后，蛋白纯度达到９０％以上。ＥＬＩＳＡ
试验显示表达的目的蛋白与８例葎草花粉过敏患者
血清ｓＩｇＥ均能特异性结合，具有良好的免疫学活
性。
蛋白质的氨基酸序列及其三级结构决定了蛋白
的生物学特性，近年来，随着计算机技术的发展，近
期研制的很多软件都可预测蛋白结构，而且，研究证
明预测得到的蛋白结构与试验测定的结构相符。本
研究对Ｈｕｍ　ｓ１基因编码的蛋白结构及功能进行预
测，Ａｎｔｈｅｐｒｏｔ软件预测其有３个潜在的抗原表位，
分别为１～９位、１７～２４位及３６～５６位氨基酸，肽
链的二级结构以α－螺旋为主，片层与转角结构非常
少。亲、疏水性分布较均匀，为膜表面蛋白，无跨膜
结构。ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ分析Ｈｕｍ　ｓ１基因编码蛋白含
有２个钙结合蛋白的ＥＦ－手型结构域，提示Ｈｕｍ　ｓ１
基因属于花粉钙结合蛋白家族（ｐｏｌｃａｌｃｉｎｓ）。而对
钙结合蛋白家族的研究发现，ＥＦ－手型结构域广泛
７１
四川大学学报（医学版） 第４７卷
存在于多种花粉变应原的基因结构中，如具有２个
手型结构域的Ｂｅｔ　ｖ４、Ａｌｎ　ｇ４、Ｃｙｎ　ｄ７、Ｐｈｌ　ｐ７、Ｏｌｅ
ｅ３和Ｂｒａ　ｒ１，３个手型结构域的Ｂｅｔ　ｖ３，４个手型结
构域的Ｊｕｎ　ｏ４、Ｏｌｅ　ｅ８等花粉变应原，钙离子在这些
花粉变应原与ＩｇＥ 抗体的结合中发挥重要作
用［１７，１８］。本研究同时应用ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ软件同
源建模的方式构建目标蛋白三维模型，以预测出该
蛋白的三维结构，从图中也可以看出Ｈｕｍ　ｓ１基因
编码蛋白含有５个α－螺旋结构。而既往研究发现，
变应原蛋白表面的α－螺旋可能是潜在的ＩｇＥ 结合
位点［１９］。根据上述潜在的抗原表位及ＩｇＥ结合位
点，我们可以改造上述ＥＦ结构域或α－螺旋结构，从
而获得低致敏性变应原，降低重组变应原的致敏
性，减弱脱敏治疗过程中可能诱发的过敏反应，为
葎草花粉过敏性疾病的特异性免疫治疗提供新的研
究方向。
本研究通过重组、表达葎草花粉主要变应原
Ｈｕｍ　ｓ１基因并对其编码蛋白的结构及功能进行预
测，为制备低致敏性的标准化重组变应原奠定了基
础。
参 考 文 献
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Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＩｇＥ／ＩｇＧ４ ｅｐｉｔｏｐｅｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　Ａｎｉｓａｋｉｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　Ａｎｉ　ｓ　５，ａ　ｍｅｍｂｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＳＸＰ／
ＲＡＬ－２ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆａｍｉｌｙ．ＰＬｏＳ　Ｎｅｇｌ　Ｔｒｏｐ　Ｄｉｓ，２０１４；８（３）：ｅ２７３５．
ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ－ｐｎｔｄ．０００２７３５．
（２０１５－０３－１８收稿，２０１５－１０－１１修回）
编辑　汤　洁
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