全 文 ：收稿日期：2009-11-19 修改稿收到日期：2010-01-12
基金项目：湖南农业大学青年基金项目《显齿蛇葡萄的细胞悬浮培养生产二氢杨梅素的研究》（编号 08QN19）课题资助。
作者简介：周 耀（1980-），女，陕西礼泉人，讲师，主要从事植物学方面的研究。
茶 叶 通 讯
TEA COMMUNICATION
第 37卷第 1期
2010年 3月
Vol．37，No．1
March，2010
显齿蛇葡萄(藤茶)愈伤组织培养的研究
周 耀 李 思 长 刘 毓 王 双 双
（湖南农业大学·长沙·410128）
摘 要：以显齿蛇葡萄叶片、叶柄、茎段和茎尖作为外植体进行愈伤组织诱导与增殖,结果表明,叶片外植体明显优于其它
材料, 且以叶片正面向上培养为佳。 经过单因素试验和正交试验,MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/L KT+0.2mg/L NAA+2mg/L
2,4-D+100ml/L 椰子汁,光照强度 250～350Lx,光照时间 14h/d时,愈伤组织诱导率最高。
关键词：显齿蛇葡萄；愈伤组织；正交试验
Research on Callus Culture of Ampelopsis grossedentata
ZHOUYao，LISi-chang，LIUYu，WANGShuang-shuang
（HunanAgricultural University，Changsha，410125）
Abstract：Leaves，petioles，stems and stem tip of Ampelopsis grossedentata was adopted as explant in induction
and proliferation experiment．The results indicate that leaf is superior materia1，especially leaf upper side culture．
And the single-factor and orthogonal test shows that，MS+1.5mg ／ L，6-BA+0.15mg/L，KT+0.2mg/L，NAA+2mg/L，
2,4-D+100ml/L，coconut juice，light intensity 250～350Lx，photoperiod 14h/d achives the highest induction rate．
Keywords：Ampelopsis grossedentata,Callus culture,Orthogonal test
显齿蛇葡萄(Ampelopsis grossedentata)为葡萄
科、 蛇葡萄属木质藤本植物, 主要分布于广东、广
西、云南、贵州、湖南、湖北、江西、福建等省区[1],为民
间习用草药之一。 据记载[2],该药性凉,味甘淡,具有
清热解毒之功效,主治黄疸型病毒性肝炎、风热感
冒、咽喉肿痛、痈疮等症。显齿蛇葡萄的愈伤组织诱
导少见报道。本文以显齿蛇葡萄不同的部位为外植
体,研究其在不同基本培养基、植物生长调节剂以
及培养条件下愈伤组织的诱导效应,确定愈伤组织
诱导和增殖的最适培养基及培养条件。
1材料与方法
1.1材料
引种自湖南绥宁县。选取健壮植株中上部外围
生长旺盛的幼茎作为供试材料。
1.1.1外植体的选取
茎尖：取 3cm左右长的带顶芽茎段,在解剖镜
下逐层去除幼叶,切取 0.12～0.13mm左右大小的茎
尖分生组织。
带芽茎段：将发育良好的幼嫩茎段去除顶芽与
叶片,切成长约 1cm的带芽茎段。
叶片: 选取黄绿色幼叶, 去除幼叶边缘,切成
1cm2左右的小块。
叶柄：选取较幼嫩的成熟叶片的叶柄,顶端带
少量叶片,长约 1cm。
1.1.2继代培养材料的选取
生长良好的初代愈伤组织。
1. 2方法
1.2.1培养基的制备
以 MS、B5为基本培养基， 添加不同浓度的
2，4-D，6-BA，NAA，KT等植物生长调节剂，并添加
表 3 叶片正背面朝上对愈伤组织诱导的影响
启动时间（d）
6
7
93.3
60
Table 3 The effect on callus induction ofleaf in different s ide
出愈率（%）
70
45
接种方式
75
75
外植体数（块） 出愈数（块）
正面朝上
背面朝上
不同浓渡的椰子汁、蔗糖，pH值为 5.8～6.0。
继代培养基： 不同浓度梯度的 NAA与 2，4-D
组合。
1．2．2外植体的消毒、接种与培养条件
流水冲洗幼枝 2～3h,洗净后在超净工作台上用
70%酒精快速处理 30s， 用无菌水冲洗一次， 再用
0.1%升汞（HgCl2）浸泡：嫩叶浸泡 5min，茎段、叶柄
浸泡 7～8min，无菌水冲洗多次；接种在不同的培养
基上；培养条件：温度为 25℃～26℃，光照强度开始
为 250～300Lx、 后转为 2000～3000Lx， 光照时间
（14h/d）,相对湿度为 75%～85%。
2研究内容
①不同培养基愈伤组织的诱导；②不同外植体
愈伤组织的诱导；③叶片正、背面朝上对愈伤组织
的诱导；④不同光照强度下愈伤组织的诱导；⑤不
同光照时间愈伤组织的诱导；⑥添加不同椰子汁用
量愈伤组织的诱导；⑦不同植物生长调节剂浓度组
合的愈伤组织诱导；⑧不同植物生长调节剂组合的
继代培养。
3结果与分析
3.1不同培养基对显齿蛇葡萄愈伤组织诱导的影响
将显齿蛇葡萄幼叶接种在含有 2，4-D 2mg/L+
KT0.2mg/L+100ml/L椰子汁+蔗糖 2%+琼脂 0.7%的
不同基本培养基上（MS、 B5） ，每种处理 10瓶，每瓶
外植体 5块，培养 15d，观察统计出愈率与愈伤生
长情况（表 1）。
从表 1可知，MS培养基对显齿蛇葡萄幼叶愈
伤组织的出愈率最高（90%）、长势好，B5培养基的
出愈率最低（65%）、生长情况也最差。
MS培养基中无机盐的浓渡高，能满足愈伤组
织对矿物质营养的要求，愈伤组织生长快，同时铵
盐和销酸盐的含量高，且比例适合，不需要添加更
多的有机附加物；改良 MS培养基是在 MS培养基
的配方中把无机盐的含量减少了一半配制而成，出
愈率及愈伤生长自然隆低；铵可能对不少培养物的
生长有抑制作用，B5中铵盐浓度较低， 可能反而较
大地限制了显齿蛇葡萄愈伤的形成和生长。
3.2不同外植体愈伤诱导效果比较
将不同外植体（叶片、叶柄、茎段和茎尖）分别
接种在 MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L+100ml/L 椰
子汁+蔗糖 2%+琼脂 0.7%的培养基上培养，每种处
理10瓶，7～12d外植体开始萌动， 并随后产生愈伤
组织，结果见表 2。
从表 2可知，叶片外植体的出愈率高达 93%，
要明显高于叶柄的（85.7%）和茎段的（81.2%） ，且愈
伤生长状况较好。
叶片外植体出愈率高的原因可能是因为幼嫩
叶片的细胞分化程度较低，因而具有较大的脱分化
潜力；且与培养基接触面积大，对添加的植物生长
调节剂更为敏感。 茎尖外植体未见愈伤产生，可能
有两个原因：一是试验操作有误，如茎尖剥离时去
掉了顶端分生组织； 二是因为取材时间是秋天，已
近休眠时间。
3.3叶片正背面朝上对显齿蛇葡萄愈伤组织诱导的
影响
将切好的叶片以正面朝上和背面朝上，分别接
种于 MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L＋100ml/L 椰子
汁＋蔗糖 2％＋琼脂 0.7%的培养基上， 每处理 5瓶，
弱光培养 15d，结果见表 3。
由表 3可知，正面朝上叶片的出愈率为 93.3%，
明显高于背面朝上的（60%）处理，且启动时间短。这
可能与叶片的结构有关。显齿蛇葡萄正面朝上，叶片
背面气孔较多，且靠近疏松的海绵组织，利于吸收，
表 1 不同基本培养基对愈伤组织的影响
培养基 培养天数（d）
MS
改良 MS
B5
出愈率（%）
25
20
18
90
81
65
优，较多
良好，较多
一般，较少
Table 1 The effect on callus induction ofdifferent bas ic media
愈伤颜色 生长情况
深绿色
浅绿色
黄褐色
表 2 不同外植体的愈伤诱导效果比较
出愈数（块）
Table 2 The induction ofcallus from different explant
生长状况接种数（块） 出愈率（%）
75
70
80
10
70
60
65
0
93.3%
85.7%
81.2%
0
深绿色，较好
深绿色，较好
淡绿色，疏松
/
外植体
叶片
叶柄
茎段
茎尖
第 37 卷6 茶 叶 通 讯
表 7正交因素表
水平（mg/L）
因素
1
2
3
4
1.0
1.5
2.0
2.5
0.0
0.1
0.15
0.2
-
-
-
-
A:2,4-D
Table 7 The table of orthogonal experiment
B:KT C:6-BA D:NAA E:-
0.0
1.5
2.0
2.5
0.0
0.1
0.15
0.2
光照强度
（Lx）
表 4 不同光照强度对愈伤组织诱导的影响
2000～2500
1000～1500
250～350
0
Table 4 The effect on callus induction of different light intens ity
50
42
40
35
10
9
7
6
26
35
37
33
52.0
83.3
92.5
94.2
黄绿色，较疏松
黄绿色，较疏松
深绿色，致密
黄白色，疏松
接种数
（块）
启动时间
（d）
出愈率
（%）
愈伤组织
生长状况
出愈数
（块）
因此叶片背面接触培养基培养更为适宜。 同时还发
现，叶片背面朝上接种产生的愈伤组织褐色较明显。
3.4光照强度对齿蛇葡萄愈伤组织诱导的影响
将接种的叶片在 25℃恒温培养室进行光照强
度分组试验， 设以下三种光照强度： ①2000～
2500Lx：每层培养架用 4支 40W日光灯照明，直
射光；②1000～1250Lx：每层培养架用 2支 40W日
光灯照明，直射光；③250～350Lx：放在另外一层不
开灯的架子上， 仅靠旁边培养架上的散射光。 20d
后统计结果（表 4）。
表 5 不同光照时间对愈伤组织诱导的影响
光照时间
（h/d）
Table 5 The effect on callus induction of different illumination time
出愈数
（块）
出愈率
（%） 愈伤生长状况
外植体数
（块）
淡绿色
淡绿色，较好
深绿色，较好
有少量褐化现象
76.9
84.6
92.3
80.0
50
55
60
52
65
65
65
65
10
12
14
16
表 6不同椰子汁用量对愈伤组织诱导的影响
50
100
150
9
7
8
85.4
95.0
88.6
Table 6 The effectoncallus inductionofcoconutmilk concentra tion
35
38
39
椰子汁用量
（ml/L）
外植体数
（块）
启动时间
（d）
出愈数
（块）
出愈率
（%）
41
40
44
由表 4可知，光照强度对显齿蛇葡萄叶片愈伤
组织诱导效果的影响较显著：在暗培养下，愈伤诱
导率最高（94.2%），但愈伤质地疏松；在弱光（250～
350Lx）下出愈率最高达 92.5%，愈伤呈浅绿色，质
地致密，质量好；当光强达 2000～2500Lx时，出愈
率急剧下隆至 52%，且质地疏松。因此，显齿蛇葡萄
愈伤诱导以弱光诱导为最佳。
3.5光照时间对显齿蛇葡萄愈伤组织诱导的影响
将叶片接种在 MS+2，4-D 2mg/L+KT 0.2mg/L+
100ml/L椰子汁+蔗糖 2%+琼脂 0.7%的培养基上，
在培养温度 25℃、光照强度 250～350Lx、培养瓶中
叶片距光源约 400mm的条件下，设置光照时间梯
度 10h/d、12h/d、14h/d和 16h/d， 每处理 13瓶，15d
后统计结果（表 5）。
由表 5可见，光照时间为 14h/d时外植体出愈
率最高，同时愈伤生长状况最好；随着光照时间缩
短，出愈率下降较明显；但光照时间高达 16h/d时，
则容易出现愈伤褐化现象。 综合表 4和表 5发现，
较长时间弱光条件利于显齿蛇葡萄叶片愈伤的诱
导，可能是因为可诱导愈伤形成的植物激素的产生
依赖于光的存在[4]。
3.6椰子汁用量对显齿蛇葡萄愈伤组织诱导的影响
培养基中加入椰子汁，常能有效提高愈伤组织
诱导率。 将切好的叶片接种在 MS+2，4-D 2mg/L+
KT 0.2mg/L+蔗糖 2%+琼脂 0.7%的培养基上， 依次
调节椰子汁的用量， 每处理 3瓶，15 d后统计愈伤
组织诱导结果（表 6）。
从表 6可看出，椰子汁用量为 100ml/L时为最
合适用量，该处理的出愈率最高，用量过多或过少
时，出愈率均有所下降。
3.7不同植物生长调节剂浓度组合对显齿蛇葡萄愈
伤组织诱导的影响
在获得最佳培养基上，以嫩叶为外植体，设置
4个因素分别为 6-BA、2，4-D、NAA、KT根据 5因
素 4水平设计 L16 （54）（表 7），15d后统计愈伤组织
诱导结果，正交试验[5～7]，结果见表 8。
周 耀等：显齿蛇葡萄(藤茶)愈伤组织培养的研究第 1期 7
表 9不同植物生长调节剂组合对继代培养的影响
2,4-D 0.5,NAA1.5
2,4-D 0.5,NAA2.0
2,4-D 1.5,NAA0.5
45
45
45
Table 9 The effect on genetated culture of
different hormone combination
40
28
24
培养基（mg/L） 继代愈伤（块）初代愈伤（块）
89
62
53
成功率（%）
从表 8中可看出，通过正交实验得出植物生长
调节剂影响因子排序为：6-BA＞KT＞NAA＞2，4-D；最
佳组合为 6-BA （1.5mg/L）+KT (0.15mg/L)+NAA
(0.2mg/L)+2，4-D（2mg/L）。将最佳实验组合重复实验
3次，与正交实验结果一致。 同时发现高浓度的 6-
BA容易导致愈伤出现褐化现象。
3.8不同植物生长调节剂组合对显齿蛇葡萄继代培
养的影响
在获得初代培养最佳基本培养基上，生长良好
的初代愈伤作为继代培养的材料，以MS为基本培
养基， 分别设置不同的植物生长调节剂 NAA和
2，4-D的组合， 添加 100ml/L椰子汁+蔗糖 2%+琼
脂 0.7％ ，试验重复三次。 继代培养 15d天后，统计
试验结果（表 9）。
愈伤组织继代培养所用的植物生长调节剂最
佳组合为：1.5mg/L NAA+0.5mg/L 2,4-D。继代培养出
的愈伤组织呈团块状，黄绿色，结构较致密，增殖率
较高。
据报道[8]，培养物褐变是由于培养物含有的丰
富多酚化合物在多酚氧化酶的作用下氧化所致，在
培养基中加入抗氧化剂，对防止某些植物培养物的
褐变具有一定的效果。
3结论
显齿蛇葡萄以叶片为外植体诱导愈伤组织明
显优于其它外植体，且以叶片正面向上为佳。 经过
单因素试验和正交试验得出最佳的培养条件是：在
培养基 MS+1.5mg/L 6-BA+0.15mg/
表 8正交试验结果
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
K1j
K2j
K3j
K4j
Rj
因素主次
优水平
Table 8 The results of orthogonal experiment
编号
A
2，4- D
（mg/L）
B
KT
（mg/L）
C
6- BA
（mg/L）
D
NAA
（mg/L）
诱导率
（%）
水渍状，极少
黄绿色，疏松，较多
部分褐化现象
淡绿色，大部分出现褐化
黄绿色，疏松
浅绿色，疏松，一般
水渍状，较少
浅绿色，疏松，明显褐化现象
少量褐化现象，长势一般
明显褐化现象
深绿色，较致密，多
长势好
少量褐化现象
浅绿色，疏松
黄绿色，致密
黄褐色，疏松，较差
1
1
1
1
1.5
1.5
1.5
1.5
2
2
2
2
2.5
2.5
2.5
2.5
68.4
69.6
81.8
66.1
15.7
4
2
0
0.1
0.15
0.2
0
0.1
0.15
0.2
0
0.1
0.15
0.2
0
0.1
0.15
0.2
58.0
73.2
88.0
76.8
30
2
0.15
0
1.5
2
2.5
1.5
2
0
2.5
2
2.5
0
1.5
2.5
0
1.5
2
53.1
84.6
75.0
73.3
31.5
1
1.5
0
0.1
0.15
0.2
0.2
0.0
0.1
0.15
0.15
0.2
0
0.1
0.1
0.15
0.2
0
60.6
75.8
70.5
79.2
18.6
3
0.2
愈伤组织
生长情况
10.2
90.0
88.0
85.5
81.7
75.0
55.0
66.7
72.1
72.9
92.3
90.0
68.0
55.0
76.6
65.0
（下转第 12页）
第 37卷8 茶 叶 通 讯
L KT +0.2mg/L NAA+2mg/L 2,4-
D+100ml/L椰子汁上， 光照强度为 250～350Lx，每
日光照时间为 14h，出愈率最高，且愈伤组织生长
状况最好。
参考文献
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京：科学出版社，1883：349～356.
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黄酮含量测定[J].光谱实验室，2009，26（4）：939～943.
8 周仁超，姚崇怀.紫斑牡丹胚培养与植株再生[J].亚热带植物科
学，2001，30（3）：601
树冠，增加茶芽密度。春茶前期多采谷雨茶，提前结
束春茶采摘，在上次剪口上再提高 5～10cm进行修
剪，使树冠成弧形，以利实行平面采摘。
5．3科学施肥
土壤肥力是茶树生长的物质基础，氮、磷、钾是
茶树生长的重要营养元素。据湖南省茶叶研究所长
期肥料定位试验的结果： 连续 10年平均茶叶产量
表明，氮、磷配合比单施氮肥增产 33．7％，氮、钾配
合比单施氮肥增产 10．8％，氮、磷、钾配合的增产幅
度高达 49．6％。 同时，氮、磷、钾配施可显著提高茶
叶品质成分，茶树新梢氨基酸含量(g/kg)较不施肥的
高 47．6％，较单施氮肥的提高 24．0％[4]。 氮、磷、钾配
合施用还需注意三者的用量比例，如幼年期为了迅
速形成良好的树体骨架，磷、钾的用量相对较高。采
摘茶园主要目的是促进新梢萌发生长，氮肥的用量
应适当提高，但也不是越多越好。 据调查黄金茶产
地茶园土壤比较肥沃。位于河边的茶园养分含量较
高，山坡和稻田茶园的养分含量较低，存在养分不
平衡的问题。 在施肥上应采用重施基肥，基肥与追
肥相结合；氮肥为主，氮肥与磷钾配合施的原则。茶
园肥料种类以绿肥、土杂肥、厩肥、生物有机肥、饼
肥为主；无机肥以尿素、矿物磷、钾肥、茶树专用复
合肥为主。 微肥一般根据营养诊断施用。
茶园追肥数量应考虑补充采摘鲜叶带走的养分，
还要考虑茶树树龄、土壤的吸收性能等。 幼龄茶园肥
料用量：1～2龄，施纯氮 2～3kg ／666．7 m2；3～4龄，施纯
氮 3～6kg ／666．7m2；5～6龄， 施纯氮 6～9kg ／666．7m2。
成龄茶园施肥量按产量确定， 每 666.7m2产 100kg
鲜叶施纯氮 4～5kg， 肥料为茶树专用肥 (不含氯化
钾)。 施肥时期第一次在 3月上旬，第二次在 5月上
旬，第三次为 7月中、下旬，第四次在 9月下旬施
用，其比例为 30：20：20：30，最后一次（第 4次）与基
肥一起施用。
基肥施用农家有机肥 (厩肥、 土杂肥等)，每
666．7m2施 5～10t， 另外加施菜籽饼肥 100～150kg
和追肥留下的 30％氮肥， 在行间中央开 30～40cm
深、30cm宽的沟，施入肥料后，肥土混匀再盖土。
茶树种植前施底肥。 底肥沟深 60cm， 宽 50～
60cm，一次性施入厩肥、秸杆、绿肥、土杂肥等，每
666．7m2施 5～10t，高的可达 15～20t。 茶树专用肥或
磷钾肥 50～100kg， 菜饼 100～150kg ／666．7m2肥土
拌匀。并将粗纤维肥料放入底部，优质肥料放上面，
待表土下沉后移栽，茶苗移栽时期在春季植树节前
后进行为宜，科季移栽未成活的茶树，也应在春季
及时补蔸。
5．4病虫害防治
在病虫害防治方面，应以预防为主，综合防治，
把病虫害控制在发生初期，使用生物农药和植物源
农药进行点片施药，减少化学农药的使用，保持现
有的良好生态环境，充分发挥天敌的控制作用。
参考文献
1陈 亮，虞富莲，杨亚军等.茶树种质资源与遗传改良[M]．北京：
中国农业科学出版社，2006，12．
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4杨亚军.中国茶树栽培学[M].上海：科学技术出版社，2005.1.
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第 37 卷12 茶 叶 通 讯