全 文 ：　2007年第 1期
辽 宁 林 业 科 技
Journal of Liaoning Forestry Science &Technology 2007№1
黄波罗不同年龄材料微繁苗内源激素的比较分析①
李超峰1 ,2 ,王力华1 ,赵望峰1, 2 ,何晓刚3 ,邱　建3
(1.中国科学院 沈阳应用生态研究所 , 辽宁 沈阳　110016;2.中国科学院 研究生院 , 北京　100039;3.新
宾县陡岭林场 , 辽宁 新宾　113200)
摘　要:不同年龄植物材料的植株再生能力不同 ,繁殖质量也不同 ,要提高繁殖效率和再生苗木的
质量 ,就要深入了解初始材料的生理生化状态 ,以便为具有优良遗传特性的适龄材料选择提供依
据 。文章检测了不同年龄黄波罗组培苗的脱落酸 、生长素 、赤霉素 、玉米素型细胞分裂素型和异戊
烯基型细胞分裂素含量并做了统计学差异分析 ,结果表明:随试材年龄增长 ,黄波罗微繁苗的 iP-
type CKs 总 Cks降低 ,而Z-type CKs iP-type CKs和GAs含量增加且有显著的统计学差异 ,可作为
选择适龄微繁材料的生理指标之一 。
关键词:黄波罗;组织培养;内源激素
中图分类号:Q946.885;S792.31　文献标识码:A　文章编号:1001-1714(2007)01-0016-04
Analysis of Phase-change Related Endogenous Hormone Changes in Juvenile
and Mature of Phellodendron amurense
LI Chao-feng1 , 2 ,WANG Li-hua1 ,ZHAO Wang-feng1 , 2 ,HE Xiao-gang3 ,QIU Jian
(1.Institute of Applied Ecology , Chinese Academy of Sciences , Shenyang 110016 , China;2.Graduate School of Chinese Academy
of Sciences , Beijing 100039 , China;3.Xinbin County Douling Forestry Farm , Xinbin 113200 , China)
Abstract:The ability to propagation of woody plants with different age is different , whose quantitive indicies , could be used as a
definte theoretical foundation of the selected material with age optium and to choose optimal conditions in order to improve forest pro-
grams and make them more profitable.In order to determine these hormonal indices , the contents of ABA , IAA , GAs , iP-type
CKs and Z-type CKs were identified in cultured seedling of phellodendron amurense with different ages and analysed the statistical
difference.The results showed that the ratio of iP-type CKs total Cks decreased and Z-type CKs iP-type Cks and GAs increased
throughout the whole developmental processes and had significantly statistical difference.The fact allowed us to consider the ratio of
iP-type CKs total Cks decreased and Z-type CKs iP-type Cks and GAs as the indices of the selected material with age optium.
Key words:phellodendron amurense ;tissue culture
　　乔木树种的生长周期较长 ,如依靠有性繁殖进
行林木改良 ,改良进程会过于漫长。与之相对应的
无性繁殖不仅可以获得加性遗传增益 ,而且繁殖周
期短 、速度快 ,特别是利用组织培养手段进行的无性
繁殖 ,繁殖系数能够成倍提高 ,并且繁殖不受季节限
制 ,因而具有很大的发展潜力 。
然而 ,无性繁殖后代是母株取样部位发育状态
的继续。当优良植株的目的性状比较充分地表现出
来时 ,进行无性繁殖常会遇到成熟效应的影响 ,导致
植株再生困难 ,这几乎是组织培养中的普遍现象;另
一方面 ,植物的内源物质(如内源激素)动态是调控
植株器官发生的重要因素 ,了解不同发育阶段繁殖
材料的内源激素含量对选择适生繁殖材料具有十分
重要的意义 ,为此结合黄波罗(Phellodendron amu-
rense)的组培繁殖进行了相关探讨。
1　材料和方法
1.1　植物材料
不同年龄黄波罗材料由中国科学院沈阳应用生
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① 收稿日期:2006-08-23
基金项目:中国科学院知识创新工程重要方向项目(SCX2-YW-N-031)
态研究所树木园提供 。早春取回带有饱满腋芽 1年
生枝条水培 ,待腋芽萌发即接种于MS+BA 2mg·L-1
+NAA 0.3mg·L-1 、pH值 6.0的培养基上 ,在光照度
1 500 ～ 2 000lx 、光周期 14 10h 、温周期 20 18℃条件
下培养。其中 ,No1是从种子胚组培成功的再生苗;
No2 、No3和 No4分别为源自 5 ～ 6年生 、10 ～ 20年和
大于 30 年生植株的腋芽组培形成的 1 代再生苗 。
继代前收集植物材料并立即贮藏在-20℃冰箱中 ,
用于植物激素的提取及测定。
1.2　植物激素的提取
新鲜叶片 1.0g于冰浴中研磨 ,研磨过程中加入
少量的 PVP(聚乙烯吡咯烷酮),以去除酚类等非激
素物质 。匀浆后立即转入 4ml 80%的冷甲醇提取液
中 , 4℃下提取 4h , 10 000 r min 离心 10min ,取上清
液。余物中再加入 1ml冷甲醇提取液 ,充分混匀 ,同
上处理 ,然后合并上清液 。
Z 型细胞分裂素(Z -type CKs)、异戊烯基型细
胞分裂素(iP -type CKs)、生长素(IAA)、赤霉素类
(GAs)和脱落酸(ABA)的测定采用间接酶联免疫吸
附法(ELISA)(何钟佩 , 1993), ELISA 试剂盒由中国
农业大学作物化控室提供 ,程序按其说明书进行 。
样品重复 3次 ,多重比较用 SPSS11.0计算 。
2　结果与分析
2.1　不同年龄试材外植体的诱导培养
No1经过 5个月的培养 ,愈伤组织已经大量形
成 ,并有比较多的诱导芽产生 ,繁殖系数可达 5.0 ～
6.0 ,经生根诱导能发育成再生植株;培养约 20d后 ,
No2外植体的伤口处愈伤组织较少;No3 的诱导效
果不是很明显 ,仅有细微分化;No4 基本上没有变
化 ,但在后续继代培养过程中各种材料一般经过 5
～ 8次继代 ,可以部分解除由于年龄差异造成的诱
导和分化差异 ,其生长势也逐渐与幼龄材料接近相
同 ,并最终形成再生植株 。
2.2　不同年龄试材的 5种内源激素含量变化
图 1　不同年龄黄波罗微繁体内源 Z-CKs 与 iP-CKs的含量
通过对不同年龄材料微繁产生的 1代组培苗体
内 5种激素含量的变化分析 ,可以发现 Z-type CKs
和 iP-type CKs表现出相似的变化趋势(图1)。No1
的这两种激素含量最高 ,No4最低;随试材起源年龄
增长 ,这两种激素含量呈下降趋势 。
不同发育阶段材料的微繁材料中 GAs 和 IAA
含量测定结果分别如图 2和图 3。
图 2　不同年龄黄波罗微繁体内源 GAs 含量
图 3　不同年龄黄波罗微繁体内源 IAA含量
No1中GAs含量最高 ,No3 最低 ,即在 4个发育
阶段微繁材料中 ,GAs含量呈正“V”形 ,与外植体年
龄相关;而 IAA ,则是在 No3 中含量最高 ,在 No1 中
最低 ,呈倒“V”形 ,与外植体发育阶段相关。相对于
GAs含量 , IAA含量相对较低 ,且二者在不同发育阶
段微繁材料中成相对的变化趋势 。结合不同发育阶
段外植体诱导过程中的形态学变化 ,二者相异的变
化趋势说明 IAA 与 GAs均能增进细胞分裂和细胞
分化 ,但是具有不同的作用途径或方式。在不定芽
诱导过程中 ,随起始外植体年龄的增加 ,微繁物细胞
的分裂(或分化)速率和能力都逐渐降低 ,在组织培
养中表现为愈伤组织或不定芽的诱导能力逐渐降
低 ,说明不同发育阶段的微繁体在培养期间外观形
态的变化不能作为其是否具有较高繁殖能力的指
标 ,而试材的内源代谢状况才是适龄材料选择的可
靠途径 。另外 ,GAs含量的变化趋势也可能说明不
同发育阶段微繁材料中所含的 GAs种类不同 ,而不
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　第 1 期　　　　　　　　　李超峰等:黄波罗不同年龄材料微繁苗内源激素的比较分析　　　　　　　　　　2007 年　
同类型的GAs刺激细胞分化的能力不同[ 6] ,从而导
致其外植体无性繁殖能力的不同。1996年 ,李宗霆
曾报道适量 IAA促进燕麦(Avena fatua)幼茎伸长生
长 ,但有效期较短 ,必须持续供应才能保持生长速
率;而适量的 GAs 促进伸长生长的有效期长。此
外 ,GAs对整株植物有明显的促进生长效果 ,而 IAA
的作用却很难表现在整株植物 。依据上述结论可以
推断出 , 4 个年龄梯度的微繁材料中内源 GAs和
IAA含量正是通过这种相互协调和拮抗的方式来调
节微繁材料的生长和发育。同时 ,GAs 含量差异显
著 ,而 IAA无显著差异 ,表明 GAs是造成不同发育
阶段微繁体无性繁殖能力差异的主要因素 ,相应地
也促使了发育阶段间的转化 ,并可能使部分优良遗
传特性产生差异表达 。
图 4　不同年龄黄波罗微繁体内源ABA含量
不同发育阶段黄波罗微繁材料中 ABA含量的
变化见图 4 ,其中 No2含量最高 ,No3 、No4含量依次
降低。分析这种现象产生的原因 ,主要是在培养初
期这样一种特定环境中 ,细胞正处于活跃的代谢阶
段 ,末端代谢产物还没有形成积累的原因是 ABA的
主要生理功能是促进成熟和抑制生长 ,那么在这个
阶段ABA含量没有统计学上的差异也就可以理解
了。当然 ,ABA在后续继代过程中的变化规律是否
如此 ,还有待于进一步研究。
2.3　不同年龄试材的 5种内源激素含量比值分析
为了解与黄波罗发育阶段转化相关的生化物质
代谢差异 ,并依此确定外植体选择的适龄期 ,对有关
试材的内源激素含量比例做了分析 ,结果见表 1。
其中 , GAs Z -type CKs 、GAs iP -typeCKs 、Z -
type CKs iP-type CKs 、ABA 总 CKs 、Z -type CKs 总
CKs 、GAs 总 CKs和 ABA iP-type CKs随试材年龄的
增长基本成升高的趋势(No3处略有降低 ,但高于
No1),其中 GAs Z -type CKs 、GAs iP-type CKs 和 Z
-type CKs iP-type CKs比值都大于 1 ,这与黄亚辉
(2002)在茶树(Camellia sinensis)春梢萌动期发现的
结果是一致的。结合诱导过程中外植体的形态学分
表 1　不同年龄试材的 5种内源激素含量比值分析
比值类型 No1 No2 No3 No4
GAs Z-CKs 2.45 4.22 3.96 5.72
ABA Z-CKs 0.34 1.02 0.70 0.54
Z-CKs iP-CKs 1.01 1.42 1.26 2.54
GAs iP-CKs 2.49 5.98 4.97 14.54
ABA iP-CKs 0.34 1.45 0.88 1.36
GAs 总CKs 0.24 2.47 2.20 4.10
ABA 总CKs 0.17 0.60 0.39 0.38
Z-CKs 总CKs 0.50 0.58 0.57 0.71
iP-CKs 总CKs 0.50 0.41 0.44 0.28
IAA Z-CKs 4.88×10-6 2.09×10-5 4.03×10-5 1.84×10-5
IAA GAs 1.99×10-6 4.97×10-6 1.02×10-5 3.23×10-6
IAA 总CKs 2.45×10-6 1.23×10-5 2.24×10-5 1.32×10-5
IAA ABA 1.46×10-5 2.05×10-5 5.72×10-5 3.44×10-5
IAA iP-CKs 4.94×10-6 2.97×10-5 5.06×10-5 4.69×10-5
ABA GAs 0.14 0.24 0.18 0.09
析 ,可以推测出GAs和两种 CKs在促进细胞分裂分
化过程中具相互拮抗作用 ,即试材的初始发育年龄
增长 ,其比值升高 ,二者共同作用的结果逐渐减弱了
外植体诱导细胞分裂(或分化)的促进能力 。比较
IAA Z -type CKs 、IAA GAs 、IAA iP -type CKs 、IAA
ABA和 IAA 总 CKs的变化 ,No1为最低 ,至No3阶段
逐渐升高 ,但均小于1 ,即不同发育阶段各微繁材料
中 IAA含量相对于其它激素(iP-type CKs 、Z -type
CKs 、ABA和总 CKs)均较低 ,这可能正好说明适量
IAA促进生长发育的有效期较短 ,或者对较成熟的
生长发育阶段试材的生理效应较小;另一方面 ,通过
单因素方差分析 ,可以看到 Z -type CKs iP -type
CKs和 iP -type CKs 总 CKs 都存在显著差异(Z -
type CKs iP-type CKs , F =37.677＊＊;iP -type CKs
总 CKs ,F =37.68＊＊),但前者的各阶段比值均大于
1 ,后者则小于 1 ,说明 iP-type CKs和 Z -type CKs
对外植体的增殖能力有着不同的调控作用;从表 1
中还可看出 ,幼龄材料的细胞分裂(或分化)需要一
个相对较高水平的 iP-type CKs和相对较低水平 Z
-type CKs的环境 ,即 iP-type CKs正向生理效应高
于Z -type CKs ,但随着外植体生长发育状态的不断
成熟 , iP-type CKs主导的调控过程逐渐向 Z -type
CKs主导的调控过程转化 ,两者此消彼长的变化趋
势可以作为生长发育阶段转化的指证 ,当然在不同
发育阶段 ,两者是通过叠加或协调方式来共同调控
外植体的器官发生的。
3　讨论和结论
外植体经诱导产生的微繁体是母体材料的继承
和发展 ,植物组织培养的目的之一就是获得大规模
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的优良苗木 ,而供体材料遗传特征是在生长发育阶
段逐渐表现的 ,这样供体材料的发育阶段往往就接
近或已经成熟 ,与幼嫩供体材料相比就相对难于繁
殖 ,但为了获得优良苗木 ,适龄材料的选择就显得尤
为重要。本实验正是通过对不同发育阶段外植体在
无性繁殖过程中的内源代谢状态与外观形态学观察
相结合来对适龄材料做出选择 ,结果发现不同发育
阶段的供体材料经多次继代后 ,无性繁殖能力和生
长势的增加 ,与具有相似繁殖能力和生长势的幼嫩
材料相比 ,充分表现遗传特征的成熟材料正是无性
繁殖试材选择所必须的 。同时 ,发育阶段间具显著
差异的 iP-type CKs total Cks 、Z -type CKs iP -type
Cks和GAs可作为选择适龄微繁供体的指标。这与
Ana Elisa Valdés和胡虹等(2002 , 2004和 1993)分别
在不同年龄的辐射松 、伞状石松和云南山楂发现的
结果相一致。
参 考 文 献:
[ 1] 何钟佩.农作物化学控制实验指导[ M] .北京:北京农业
大学出版社 , 1993.60-68.
[ 2] 胡虹 , 季本仁 , 段金玉 , 等.云南山楂中吲哚乙酸 、脱落
酸 、玉米素和玉米素核苷的内源水平及其生根率[ J] .云
南植物研究 , 1993 , 15(3):278-284.
[ 3] 李宗霆 ,周燮.植物激素及其免疫检测技术[ M] .南京:江
苏科学技术出版社 , 1996.177-196.
[ 4] Ana Elisa Valdé s , Maria Luz Centeno , Santiago Espinel , Belé n
Fernández.Could plant hormones be the basis of maturation in-
dices in Pinus adiate[ J] .Plant Physiol.Biochem , 2002 , 40
(3):211-216.
[ 5] Ana ElisaValdé s , Belén Fernández , Marí a Luz Centeno.Hor-
monal changes throughout maturation and ageing in Pinus pinea
[ J] .Plant Physiology and Biochemistry , 2004 , 42(4):335-
340.
[ 6] 马焕普 ,刘志民.赤霉素与果树的生长发育[ J] .植物学
通报 , 1998 , 15(1):27-36.
(责任编辑:韩素梅)
(上接第 8页)
表 3　不同处理时间山杏花模拟方程及 LT50值
处理时间(h) 模拟方程 半致死温度 相关系数 纠正系数 F值 F0.01(1 , 3)
2 Y2= 47.539271+14.613490.4484535x -5.9804 0.9818 1.50 80.0591
4 Y4= 49.30997
1+15.762260.469209.3x -5.8772 0.9716 1.50 50.6677
6 Y6= 50.24738
1+15.760830.4684881x -5.8860 0.9755 1.50 58.8594
8 Y8= 52.82482
1+15.199820.4693619x -5.7978 0.9776 1.50 64.6735
34.1
3　结果与讨论
3.1　不同温度山杏花相对电导率差异显著 ,在 0 ～
-8℃,随温度的降低 ,山杏花相对电导率有渐增的
趋势 ,呈S 形曲线变化。从-4℃～ -6℃为电解质
渗出率急剧增加期。山杏花期冻害的主导因子是温
度 ,低温持续的时间只有在临界温度时才起作用。
3.2　利用 Logistic方程编程求解 2h 、4h 、6h 、8h 山杏
花 LT50 值 分 别 为 - 5.9804℃、 - 5.8772℃、
-5.8860℃和-5.7978℃,与形态指标褐变率相吻
合 ,表明利用此程序求解山杏花期冻害的 LT50值是
准确可行的。
3.3　对致死低温临界值求解的方法很多 ,但都过于
复杂 ,不方便 ,因此利用 Logistic方程编程求解 ,只要
输入相应的温度及相对电导率 ,则可求出模拟方程和
致死低温临界值 ,从本实验的结果看 ,效果极佳。对
于方程的模拟 ,K值的赋予是求得该植物组织致死低
温临界值的核心 ,通过计算机的数次模拟试验 ,取得
一个最合适的K值 ,是方程模拟极显著的前提 。
参 考 文 献:
[ 1] 刘桂森 , 张立斌 , 王同坤 , 等.山杏花芽分化及开花物候
期观察[ J] .沈阳农业大学学报 , 1996 , 27(1):95-96.
[ 2] 卢振宇.山杏生产现状与发展对策[ J] .北方果树 , 1998 ,
(4):28-29.
[ 3] Rolf N , Rune B.Freeze injury to strawberry plants as evaluated
by crown tissue browning regrowth and yield parameters[ J] .
Scientia Horticulturae , 1999 , 81(3):321-329.
[ 4] 苏金明 , 傅荣华.统计软件 SPSS for Windows 实用指南
[ M] .北京:电子工业出版社 , 2000.
[ 5] 张宪政 ,等.植物生理学实验技术[ M] .沈阳:辽宁科学技
术出版社 , 1989.329-333.
[ 6] 朱根海 ,刘祖祺 , 等.应用 Logistic方程确定植物组织低温
半致死温度的研究 [ J] .南京农业大学学报 , 1986 , (3):9
-16.
[ 7] 蔡贤如 ,高聿清.Logistic 方程参数优化估计方法的研究
[ J] .沈阳农业大学学报 , 1995 , 26(1):64-67.
(责任编辑:韩素梅)
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