全 文 ：唐泽紫 ,许　磊 ,张卫明 ,等.续随子愈伤组织诱导与不定芽分化探讨 [ J] .江苏农业科学 , 2011, 39(2):108-110.
续随子愈伤组织诱导与不定芽分化探讨
唐泽紫 1 , 许　磊 1 , 张卫明 1, 2 , 孙立军 2 , 陆长梅 1
(1.南京师范大学生命科学学院 ,江苏南京 210046;2.南京野生植物综合利用研究院 ,江苏南京 210042)
　　摘要:为建立续随子的高频再生体系 ,从续随子外植体除菌方案与外植体选择 、愈伤组织诱导以及不定芽分化等
多方面进行了探索。结果显示 , 70%乙醇处理 15 s+无菌水冲洗 3次 +4%次氯酸钠处理 5 min+无菌水冲洗 5次为
最佳外植体灭菌方案;根 、茎和叶中 , 仅有叶片能诱导出愈伤组织;虽然多个激素组合可以诱导续随子叶片产生愈伤组
织 , 但在 MS培养基 , TDZ0.2 mg/L或 0.4 mg/L以及 TDZ/NAA(0.5/0.1 mg/L)组合 , 光下培养时 ,愈伤组织诱导率达
到 100%,且出愈时间短 、愈伤生长速度快;新鲜愈伤组织只有在 MS培养基 , TDZ 0.4 mg/L或 TDZ/NAA
(0.5/0.1mg/L)才可分化出单个不定芽(无丛生芽),且分化率也仅为 25%和 15%。
　　关键词:续随子;愈伤组织;诱导;不定芽;分化
　　中图分类号:S565.904　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2011)02-0108-03
收稿日期:2010-05-21
基金项目:江苏省自然科学基金(编号:BK2008095)。
作者简介:唐泽紫(1984—),女 , 安徽安庆人 ,硕士研究生 ,主要从事
植物资源方面的研究。 E-mail:tangzi1010@ 163.com。
通信作者:陆长梅,副教授 , 主要从事植物生理与资源利用方面的研
究。 E-mail:luchangmei@njnu.edu.cn。
　　20世纪中叶以来 ,社会对能源的依赖性日益增大 ,地球
上不可再生矿物能源快速消耗 ,能源危机逐渐凸现 。而碳氢
化石燃料的大量利用 ,造成了生态环境的破坏 。开发利用各
种新型的 、特别是可再生的植物能源资源 ,已成为化解能源危
机和生态危机的有效途径 。由于中国土地 、人口与粮食的状
况 ,中国发展能源植物只能在作物难以生长的边缘地带 ,如山
地 、干旱地 、盐碱地等地发展。而对于江苏来说 ,虽然山地、干
旱地等面积小 ,但沿海地区却有全国面积最大 、面积逐年增加
的滩涂 。利用盐分含量高的滩涂发展能源植物 ,将是一个既利
于充分开发和利用盐土资源 ,又利于开发植物能源的方法 。
续随子(EuphorbialathyrisL.),大戟科 2年生草本植物 ,
别名千金子 、小巴豆等 。它不仅是我国的传统中药材 ,具有防
治血吸虫、抗肿瘤 [ 1-2 ] 、治疗细菌性痢疾和气管炎 [ 3 ]等多重作
用 ,而且它还是美国已大力发展 、我国 “十一五 ”规划重点发
展的 5种能源植物 (黄连木 、文冠果 、麻疯树 、光皮树 、续随
子)之一 [ 4 -5 ] ,也是这 5种植物中唯一适合在江苏种植的植
物 。续随子具有一定的抗性 ,耐瘠薄土地 、耐旱和耐 -5 ℃低
温 。续随子还具有一定的耐盐性 ,但其耐盐性还不能充分适
应滩涂的盐分含量 。为充分利用江苏省乃至全国日益增长的
滩涂发展药用与能源植物 ,需要培育出能适应滩涂盐土上生
长的续随子高耐盐新品系 。然而 ,以基因改良等为目的的新
品种的培育需要以建立无性高频再生体系为基础 。因此 ,本
研究以续随子幼苗的不同器官为外植体 ,探讨愈伤组织诱导 、
不定芽分化等的最适条件 ,以期为进一步培育续随子高耐盐
新品种奠定基础 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
续随子种子来源于南京野生植物综合利用研究院试验
田 ,种源于 2007年收集于河南省淮阳县朱集镇 。
1.2　试验方法
1.2.1　外植体获得　室内花盆中播种续随子种子 ,种子埋于
土下 2 ～ 3cm深 ,出苗前每天浇水 ,待子叶出土后 ,隔天浇水 。
当幼苗长至 15 ～ 20 cm高度时 ,分别取幼嫩叶片 、茎段和根段
作为外植体进行消毒除菌和愈伤组织诱导。
1.2.2　外植体消毒除菌 　将盆栽苗叶片用无磷肥皂水泡洗
5 min,自来水冲洗 30 min后 ,再按表 1中方法进行消毒除菌 ,
最后用灭菌滤纸吸干水分 。每组接种 6瓶 , 15d后观察结果 。
表 1　续随子外植体除菌方案
序号 除菌方案 污染率(%)
1 4%次氯酸钠处理 5min+无菌水冲洗 5次 100
2 4%次氯酸钠处理 10min+无菌水冲洗 5次 83.3
3 70%乙醇处理 15s+无菌水冲洗 3次 +4%
次氯酸钠处理 5min+无菌水冲洗 5次
8.3
4 70%乙醇处理 15s+无菌水冲洗 3次 +4%
次氯酸钠处理 10min+无菌水冲洗 5次
0
1.2.3　愈伤组织诱导　将除菌叶片切成 0.5 cm×0.5 cm大
小 ,茎和根切成 0.5cm长度小段 ,分别接种在表 2中的培养
基上进行愈伤组织诱导 。每种外植体每次接种 5瓶 ,每瓶接
种外植体 6个 ,试验重复 3次 。 35 d后记录每个处理所有外
植体的愈伤组织个数 ,计算愈伤诱导率 。愈伤诱导率 =愈伤
个数 /接种个数 ×100%。培养温度为(25±2)℃。暗培养不
照光 ,光照培养组的光强为 1 500 lx,光照时间为 12h/d。
1.2.4　愈伤组织上不定芽的诱导 　待上述愈伤组织覆盖整
个外植体时 ,选取新鲜愈伤组织 ,将其转接到表 3分化培养基
上进行不定芽诱导 。培养条件为 (25 ±2)℃, 2 500 ～
3 000lx,光照时间 12 h/d。
2　结果与分析
2.1　外植体除菌
因续随子萌发时下胚轴生长旺盛 ,平均长度超过 10 cm,
致使无菌苗在培养瓶内生长困难 。因此本试验所用外植体均
来自于室内盆栽苗 。而续随子苗本身又带有大量内生菌 ,因
—108— 江苏农业科学　2011年第 39卷第 2期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2011.02.102
此利用带有大量内生菌的非无菌苗作为外植体进行组织培养
时 ,外植体除菌条件就显得尤为重要 [ 6 ] 。如表 1所示 ,以叶片
为外植体时 ,仅用 4%次氯酸钠处理组的污染率较高 ,而用乙
醇加次氯酸钠复合处理效果较好;但复合处理中 4%次氯酸
钠处理 10min时 ,虽然除菌效果好 ,但后续出愈率不高 ,因此
后续试验均采用方案 3方法除菌 。
2.2　愈伤组织诱导
续随子根段在各愈伤诱导培养基中均未见变化 ,茎段也
仅是径向增粗 ,并无明显愈伤组织产生 ,因此 ,本研究后续结
果均是以续随子叶片作为外植体获得 。表 2显示了采用不同
基本培养基 、不同种类和不同浓度激素组合以及光暗培养等
多个培养条件下续随子叶片的愈伤诱导结果 。
　　不同基本培养基对续随子叶片愈伤组织诱导的影响微
弱 。如表 2所示 ,光照条件下 ,当 6 -BA/NAA的浓度比为
2/1(mg/L)和 3 /1(mg/L),或当 6-BA/2 , 4 -D的浓度比为
1/4(mg/L)时 , MS和 N6+B5+MS培养基上的愈伤组织诱导
率间没有显著性差异 ,仅仅在 6 -BA/2 , 4-D的浓度比为
0.5 /3(mg/L)时 , N6+B5+MS培养基上的愈伤组织诱导率
[ (100.0±0.0)%]略高于 MS培养基 [ (92.6±4.5)%] 。
不同激素组合对续随子叶片出愈影响表现在 2个方面 。
一是影响外植体出愈时间:如以 6-BA+NAA激素组合处理
时 , 18 ～ 20 d时叶片发生卷曲 ,切口处开始出现愈伤组织 ,
35d左右淡黄色颗粒状愈伤组织覆盖整个叶片 (如图 1 -A
所示);6-BA+2, 4-D或 TDZ+2 , 4 -D激素组合下 ,出愈
时间提早至 14 d;TDZ+NAA或仅 TDZ激素组合下 ,出愈时
间更是提早至 10 d,且随着培养时间的延长 ,愈伤组织逐渐转
为绿色(图 1-B)。二是影响愈伤组织诱导率:TDZ和 TDZ+
NAA组合的愈伤诱导率相对最高(86.7% ～ 100%), 6-BA
+2 , 4-D激素组合次之(58.8% ～ 100%), 6-BA+NAA组
合相对较低(17.5% ～ 80.2%)。
　　不同激素浓度配比也对愈伤组织诱导有较大影响 [ 7] ,且
表现出一定范围内 ,培养基中生长素相对浓度越高 ,愈伤组织
诱导率越高的趋势 。如:MS培养基上 , 光照条件下 , 当
6-BA/NAA的浓度比为 3 /0.5、3 /1和 2 /1(mg/L)时 ,愈伤组
织诱导率分别为(17.5±1.1)%、(70.2±2.8)%和(80.2±
3.1)%;N6+B5+MS培养基上 ,光照条件下 ,当 6-BA/2 , 4
-D浓度比为 2/5、1 /4和 0.5/3(mg/L)时 ,愈伤组织诱导率
分别为(74.3±3.9)%、(90.9±3.8)%和 (100.0±0.0)%。
这与朱根发等 [8 ] 、李畅等 [ 9]的研究结果一致 。
有文献显示 ,光暗培养条件对不同植物的愈伤组织诱导有
不同影响 [ 10] ,如暗培养有利于山药零余子的愈伤组织诱导 ,而
光培养则有利于叶片的愈伤组织诱导[ 11] 。而表 2显示暗培养
下 ,续随子愈伤组织诱导率降低 ,愈伤组织也较为疏松。
2.3　愈伤组织上不定芽诱导
进一步将表 2中诱导出的愈伤组织分别转接到表 3中的
各培养基上 ,进行不定芽的诱导 ,并于 40 d后进行统计 。结
果显示 ,只有在 TDZ0.4 mg/L和 TDZ/NAA0.5 /0.1(mg/L)
2种激素组合上分化出不定芽 ,分化率分别为 25%和 15%,
且不定芽为单芽 ,而非丛生芽(图 2);未分化的愈伤组织逐渐
褐化 、皱缩 ,直至死亡 。
表 2　不同培养条件对续随子愈伤组织诱导的影响
序号 基本培养基
激素浓度(mg/L)
6-BA NAA
光照
出愈
时间
(d)
出愈率
(%)
1-1 MS 2 2 Y 18 ～ 20 59.6±2.6
1-2 MS 2 1 Y 18 ～ 20 80.2±3.1
1-3 MS 2 0.5 Y 18 ～ 20 60.5±2.6
1-4 MS 3 2 Y 18 ～ 20 30.0±1.9
1-5 MS 3 1 Y 18 ～ 20 70.2±2.8
1-6 MS 3 0.5 Y 18 ～ 20 17.5±1.1
1-7 MS 2 1 N 18 ～ 20 60.0±2.8
1-8 MS 3 1 N 18 ～ 20 60.0±3.7
1-9 N6 +B5 +MS 2 1 Y 18 ～ 20 77.4±3.5
1-10 N6 +B5 +MS 3 1 Y 18 ～ 20 68.2±3.2
序号 基本培养基
激素浓度(mg/L)
6-BA 2, 4-D
光照
出愈
时间
(d)
出愈率
(%)
1-11 N6 +B5 +MS 0.2 2 Y 14 72.2±4.2
1-12 N6 +B5 +MS 0.5 2 Y 14 58.8±3.5
1-13 N6 +B5 +MS 0.5 3 Y 14 100.0±0.0
1-14 N6 +B5 +MS 1 4 Y 14 90.9±3.8
1-15 N6 +B5 +MS 2 5 Y 14 74.3±3.9
1-16 N6 +B5 +MS 2 6 Y 14 87.5±2.4
1-17 N6 +B5 +MS 1 4 N 14 45.5±3.3
1-18 N6 +B5 +MS 2 5 N 14 57.1±2.2
1-19 N6 +B5 +MS 2 6 N 14 79.5±3.1
1-20 MS 0.5 3 Y 14 92.6±4.5
1-21 MS 1 4 Y 14 87.0±4.1
序号 基本培养基
激素浓度(mg/L)
TDZ 2, 4-D
光照
出愈
时间
(d)
出愈率
(%)
1-22 MS 0.4 0 Y 10 100.0±0.0
1-23 MS 0.2 0 Y 10 100.0±0.0
1-24 MS 0.2 2.0 Y 14 70.0±2.4
1-25 MS 1.0 0.2 Y 14 53.3±3.5
序号 基本培养基
激素浓度(mg/L)
TDZ NAA
光照
出愈
时间
(d)
出愈率
(%)
1-26 MS 0.2 2.0 Y 10 86.7±4.1
1-27 MS 0.5 0.5 Y 10 90.9±2.7
1-28 MS 1.0 0.2 Y 10 88.0±1.5
1-29 MS 2.0 1.0 Y 10 100.0±0.0
1-30 MS 0.5 0.1 Y 10 100.0±0.0
　　注:N
6
+B
5
+MS代表培养基采取 N
6
的大量元素 、MS的微量元素和 B
5
的
有机成分;Y代表光照 、N代表遮光处理;培养基蔗糖浓度为 2.2%、琼脂浓度
为 0.7%、pH值为 5.8。
3　结论与讨论
现代遗传育种的基础是建立再生体系 ,而建立再生体系
的基础是进行不定芽的分化 。为扩大药用与能源植物续随子
的种质资源 ,筛选出适合滩涂生长的续随子新类型 ,本研究首
先比较研究了不同外植体 、不同激素类型和浓度配比 、不同培
养基类型以及光暗条件对愈伤组织诱导的影响 。结果发现:
在供试条件下 ,只有叶片能成功诱导出愈伤组织;不同基础培
养基对愈伤组织的诱导影响不大;TDZ单独诱导以及 TDZ+
NAA组合对续随子叶片的愈伤组织诱导效应更显著 ,诱导率
都达到 100%,并且愈伤生长快速且状况良好;一定范围内 ,
培养基中生长素的相对浓度越高 ,愈伤组织分化率越高;暗培
—109—唐泽紫等:续随子愈伤组织诱导与不定芽分化探讨
表 3　不同培养条件对续随子不定芽分化的影响
序号 基本培养基
激素浓度(mg/L)
6-BA NAA
琼脂
浓度
(%)
不定芽
诱导率
(%)
2-1 MS 2 0.05 0.8 0
2-2 MS 2 0.2 0.8 0
2-3 MS 1 0.1 0.8 0
2-4 MS 4 0.1 0.8 0
2-5 B5 +MS 2 0.1 0.8 0
2-6 B5 +MS 3 0.1 1.0 0
2-7 B5 +MS 1 0.1 0.9 0
2-8 B5 +MS 2 0.1 0.9 0
2-9 B5 +MS 3 0.1 0.9 0
2-10 B5 +MS 3 0.05 0.9 0
序号 基本培养基
激素浓度(mg/L)
KT NAA
琼脂
浓度
(%)
不定芽
诱导率
(%)
2-11 MS 1.0 0 0.7 0
2-12 1/4MS 1.0 0 0.7 0
2-13 1/4MS 2.0 0.2 0.7 0
序号 基本培养基
激素浓度(mg/L)
TDZ NAA
琼脂
浓度
(%)
不定芽
诱导率
(%)
2-11 MS 1.0 0 0.7 0
2-14 MS 0.5 0.2 0.7 0
2-15 MS 0.2 0.3 0.7 0
2-16 MS 1 0.1 0.7 0
2-17 MS 2 0.2 0.7 0
2-18 MS 0.2 0 0.7 0
2-19 MS 0.4 0 0.7 25
2-20 MS 0.5 0.1 0.7 15
　　注:B5 +MS代表培养基采取 B5的有机成分和 MS的无机成分;
1 /4MS培养基表示大量元素减至原来的 1 /4;培养基蔗糖浓度为
2.2%、pH值为 5.8。
养对续随子愈伤组织诱导不利等 。根据以上分析 ,筛选出续
随子愈伤组织诱导的最佳条件为:采用幼嫩叶片作为外植体 ,
选用 MS培养基 , 激素组合采用 TDZ0.2 mg/L或 TDZ
0.4 mg/L或 TDZ0.5mg/L+NAA0.1 mg/L,培养温度为 (25
±2)℃,光强 1 500lx,光照时间 12 h/d条件下 ,愈伤组织诱
导率可达到 100%。而进一步在愈伤组织上分化出不定芽则
需要在 MS培养基上 , 激素组合为 TDZ0.4 mg/L或 TDZ/
NAA为 0.5 /0.1(mg/L)下才可进行 ,并且不定芽均为单芽 ,
且分化率相对较低 ,仅分别为 25%和 15%。
　　为何续随子愈伤组织如此难分化 ,这可能有多种原因 。
一种可能是续随子愈伤组织诱导与分化需要特殊的条件 ,而
我们的筛选工作依然不够 ,最佳条件尚未摸索到 。另一可能
是续随子基因型的特殊性导致其愈伤组织较难诱导与分化 。
类似的情形已在很多报道中发现 ,如田士林等 [ 12 ]曾以 4种植
物的 5种外植体为试验材料进行愈伤组织诱导 ,发现:烟草和
菊花最易产生愈伤组织且可诱导分化出大量的不定芽 ,大豆
子叶和番茄叶片能产生愈伤组织 ,但是很难分化不定芽 ,而大
豆的根茎很少有愈伤组织产生 ,且几乎不分化 。至于续随子
愈伤组织诱导分化难的具体原因还有待进一步深入研究 。
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