全 文 ：Vol. 3 农 药 学 学 报 No. 2
2001年 6月 CHINESE JOURN AL OF PEST ICIDE SCIENCE 60～ 66
①
葱叶枯病菌 Stemphylium botryosum
毒素的分离与除草活性研究
张金林　董金皋　樊慕贞* 　李　川
(河北农业大学真菌毒素实验室 , 保定　 071001)
摘　要　葱叶枯病菌在活体外可以产生致病毒素 ,用改良 PS培养基培养所得滤液经
TLC分离获得Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ、Ⅴ 5种组分 ,其 R f值分别为 0. 31、 0. 47、 0. 74、 0. 80和 0. 90,在乙
醇中最大紫外吸收峰分别为 240、 247、 223、 236和 258 nm。 生物测定结果表明 ,组分Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ
对马唐的生长有明显的抑制作用 ,其中以组分Ⅳ生物活性最高。粗毒素对禾本科杂草种子萌发
抑制效果高于对阔叶杂草 ,而对玉米、水稻、油菜等种子萌发影响很小。 试验还发现 ,毒素对马
唐的防效最高 ,与百草枯药效相当。 毒素对马唐叶绿素 a的含量影响不大 ,但对叶绿素 b和叶
绿素总含量影响较大。
关键词　葱叶枯病菌 ;毒素 ;分离 ;除草活性
植物病原真菌毒素是植物病原真菌产生的一类次生代谢产物 ,在寄主植物上表现出的症
状与病原菌侵染造成的症状类似。尽管目前人们已经认识到植物病原菌毒素在品种抗病性快
速测定、抗病突变体筛选与细胞工程育种、植物的诱导抗病性等方面有诸多应用 ,同时真菌毒
素及其衍生物可能是今后除草剂开发的新领域 ,是化学除草剂天然骨架的一个重要来源 ,因为
生物除草剂具有的专一性常常与寄主专化性毒素的产生密切相关 [1 ] ,但目前真正将植物病原
真菌毒素开发成为商品除草剂的仍很少 ,大部分只停留在对杂草的室内生物活性研究阶段。
Barash等报道葱叶枯病菌 Stemphyl ium botryosum在人工培养基上可以产生毒素 ,并定名为
匍柄霉素Ⅰ 、Ⅱ ( Stemphy loxinⅠ 、Ⅱ ) [2 ]。本研究发现葱叶枯病菌在改良 PS培养基上可以产
生 5种组分 ,在对这 5种组分分离的基础上对其除草生物活性做了初步研究 ,现将结果报道如
下。
1　材料和方法
1. 1　菌株与植物
葱叶枯病菌 Stemphyl ium botryosum菌株 (分别从河北、山东等地相应寄主的典型病斑上
经分离纯化得到的纯培养物 )。 葱 (高洁白 ) ;水稻 (玉丰 ) ;玉米 (冀丰 58) ;油菜 (上海青 ) ;白菜
(小杂 56) ;萝卜 (五缨红萝卜 ) ;黄瓜 (津研 4号 ) ; 马唐 Digitaria sanguinalis L. ; 稗草
Echinochloa crusgal li ;狗尾草 Setaria v iridis;狗牙根 Cynodon dactylon;反枝苋 Amaranthus
retrof lexus;藜 Chenopodium album;苍耳 Xanthium sibiricum;龙葵 Solanum nigrum ;荠菜
Capsella bursapastoris;播娘蒿 Descurainia sophia;苘麻 ( Silv erw eed)。
1. 2　药剂及试剂
50%乙草胺 ( acetochlor)乳油 (河北宣化农药厂 ) ; 20%百草枯 ( paraquat )水剂 (英国捷利
① * 通讯联系人
河北省科委 ( 96220304D)资助项目
康公司 ) ;硅胶 GF254 (青岛海洋化工厂 ) ;二氯甲烷、甲醇和乙醇 (北京化学试剂厂 ) ;乙酸乙酯和
丙酮 (保定化学试剂厂 )等均为分析纯。
1. 3　培养基
PSA V8葱汁培养基: 由马铃薯 200 g、蔗糖 20 g、琼酯 20 g、 V8 20 mL、老葱叶 50 g加水
1 000 mL配成 , p H= 7. 0。用于菌种的分离和扩繁。
改良 PS培养基:由马铃薯 200 g、蔗糖 20 g、 Fe3+ ( FeCl3· 6H2O) 2 mg、谷氨酸 9 g、丁二酸
0. 017 mo l /L、V8 20 mL加水 1 000 m L配成 , p H= 7. 0。用于毒素的产生。
1. 4　葱叶枯病菌的培养与毒素的分离
打取 = 0. 5 cm的葱叶枯病菌菌片 ,分别定量接种于盛有 200 mL改良 PS培养基的三
角瓶中 ,每瓶接种 6片 ,在 25℃转速为 100 r /min条件下振荡培养 21 d后 ,过滤得到培养滤
液 ,煮沸 10 min之后进行提取 ,其方法参照 Barash等 [3 ]的方法并加以改进 (见图 1所示 )。 毒
素提取的每一步都要进行植物毒性跟踪试验。
Fig. 1　 Isolation of to xin from Stemphy lium botryosum
1. 5　葱叶枯病菌毒素的 HPLC纯化和各组分的紫外吸收测定
将粗毒素和经 TLC分离得到的各组分进行 HPLC分析。 HPLC为日本岛津 LC-6A, SPD-
6AV紫外检测器。 色谱条件为: 色谱柱 DB( ODS) C18 -150 mm× 4. 6 mm,紫外检测波长为
254 nm;流动相为甲醇 (优级纯 )∶水= 80∶ 20(V /V ) ; CR-3A数据处理仪 (日本岛津 )。将纯化
后的各组分分别用紫外分光光度计 (日本日立公司 u-2000 Spect ropho tometer )进行扫描从而
测出最大紫外吸收峰。 参比液: 乙醇 ;比色皿: 1 cm厚石英比色皿。
1. 6　粗毒素及各组分的定量分析——差重法 [4 ]
取洁净的表面皿 ,用分析天平称重后编号。分别取粗毒素及各组分 0. 5、 1、 2、 4、 8 mL溶液
于表面皿中 ,在无尘条件下待溶剂挥发干后再称重 ,每个处理重复 3次 ,并以相应的定容溶剂
作对照 ,通过计算差值来测定其浓度 ,进而求出各组分在粗毒素中的质量分数。
61第 2期 张金林等:葱叶枯病菌 Stemphy lium botryosum毒素的分离与除草活性研究
1. 7　葱叶枯病菌毒素的生物活性测定
毒素致病活性测定采用定量针刺接种法 [ 5, 6] ;毒素对种子萌发抑制作用测定采用土壤滴浇
法 [7 ] ;毒素对植物根、茎生长抑制的毒力测定采用小杯法和稗草胚轴法 [8 ]。
马唐、黄瓜对毒素主要吸收部位的测定 [9 ]方法是 ,在塑料小杯中放入 90 g风干砂土 ,分别
播种刚萌动的马唐和黄瓜种子 ,再覆盖 10 g砂土 ,并在种子层的上下分别形成两个毒土层 ,毒
土层中各药剂的浓度均为 50 mg /kg。在种子层和毒土层之间是活性炭层 (防止药剂上下移动 )
并保持土壤的含水量为 20% ,置于 28℃恒温光照条件下培养 5 d后 ,测量主根长度、幼芽高度
并以清水作对照 ,每个处理重复 3次 ,从而判断出植物对该毒素的主要吸收部位。
毒素对植物茎叶生长抑制作用的测定采用温室盆栽法:将供试的植物种子催芽后 ,播种于
小花盆中 ,每盆播种 25粒 ,待幼苗长至 2～ 3叶期 ,分别进行叶面喷雾处理 ,各处理浓度均为有
效含量 450 g /hm2 (有效含量测定法同 1. 6) ,每个处理重复 3次。并以清水作对照 ,在温室条件
下培养 3～ 4 d后观察其药害症状。测量地上部分鲜重 ,并按下列公式计算防效:
防效 (% )= 对照组鲜重 (g ) - 处理组鲜重 ( g)对照组鲜重 (g ) × 100
1. 8　毒素对马唐叶绿素含量影响测定 [10 ]
待马唐幼苗长至 3～ 4叶期时 ,用供试药剂分别进行叶面喷雾处理 ,每个处理重复 3次 ,并
以清水作对照 ,用药量均为有效含量 450 g /hm2 ,在温室条件下培养 3 d后 ,剪取地上部分茎
叶 ,称取 0. 1 g,加入少量石英砂及 0. 5 mL丙酮研成匀浆 ,再加 80%丙酮 10 m L继续研磨至
组织变为白色 ,过滤后用 80%丙酮定容至 50 mL。然后把叶绿素提取液倒入光径 1 cm的比色
杯内 ,以 80%丙酮作参比液 ,用 752型分光光度计 (上海分析仪器总厂 )在 663 nm、 645 nm下
测定吸光度 ( A ) ,并计算叶绿素含量。
叶绿素 a含量 ( mg /g ) = ( 12. 71A663- 3. 59A645 )· V ÷ 1000÷ W
叶绿素 b含量 ( mg /g ) = ( 22. 88A645 - 4. 67A663 )· V ÷ 1000÷ W
叶绿素总量 ( mg /g )= ( 8. 04A663+ 20. 29A45 )· V÷ 1000÷ W
式中 V:提取液体积 ( mL) ;W:材料鲜重 ( g )
2　结果与分析
2. 1　葱叶枯病菌及其毒素对葱叶的致病活性
将葱叶枯病菌菌片及其毒素针刺接种于高洁白 4叶龄葱叶上 , 3 d后在接种点周围出现水
浸状萎蔫斑 ,病斑周围带有深紫色晕圈 ,最后形成黑色病斑 ,可见分离到的病原菌可以引起葱
叶枯病。而将病菌和毒素针刺接种于幼龄葱叶上则不发病。
2. 2　葱叶枯病菌毒素的 HPLC分析
培养滤液经萃取、浓缩后得到粗毒素 ,粗毒素经 TLC分离后得到 5种组分 ,即Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、
Ⅳ、Ⅴ , Rf值分别为 0. 31、 0. 47、 0. 74、 0. 80和 0. 90,粗毒素进一步经 HPLC分析得到的仍是
5种组分 (见图 2) ,其保留时间分别为 0. 80、 2. 22、 5. 44、 9. 68、 16. 83 min。 对 TLC分离得到的
5个组分分别进行 HPLC分析可知 ,组分Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ、Ⅴ的保留时间分别为 0. 79、 2. 22、 5. 47、
9. 65、 16. 82 min。至此葱叶枯病菌毒素的 5种组分已全部分离纯化。
62 农　药　学　学　报 2000年
Fig. 2　 HPLC seperation chart of tox in
f rom Stemphyl ium botryosum
2. 3　葱叶枯病菌毒素各组分的最大紫外
吸收
　　将葱叶枯病菌毒素的 5个组分分别
经紫外分光光度计扫描后 ,组分Ⅰ 、Ⅱ 、
Ⅲ 、Ⅳ、Ⅴ在乙醇中的最大紫外吸收分别
为 240、 247、 223、 236和 258 nm。组分Ⅳ和
Ⅴ在乙醇中的最大紫外吸收峰与文献 [3 ]
报道基本一致。
2. 4　粗毒素及各组分的定量分析
结果表明 ,差重法可以用于该毒素
及各组分的定量分析。 R f= 0. 80组分 ,
0. 5、 1、 2、 4、 8 mL的平均差重依次为:
3. 3 301、 6. 4012、 12. 9006、 2 5. 6611和
51. 0010 mg ,差重与容量之间的回归方程
为: y= 0. 1329+ 6. 3629x ,相关系数 r= 0. 9998。由此可见 ,差重法可以用于该毒素及各组分
的定量分析。 Rf值分别为 0. 31、 0. 47、 0. 74、 0. 80、 0. 90的 5个组分在粗毒素中所占的百分含
量依次为: 17. 2% 、 22. 9%、 25. 8%、 22. 3% 、 11. 5%。
2. 5　葱叶枯病菌毒素的生物测定
表 1为毒素对 2种农作物、 5种蔬
菜和 10种农田杂草的生物活性测定
结果。可以看出 ,葱叶枯病菌毒素对葱
种子萌发抑制率为 44% ,而对供试的
2种农作物和 4种蔬菜的种子萌发抑
制作用很小 ,只对黄瓜种子萌发有一
定的抑制作用 ,抑制率为 27. 1% 。试验
发现 ,毒素对马唐、稗草、狗牙根等禾
本科杂草的种子萌发抑制作用明显高
于对反枝苋等阔叶杂草 ,尤其以对马
唐的抑制作用最强 ,达 100%。 乙草胺
5 mg /L和 2. 5 mg /L对马唐种子萌发
抑制率分别为 100%和 72% ;对反枝
苋的抑制率分别为 72%和 68%。由此
可见 ,该毒素有可能成为水稻、玉米、
油菜、白菜、萝卜田中防除禾本科杂草
的选择性土壤处理剂。
小杯法测定结果表明 ,浓度为
200 mg /L的粗毒素及各组分对玉米、
Table 1　 The inhibi to ry ef fect of the crude to xin
on the germina tion o f g ramineous plant seed
Plant
Per ge rminating (% )
CK Tox in
Inhibito ry
r ate(% )
Rice 93 92 1. 1
Onion 75 42* 44. 0
Co rn 89 86 2. 2
Bird rape 96 97 - 1. 0
Chinese cabbage 95 90 5. 3
Radish 93 93 0
Cucumber 85 62* 27. 1
Digitaria Sanguinalis 96 0* 100
Echinochloa crusgaui 78 41* 47. 4
Setaria v iridis 84 15* 98. 2
Cynodon dacty lon 75 26* 65. 3
Amaranthus retrof lexus 97 98 - 1. 0
Chenopodium album 62 54* 12. 9
Xanthium sibiricum 74 58* 21. 6
Solanum nigrum 56 34* 39. 3
Capsella bursa pastoris 79 71 8. 8
Descurainie sophia 85 73* 14. 1
　　 No te: * Significant differ ence between tox in tr eatment and
CK( p= 0. 01)
水稻无明显抑制作用 ;对油菜、白菜抑制作用轻微 ,对根长和茎长的生长抑制率在 10%以下 ;
对黄瓜生长抑制率在 30% ～ 34%之间。 R f值为 0. 30和 0. 90的两个组分在 100 mg /L浓度下
63第 2期 张金林等:葱叶枯病菌 Stemphy lium botryosum毒素的分离与除草活性研究
对马唐和狗尾草抑制作用不明显 ,而其它 3个组分对马唐和狗尾草生长抑制作用明显 (见表
2) ,粗毒素及各组分对马唐的毒力高于狗尾草 ,对茎生长的抑制作用高于根。 在所测试的各个
组分中Ⅳ的生物活性最高 ,对马唐茎和根的 IC50值分别为 4. 9891和 24. 0725 mg /L,但均低于
乙草胺的毒力。组分Ⅳ对稗草胚轴抑制作用毒力回归方程为 y= 1. 9709+ 0. 6627x , IC50值为
4. 5759 mg /L,而乙草胺对稗草胚轴抑制作用毒力回归方程为 y= 4. 7326+ 0. 8077x , IC50值为
0. 3311 mg /L。
Table 2　 The inhibi to ry effect o f the tox in on the g row th of
Digitaria sanguinalis and Setaria v iridis
T rea tments Plants O rgans Reg r ession equation r IC50 /mg· L- 1
Crude tox in Digitaria sanguinalis Roo t y= 3. 6527+ 0. 7880x 0. 9725 51. 0549
Stem y= 2. 5628+ 1. 5709x 0. 9538 35. 6014
Setaria v iridis Roo t y= 2. 1206+ 1. 5883x 0. 9716 64. 9952
Stem y= 2. 9518+ 1. 2736x 0. 9815 40. 5692
FractionⅣ Digitaria sanguinalis Roo t y= 3. 4509+ 1. 1213x 0. 9563 24. 0725
Stem y= 4. 5592+ 0. 6315x 0. 9824 4. 9891
Setaria v iridis Roo t y= 2. 6299+ 1. 7955x 0. 9523 20. 8940
Stem y= 4. 0000+ 1. 1111x 0. 9816 7. 9434
FractionⅢ Digitaria sanguinalis Roo t y= 4. 1018+ 0. 3755x 0. 9427 246. 6099
Stem y= 3. 0915+ 1. 0617x 0. 9753 10. 8308
Setaria v iridis Roo t y= 2. 6000+ 1. 7647x 0. 9721 22. 9089
Stem y= 3. 4400+ 1. 3448x 0. 9625 14. 4552
FractionⅡ Digitaria sanguinalis Roo t y= 2. 7014+ 1. 9208x 0. 9615 15. 7285
Stem y= 3. 1709+ 1. 9112x 0. 9723 9. 0582
Setaria v iridis Roo t y= 3. 4300+ 1. 3083x 0. 9518 15. 8500
Stem y= 3. 2100+ 1. 3984x 0. 9617 19. 0561
Ace to chlo r Digitaria sanguinalis Roo t y= 4. 3501+ 0. 7112x 0. 9653 8. 1998
Stem y= 5. 1216+ 0. 6031x 0. 9758 0. 6286
Setaria v iridis Roo t y= 3. 1543+ 1. 7339x 0. 9564 11. 6005
Stem y= 2. 8316+ 3. 9855x 0. 9725 3. 5000
从马唐、黄瓜对葱叶枯病菌毒素吸收部位的测定结果可以看出 ,它们对该毒素及组分Ⅳ的
吸收部位不同 ,禾本科杂草—— 马唐以胚芽鞘为主 ,双子叶植物—— 黄瓜以胚根和下胚轴为
主。药剂下处理对马唐的生长影响和对照相比相差很小 ,平均根长分别为 3. 5、 3. 7 cm,平均株
高分别为 8. 5、 8. 7 cm;药剂上处理则对马唐的生长影响较大 ,药剂处理的平均株高为 2. 6 cm ,
而对照为 8. 9 cm,平均根长分别为 1. 5 cm和 3. 9 cm,经方差分析差异显著。药剂下处理对黄
瓜根的生长有明显的抑制作用 ,药剂处理的平均根长为 0. 5 cm ,而对照平均根长为 6. 3 cm,其
差异显著 ;药剂上处理对黄瓜根长的影响和对照相比相差不显著 ,分别为 6. 3、 5. 9 cm。粗毒素
对黄瓜茎的生长和对照相比影响不显著 ,平均茎长分别为 10. 2、 11. 5 cm ,而组分Ⅳ则影响较
大 ,其平均茎长仅为 7. 6 cm,差异显著。
表 3结果表明 ,粗毒素对供试的水稻、玉米、油菜、萝卜等 4种作物无药害 ,对黄瓜有轻微
的药害 ;对阔叶杂草反枝苋、苘麻、龙葵有轻微的抑制作用 ;对马唐、稗草、狗尾草有较强的抑制
64 农　药　学　学　报 2000年
作用 ,能够在 30 h以内使叶片发生干枯 ,而百草枯使马唐叶片发生干枯的时间为 8 h。
温室盆栽试验结果表明 (见图 3) ,粗毒素及各组分对马唐的生长均有不同程度的抑制作
用 ,在供试药剂中百草枯的防效最高 ,鲜重减退率为 84. 51% ;粗毒素以及组分Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ、Ⅳ、
Ⅴ的防效分别为 82. 88%、 15. 65% 、 25. 90%、 45. 90%、 53. 24% 、 52. 32% ,而乙草胺的防效仅
为 11. 47% 。由此可以看出 ,粗毒素的防效与百草枯相近。
Table 3　 The inhibi to ry ef fect o f the crude toxin
on the g row th of plants
Plants Concentr ation /mg· L- 1 Harmful time /h Ha rmful deg ree*
Rice 200 - No
Co rn 200 - No
Bird r ape 200 - No
Radish 200 - No
Cucumber 200 72 Ligh t
Digitaria sanguinalis 50 24 Heavy
Echinochloa crusgalli 50 30 Heavy
Setaria viridis 50 48 Heavy
Amaranthus retrof lexus 50 48 No
Silve rw eed 50 48 Ligh t
Solanum nigrum 50 48 Ligh t
　　 No te: * Eye tested
2. 6　葱叶枯病菌毒素对马唐叶绿素含量的影响
经计算可知 ,粗毒素及各组分对马唐叶绿素 a、 b及总含量有一定的影响。各药剂处理对马
唐叶绿素 a的影响差异不大 ,以百草枯处理降低最多 ,为 43. 8% ;对叶绿素 b的含量影响则较
大 ,粗毒素使叶绿素 b含量降低率与百草枯相差不大 ,分别为 83. 8%和 84. 7% ,在所测试的
3个组分中 ,以组分Ⅳ处理降低最多 ,为 81. 9% ;从对叶绿素总量的影响来看 ,粗毒素和组分Ⅳ
很接近 ,分别为 60. 0%和 59. 7% ,但都低于百草枯。
Fig . 3　 The inhibi tory effect
of toxin on g row th of
Digitaria sanguinal is
A: paraquat　 B: acetochlor　 C: crud e toxin
3　讨论
目前人们对新农药的开发途径提出了种种设想 ,
认为 21世纪农药的开发应具备高活性、高选择性、高
安全性等特点。天然农药可能代表了未来农药的发展
方向之一 ,因为从某种意义上讲 ,自然界是农药的最
好设计师 ,各种生物在长期的进化过程中 ,为了自身
的生存和发展 ,彼此间形成了一种相生相克的关系。
长期以来 ,人们一直在致力于发现和探索这些相克物
质 ,现已发现的这些物质包括杀菌剂 (春雷霉素、井冈
霉素等 )、杀虫剂 (阿维菌素、除虫菊酯等 )、杀鼠剂 (双
香豆素 )、生长调节剂 (芸苔素内酯等 )、除草剂 (双胺
磷 )。
65第 2期 张金林等:葱叶枯病菌 Stemphy lium botryosum毒素的分离与除草活性研究
尽管国外对葱叶枯病菌毒素的纯化和化学结构进行了研究 ,但有关该毒素的除草活性至
今未见报道。 本试验研究发现 ,葱叶枯病菌毒素对马唐、狗尾草、稗草、狗牙根等禾本科 1年生
或多年生杂草种子的萌发和幼苗生长有较强的抑制作用 ;对反枝苋、苍耳、龙葵、荠菜、播娘蒿、
苘麻等阔叶杂草则抑制作用较差 ;对水稻、玉米、油菜、白菜、萝卜等作物的生长具有安全性。温
室盆栽试验表明 ,在相同浓度下葱叶枯病菌毒素对马唐幼苗生长的防效虽不及百草枯 ,但明显
比乙草胺高 ,且对禾本科杂草种子萌发具很强的抑制作用。这说明该毒素有可能被开发成为除
草剂。
参　考　文　献
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The Study on the Isolation and Weed-controlling
Activity of Pathotoxin Produced by Stemphylium botryosum
Zhang Jinlin　 Dong Jin’ gao　 Fan Muzhen*　 Li Chuan
( Myco to xin Lab. , Ag ricultural Univ ersity of Heibei, Baoding　 071001)
Abstract　 Stemphylium botryosum could produce patho to xin in v itro. Fiv e frac tions (Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ 、Ⅳ、Ⅴ ) had
been obtained by TLC and HPLC chromato g raph y, their Rf -values were 0. 31, 0. 47, 0. 74, 0. 80 and 0. 90,
and their max . ultrav io let abso rption w ere 240, 247, 223, 236 and 258 nm , respectiv ely. Thr ee f ractions (Ⅱ 、
Ⅲ 、Ⅳ ) strongly inhibited the g row th o f Digitaria sanguinalis, among them the fractionⅣ had the highest
activity . The inhibito ry effect of c rude to xin on the germination of g ramineous w eed seeds was much higher
than that o f th e bro ad-lea f w eeds. This to xin has lit tle influence on the seeds o f maize , rice, rape and Chinese
cabbage. The r esults of the g r eenhouse po t experiment indicated that th e defensiv e effect of the crude tox in
onDigitaria sanguinalis w as the highest, equal to the effec t o f par aguar. Mo reover th e to xin could a ffect the
content o f Chlo rophyll in Digitaria sanguinalis; and especially the content of Chlor ophyll-b.
Key words　 Stemphylium botryosum ; To xin; Isolation; Weed-contro lling activity
66 农　药　学　学　报 2000年