全 文 ：基因组学与应用生物学，2009年，第 28卷，第 5期，第 998-1001页
Genomics and Applied Biology, 2009, Vol.28, No.5, 998-1001
实验技术与方法
Techniques and Methodology
沙葱叶基愈伤组织原生质体再生体系的建立
郝建国 贾敬芬 *
陕西省生物技术重点实验室,西北大学生命科学学院,西安, 710069
*通讯作者, Jiajf38@nwu.edu.cn
摘 要 沙葱是一种具有抗旱抗寒、抗病性和适应性强等生理特性的荒漠植物。为开发利用其固有的遗传
资源，本研究利用细胞工程技术建立了沙葱(Allium mongolicum Regel)叶基愈伤组织原生质体的分离、培养
和植株再生实验体系。研究结果表明，酶法分离原生质体的产率和分裂频率明显取决于用于制备原生质体的愈
伤组织的状态。转代培养 7~10 d的松软愈伤组织可分离出大量有活性的。在附加 2.0 mg/L 2,4-D、0.2 mg/L激
动素、500 mg/L水解乳蛋白、0.4 mol/L甘露醇和 2%蔗糖的MS培养基中进行液体浅层培养，4~5 d后出现第
一次原生质体分裂；7~10 d出现第二次分裂。结果显示原生质体的分裂频率大约为 5%；4周后，可见到小愈
伤组织。当将原生质体分裂形成的愈伤组织转移到附加 2.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤(或激动素)和 0.4 mg/L萘乙酸
(NAA)的MS固体培养基上，并在低光照条件下培养后，从愈伤组织上分化出了不定芽，进而发展成小植株，并
移栽成活。本研究对沙葱抗逆遗传品质用于经济植物遗传改良的研究奠定了可行的实验基础。
关键词 沙葱, 原生质体, 愈伤组织, 植株再生
Establisment of Plant Regeneration System from Protoplasts of Leaf Base-
Derived Calli in Allium mongolicum Regel
Hao Jianguo Jia Jingfen *
Shaanxi Provincial Key Laboratory of Biotechnology, College of Life Sciences, Northwest University, Xian, 710069
* Corresponding author, jiajf38@nwu.edu.cn
DOI: 10.3969/gab.028.000998
Abstract Allium mo ngolicum Regel is a kind of desert plant which contains physiolgical characteritics of
drought-resistence, cold-resistence, disease stress-resistence and strong adaptability. In order to develop and utilize
these inherent genetic resources, in this research, we established an experimental system for leafbase-derived calli of
Allium mongolicum Regel from the isolation of protoplasts, cultivation and plant regeneration by cell engineering
techniques. The result showed that the rate of production and their frequency of protoplasts division were strongly
dependent on the state of the calli which were isolated by enzymatic method. A large amount of activated protoplasts
could be isolated from 7 to 10 day-old friable calli after transferring to the fresh subculture medium. And first divi-
sions of protoplasts appeared after 4 to 5 days of cultivation in liquid MS medium supplemented with 2.0 mg/L
2,4-D, 0.2 mg/L kinetin, 500 mg/L lactalbumin hydrolysate, 0.4 mol/L mannitol and 2% sucrose. The second divi-
sions were followed after 7 to 10 days in cultivation. The result still displayed that frequency of protoplast divi-
sion was about 5%. Four weeks later, we could observe some small calli. When the protoplast-derived calli were
transferred into the MS solid medium added with 2.0 mg/L benzylamino-purine (or kinetin) and 0.4 mg/L naphthale-
neacetic acid and cultivated in the codition of low illumination, after which the adventitious shoots were induced,
then we could obtain numerous plantlets and could transplant them survival to pots in the greenhouse. This research
would establish a feasible experiment foundation for studying the stress resistance heredity characters of Allium
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基金项目：本研究由国家自然科学基金(30671082)和陕西省重点实验室科研项目(08JZ71)共同资助
mongolicum Regel utilizing in genetic improvement of economic plants.
Keywords Allium mongolicum Regel, Protoplasts, Callus formation, Plant regeneration
沙葱(Allium mongolium Regel)又名蒙古韭，是一
种百合科多年生草本植物，茎叶针状，开白色小花，
是沙漠草甸植物的伴生植物，广泛分布于我国西北
和内蒙干旱荒漠地带。其营养丰富，可作为蔬菜食
用，并有药用价值(张美莉和高聚林, 1997; 马筑泉,
1994)。该种植物耐旱、耐低温，抗病性强。这些种质
特征对于用生物技术方法改良葱属(Allium)其它种
植物具有开发应用价值。沙葱的叶基切段外植体能
够在附加 2 mg/L 2,4-D 和 0.2 mg/L KT 的 MS 培
养基上 100%的诱导出愈伤组织，这些愈伤组织转
移到附加 2 mg/L 6-BA 和 0. 4 mg/L NAA 的 MS
培养基后，能以高达 88%的频率分化出再生苗(陈
刚等, 2003)。曾有报道葱属植物洋葱(A. Cepa) (王光
远等, 1986)、韭(A. ampeloprasum) (Buiteveld and Cree-
mers-Molenaar, 1994)和葱 (A. fistulosum) (Shimonaka
et al., 2001)原生质体培养再生植株的报道，但至今少
见沙葱原生质体培养方面的文章。由于原生质体培养
再生体系的建立是体细胞杂交和原生质体遗传转化
的必备条件，因而本研究建立原生质体再生体系对于
沙葱细胞遗传操作奠定了实验基础。
1 材料和方法
1.1供试植物材料及其处理
沙葱种子购自中国科学院宁夏沙坡头治沙站。
种子在 70% (V/V)酒精中浸 60 s，再用 0.1% HgCl2
(W/V)灭菌 12 min，然后用灭菌蒸馏水洗 5次，接种在
不加外源激素的 MS培养基 (Murashige and Skoog,
1962)上。在(25±20)℃，8 W/m光照条件下萌发。取 20
天取无菌苗叶基 1 cm部分，切成 3 mm大小的切段，
接种在附加 2.0 mg/L 2,4-D，0.2 mg/L KT(激动素)，
500 mg/L LH (水解乳蛋白)和 3%蔗糖的 MS培养基
(pH 5.8~6.2)上，在(25±2)℃条件下进行暗培养。诱导
出的愈伤组织在同样培养基上每 2周转代一次，用
于制备原生质体。
1.2 原生质体的分离、收集和纯化
取转代 7~10 d的愈伤组织 1.5 g左右，放入含
10 mL酶液的三角瓶中。在 20℃、黑暗条件下静置酶
解 16 h。酶液组成为 1.5% (W/V)纤维素酶(Onozuka
R-10)、0.4 mol/L 甘露醇和 2-N- 吗啉乙烷磺酸
(MES)。用 NaOH将 pH调至 6.0~6.2。用 0.2 μm孔径
滤膜过滤灭菌。37℃保温 1 h之后，原生质体酶解液
在 70 r/min下振荡 30 min，然后用 74 μm的不锈钢
筛过滤。滤液在 800 r/min下离心 10 min，使原生质
体沉淀，然后用 0.16 mol/L CaCl2 (pH 6.0)离心洗涤。
将沉淀的原生质体悬浮在 18% (W/V)蔗糖溶液中，
800 r/min再次室温离心 10 min，用无菌 10 mL注射
器从表面收集纯净的原生质体聚集层，用0.16 mol/L
CaCl2悬浮离心洗涤一次，再用培养基洗涤一次。原
生质体的活力用 0.1% (W/V)酚藏花红(溶于 0.4 mol/L
甘露醇中)染色(Widholm, 1972)。
1.3原生质体培养
将纯化的原生质体悬浮在附加 2.0 mg/L 2,4-D、
0.2 mg/L KT、0.4 mol/L甘露醇、2%蔗糖和 500 mg/L
LH的MS培养基(pH 6.0~6.2)中。用培养基调整原生
质体密度为 5×104~5×105个 /mL，放在直径 60 mm培
养皿中，每皿放 2 mL。培养皿用 Parafilm封口，在
(25±2)℃下静置 90 min，进行暗培养，每天轻轻摇动
2次(张改娜和贾敬芬, 2009)。
1.4愈伤组织形成及植株再生
原生质体再生新壁并分裂形成小细胞团后，每
周向每个培养皿添加甘露醇浓度降至 0.2 mol/L。上
述原生质体培养基 1 mL，以降低培养基的渗透压。
待小愈伤组织形成后，将培养物转移到不加甘露
醇，并用 0.4%琼脂糖固化的上述培养基上,并放在
暗光下使其增殖。当愈伤组织长大后，转移到附加
1~2 mg/L 6-BA、0.2~0.4 mg/L NAA的 MS固体培养
基上，放在 2 000 Lx光照下，每日光照 12 h。待分化
苗长至 2 cm以上时，从愈伤组织上取下，移至附加有
0.5mg/L IBA (或NAA)的 1/2MS培养基上诱导生根。
以上实验均重复 5次以上。
2结果与分析
2.1原生质体分离、培养
实验表明，酶法分离原生质体的产率主要取决
于用于制备原生质体所用的愈伤组织的状态。只有
在继代培养变得松软的叶基愈伤组织，并在新转代
培养 7~10 d时取材，才能酶解出大量的原生质体。这
类愈伤组织细胞近乎等径，并处于旺盛增殖期。经比
沙葱叶基愈伤组织原生质体再生体系的建立
Establisment of Plant Regeneration System from Protoplasts of Leaf Base-DerivedCalli in Allium mongolicum 999
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
较试验，所配制的酶液组成对沙葱愈伤组织原生质
体游离是适宜的。原生质体产率大约为 1.0×106/g鲜
重。经酚藏花红溶液染色检查，原生质体活力在 90%
以上(图 1A)。用附加 2,4-D和 KT的MS液体培养基
补加 500 mg/L LH，可以有效地启动原生质体分裂。
培养 2 d后，大部分原生质体体积增大。培养的 4~5 d
出现第一次分裂 (图 1B)。10 d左右看到 3~4次分裂
(图 1C)。根据培养 7~10 d时的统计，原生质体的分裂
频率大约为 5%。原生质体形成小细胞团后适当降低
培养液的渗透压，可促进大细胞团的形成，在培养 5~6
周后，可见到由 50~100个细胞组成的大细胞团 (图
1D)。能发展成小愈伤组织的原生质体大约为 2%。
2.2愈伤组织的形成和植株再生
为了诱导愈伤组织分化，将原生质体分裂形成的
愈伤组织培养在附加不同生长素(NAA, IBA)和细胞
分裂素(6-BA或 KT)的MS培养基上培养。实验结果
表明，只有在附加 2.0 mg/L 6-BA (或 KT)和 0.4 mg/L
NAA的MS培养基上出现了芽的分化。在低光照强
度下培养后，原生质体形成愈伤组织，并呈现浅绿色
(图 2A)。在光照条件下，转移后培养 3周的愈伤组织
表面出现芽点和绿芽(图 2B)。芽形成的频率在 80%以
上。本实验所获原生质体再生苗多为丛生状态，在一
块愈伤组织上可分化出多个苗。分化出的苗不经转
移很难生根。但将苗从愈伤组织上取下转移到附加
IBA的 1/2 MS培养基上后，3周内即可见到苗基产
生出大量根，生根率在 80%以上。若用 NAA代替
IBA，也能诱导生根，但生根率要低得多。原生质体
再生植株形成发达的根系后，比较容易移栽成活，
经炼苗后，将苗移至花盆土中能正常生长(图 2C)，
未发现明显的形态变异。
3讨论
从文献报道中看到，葱属(Allium)植物研究所
用的原生质体起始材料因种而异。有的来自叶内细
胞，如洋葱(A. Cepa) (王光远等, 1986)，但多采用悬浮
培养细胞分离原生质体，如洋葱(Hansen et al., 1995;
KarimandAdach, 1997)和韭葱(Allium ampeloprasumL.)
(Buiteveld and Creemers-Molenaar, 1994)等。在我们的
实验中，曾从沙葱幼叶分离出大量有活力的原生质
体，经培养也能存活达 2个月，但从未见到正常持续
分裂。只有叶基部分诱导的愈伤组织，分离的原生质
体才具有持续分裂和再生潜力。这可能是由于所取阶
段的愈伤组织细胞处于分生状态，具有脱分化细胞的
特征，这些特征和悬浮培养细胞有相似之处。由这类
细胞分离的原生质体容易启动分裂，但用愈伤组织作
材料，取材要方便的多。
值得提及的是，原生质体产生的愈伤组织分化芽
的能力与制备原生质体所用的愈伤组织继代培养时
间密切相关。长期继代培养的愈伤组织，尽管也可分
离出大量有活力而且能持续分裂的原生质体，但随后
形成的愈伤组织是很难诱导分化的。本研究能再生植
株的原生质体曾用继代培养在 6个月以内的愈伤组
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沙葱叶基愈伤组织原生质体再生体系的建立
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织制备的。继代培养时间太长，其本身的再生能力就
会大大下降，以至丧失。这是组织培养中普遍存在的
现象(Buiteveld and Creemers-Molenaar, 1994)。本研究
所建立的沙葱原生质体再生体系对于葱属植物，及其
它种的原生质体培养和遗传操作提供了可借鉴的实
验资料，并对葱属植物与这种荒漠植物之间的体细胞
杂交奠定了实验基础。
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