全 文 ：文章编号:1001-4829(2010)01-0103-04
　　收稿日期:2009-05-26
　　作者简介:赵　珊 ,女 ,研究生 ,从事花卉病害研究 , ＊为通讯作
者。
香石竹坏死斑点病毒的鉴定与检测
赵　珊 1 ,王继华 2＊ ,王丽花2 ,杨秀梅2
(1.云南省植物病理重点实验室 ,云南农业大学 ,云南昆明　 650201;2.云南省农业科学院农业部花卉产品质检中心 ,云南 昆明　
650205)
摘　要:调查表明云南省昆明市团结乡香石竹普遍发生病毒病。电镜负染检测采自团结乡香石竹病毒病病样 ,病叶汁液中观察到
弯曲长线型的病毒粒体 , 长度约 1000～ 1600nm,直径约 12nm。对这些病样的叶片进行间接ELISA检测 , 所有样品与香石竹坏死
斑点病毒抗血清都呈阳性反应。按照报道的长线形病毒属简并引物合成引物 ,采用 RT-PCR法对血清反应呈阳性的香石竹总
RNA扩增了 1059ntsHSP70基因部分编码序列 ,将其克隆到 pMD18-T载体上 ,并进行序列分析。根据测序结果设计引物建立 RT-
PCR扩增检测方法并测定其灵敏度。结果表明 ,使用简并引物和新设计的引物均能从 CNFV感病香石竹组织中扩增出与预期大
小一致的目标片段 ,而健康组织无此扩增产物。灵敏性测定结果表明该特异性引物 RT-PCR可从稀释 106植物总 RNA中检测出
病毒。
关键词:香石竹坏死斑点病毒;RT-PCR;特异引物;简并引物
中图分类号:S636.9　　　文献标识码:A
DetectionofCarnationnecroticfleckvirusbyRT-PCR
ZHAOShan1 , WANGJi-hua2＊ , WANGLi-hua2 , YANGXiu-mei2
(1.PhytopathlogyLaboratoryofYunnanProvince, YunnanAgriculturalUniversity, YunnanKunming650201, China;2.FlowerResearchIn-
stitute, YunnanAcademyofAgriculturalSciences, YunnanKunming650205, China)
Abstract:SurveyshowedthatCarnationoccurencewidespreadofvirusdiseaseinTuanjiecoutry, Kunmingcity.ThediseasesampleofCar-
nationshowingtheviralsymptomwasdetectedbyEMwiththenegativestainmethodandindirectantigen-coatedplate(ACP)-ELISAmeth-
ods.Thelonglinearvirusparticleswasobservedwith1000-1600nmlongand12nmindiameter.Thejuiceofthediseasesamplereacted
positivelytotheCarnationnecroticfleckvirus(CNFV)antiserumwithindirectantigen-coatedplate(ACP)-ELISA.Thepairofprimerswasde-
signedaccordingtodegenerateprimerofClosterovirusgroupamplifyingpartsequenceofHSP70 relatedgeneandRT-PCRwasconducted,
withthetotalRNArespectivelyfrompositiveandhealthleavestissueofCarnationastemplate, andthenthePCRproductionwasclonedand
sequenced.ThepositivesampleofCarnationwasdetectedbyRT-PCRwithpairofspecificprimersdesignedaccordingtothealreadyamplif-
yingsequence.TheresultshowedthatthespecificDNAbandofexpectedsizewereamplifiedfromthepositivediseasesamplewiththetwo
pairsofprimersbutnotfromthehealthone.Thevirusewasdetectedfromdilutionsof106 byRT-PCRwithspecificprimers.
Keywords:Carnationnecroticfleckvirus(CNFV);RT-PCR;Specificprimer;Degenerateprimer
　　香石竹(DianthuscaryophylusLinn)又名康乃
馨 ,为石竹科石竹属多年生草本植物 ,是当前世界上
最主要的切花品种之一。其生产面积和销售量居切
花品种之首 ,全球生产总面积已达 8700多 hm2 [ 1] 。
昆明是中国最大的香石竹生产地 , 香石竹产量占全
国总产量的 80 %以上 [ 2] 。 2008年 4月份 ,笔者在
昆明市团结乡调查发现 ,香石竹叶片呈现淡黄色坏
死斑驳和不规则的条斑及条纹 ,发病叶率 30 % ～ 50
%,一些严重的苗圃 ,发病叶率高达 90%以上 ,严重
影响了香石竹的产量与质量 ,给种植者带来了严重
的经济损失。为建立有效的防治方法并为病害流行
预测提供基础资料 ,笔者采集了部分香石竹典型病
样 ,采用电镜负染 、血清学技术 、分子生物学技术 3
种方法对病原物进行鉴定 ,以明确此病原物的分类
地位 ,并建立快速 、准确 、有效的检测方法。
1　材料与方法
1.1　试材
2008年 4月 ,从昆明市团结乡采集叶片具有典
103
2010年 23卷 1期
Vol.23　　No.1　　　　　　　　　　　　　　
西　南　农　业　学　报
SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences
型淡黄色坏死斑驳和不规则的条斑及条纹症状的香
石竹植株 10株。对发病症状进行描述和数码照相 。
部分样品保存于 -80 ℃备用。
1.2　病毒的电镜负染色法检测
对采集的 10个新鲜病样进行电镜负染观察 。
参照张仲凯等的方法进行 , 将制备好的样品置于
JEM100CX-I型透射电子显微镜上观察 、照相[ 3] 。
1.3　病毒的酶联免疫吸附法(EnzymeLinkedIm-
munosorbentAsay, ELISA)检测
根据病毒粒子形态大小 、特征 ,选择合适的抗体
进行 ELISA检测 。选择香石竹(康乃馨)坏死斑点
病毒诊断 试剂盒 CarnationNecroticFleckVirus
(CNFV)(Agdia),具体方法参照试剂盒说明书。
1.4　总 RNA提取
选取 ELISA检测结果呈阳性的样品提取总
RNA,采用 LiCl沉淀法 [ 4] ,提取的总 RNA保存于 -
80 ℃或进行 RT-PCR扩增。
1.5　RT-PCR扩增和克隆测序
1.5.1　引物设计与合成　根据 AlexanderV.等报
道的长线形病毒属(Closterovirus)病毒的简并引物合
成 , 上游引物 (5 GTGATGGTNGTNTTYGGNTTN-
GAYTTYGGNA3 ),下游引物(5 CARCARMCCKG-
GYARGTAMGARSWYCCACCSA3 ), M =AorC;
R=AorG;W =AorT;Y=CorT;N=any
base[ 5] 。该 引物可 以扩增 到 Closterovirus属的
HSP70相关基因的部分编码序列 ,目的片段大小约
1 kb。
1.5.2　反应体系　取总核酸 12.5 μl,后引物 1 μl
(20mol/L), 70℃变性 10min, 冰浴 5 min,再加 5
×RT缓冲液 4 μl, dNTP1μl(10mmol/L), RNase1
μl, RNasin0.5 μl, 42 ℃反应 1 h。取 cDNA5 μl,
H2O36.5 μl, dNTP1μl, 10 ×PCR缓冲液 5 μl,上
下游引物各 1 μl(50pmol/μl), rTaqDNA聚合酶 0.
5 μl,反应总体积为 50 μl。进行如下程序:94 ℃变
性 2 min;94 ℃ 30 s,退火温度 37 ℃ 30 s, 72 ℃ 2
min, 2个循环;94 ℃ 30 s,退火温度 50 ℃ 30 s, 72
℃ 2 min, 30个循环;72℃延伸 10 min。
1.5.3　克隆 、测序和序列分析　PCR产物经 1 %
(w/v)琼脂糖凝胶电泳分离后切下预期大小条带 ,
通过 NIQ-10柱式 DNA胶试剂盒(上海生工)回收
目的片段 ,纯化产物直接插入 pMD18-T载体(TaKa-
Ra),具体方法参照厂家说明。自动测序由上海生
工生物工程有限公司完成 。序列分析采用 DNA-
MAN软件和 BLASTN程序 。
1.6　RT-PCR检测及灵敏度测定
1.6.1　引物设计与合成　特异引物根据以上简并
引物扩增的 RT-PCR产物克隆测序结果(序列注册
编号为 EU884443 )使用 BioXM2[ 1]引物合成软件
设计 。上游引物(5AAGGTATCATCGGCAGACAG3
),下游引物 (5GAAGAATCTCGTGAAGTGGC3),
目的片段大小为 472 bp。
1.6.2　反应体系 　取总核酸 2 μl,随机引物 0.5
μl(20 mol/L), ddH2O8 μl, 70 ℃变性 10 min, 冰
浴 5 min,再加 RNase1 μl, 5 ×RT缓冲液 4 μl,
dNTP4μl, RNasin0.5 μl, 42℃反应 1h。取 cDNA
5μl, H2O36.5μl, dNTP1 μl, 10 ×PCR缓冲液 5
μl,上下游引物各 1 μl(50 pmol/μl), TaqDNA聚合
酶 0.5 μl,反应总体积为 50 μl。进行如下程序:94
℃变性 5 min;94 ℃ 30 s,退火温度 60 ℃1 min, 72
℃1 min, 35个循环;72℃延伸 10 min。
1.6.3　灵敏度测定　将 ELISA检测阳性香石竹样
品组织总 RNA以 10倍梯度分别稀释成 10、 102、
10
3 、104 、105、 106 、107倍不同浓度进行 RT-PCR扩
增 ,引物及反应程序同上 。
2　结果与分析
2.1　危害症状
受病毒侵染的香石竹植株呈现淡黄色坏死斑驳
和不规则的条斑及条纹(图 1A)。
2.2　病毒粒子形态
病组织粗汁液经负染色后电镜观察到弯曲长线
形病毒粒子(图 1B),长 1000 ～ 1600 nm,直径约 12
nm,根据粒子形态初步推测为 Closterovirus病毒。
2.3　ACP-ELISA检测
对电镜检测具有弯曲长线形病毒粒子的植株 ,
采用香石竹 (康乃馨)坏死斑点病毒诊断试剂盒
CarnationNecroticFleckVirus(CNFV)(Agdia)进行
ACP-ELISA检测 ,结果表明所有样品都呈阳性。
2.4　RT-PCR扩增及克隆测序
ELISA检测阳性样品 RT-PCR扩增可以得到一
条特异性条带 ,而健康植株扩增则没有条带 (图
A:CNFV侵染香石竹症状;B:病毒粒子负染色照片
A:SymptomsofCNFVinfectedleaf;B:Thepictureoftheviralpar-
ticleswithnegativestaining
图 1　症状及病毒粒体电镜照片
Fig.1　Symptomsandthepictureoftheviralparticleswithnegative
staining
104 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷
M:100bp分子量标准;1:RT-PCR扩增产物;2:健康对照
M:100bpMarker;1:TheproductsofRT-PCR;2:Healthycontrol
图 2　特异性 RT-PCR检测
Fig.2　RT-PCRspecificdetection
2)。经克隆测序 ,该产物片段大小为 1059nt(序列
注册编号为 EU884443), Blast比对发现其核苷酸序
列与 Closterovirus属薄荷病毒 Mintvirus1(MV1)
(序列注册编号为 AY903481)和甜菜黄化病毒 Beet
yelowsvirus(BYV)(序列注册编号为 X73475)的
HSP70氨基酸序列的相似性分别为 57.44 %和
51.27 %左右 。由此说明该病毒为 Closterovirus属 。
2.5　RT-PCR检测及灵敏度
2.5.1　RT-PCR检测 　使用设计的引物能从
ELISA检测阳性香石竹病株中扩增出单一的目的片
段 ,扩增产物为 470 bp左右 ,与预期目的带大小一
致 ,而健康对照则扩增不出条带(图 3)。
2.5.2　RT-PCR扩增灵敏度 　对感病香石竹提取
总 RNA,分别稀释为 10 ～ 10-7后 ,检测特异性引物
的 RT-PCR灵敏度 。结果表明 ,可从稀释至 10-6的
总 RNA中扩增出约 400 bp的特异的扩增带(图
4)。这表明特异性引物具有较高的灵敏度 ,可用于
CNFV的检测。
M:100bp分子量标准;1:RT-PCR扩增产物;2:健康对照
M:100bpMarker;1:TheproductsofRT-PCR;2:Healthycontrol
图 3　特异性 RT-PCR检测
Fig.3　RT-PCRspecificdetection
M:100bp分子量标准;1～ 8:稀释度分别为 10～ 107
M:100bpMarker;1-8:Dilutionsfrom 10-107
图 4　RT-PCR灵敏度检测
Fig.4　RT-PCRsensitive
3　讨　论
　　本研究主要以电镜观察 、血清学方法 、RT-PCR
分子生物学方法进行香石竹病毒病病原物的鉴定 ,
这 3种方法相互印证 ,充分说明感染云南省昆明市
团结乡香石竹的病毒为香石竹坏死斑点病毒
(CNFV),这是国内外首次报道。尤其是本研究从
分子水平鉴定了 CNFV,在国际上首次注册 CNFV
HSP70编码序列(序列注册编号为 EU884443),为
CNFV分子变异及防治机理的研究奠定了基础。
香石竹坏死斑点病毒 Carnationnecroticfleckvi-
rus(CNFV)为长线形病毒科(Closeroviridae)长线形
病毒属(Closterovirus)成员 ,是危害香石竹的主要病
毒之一。长线形病毒科的病毒基因组是植物正义
ssRNA病毒中最长的 ,该科病毒的特征是基因组中
有 1个编码 HSP70同系物(HSP70h)的基因具有重
复的外壳蛋白基因 。 HSP70的功能主要是作为分
子伴侣参与新生肽链的正确折叠 ,多亚基复合体的
组装和解离 ,跨膜运输以及提高细胞对热 、缺氧等恶
劣条件的耐受性。许多细菌 、植物和动物的 DNA和
RNA病毒在生活周期的不同时期要利用寄主细胞
的 HSP70, 而长线形病毒科病毒能自主地编码
HSP70的同系物 , 并且是迄今发现的唯一编码
HSP70h的病毒 。长线形病毒属(Closterovirus)代表
种为甜菜黄化病毒(Beetyelowsvirus, BYV),单分体
基因组 ,由蚜虫以半持久方式传播 ,寄主主要为双子
叶植物[ 6] 。
香石竹被香石竹坏死斑病病毒侵染后 ,香石竹
植株中部的叶片上有灰白色 、淡黄色坏死斑驳 ,或不
规则的条斑及条纹 。植株下部叶片症状和中部的一
样 ,但坏死斑为紫红色 ,发病严重时整个叶片枯萎坏
死[ 7] 。捷克斯洛伐克 、美国加利福尼亚州 、印度 、新
西兰等地都曾检测到 CNFV,检测方法主要有免疫
电镜和 ELISA检测 ,病毒粒子长度为 1000 ～ 1600
1051期 　　　　　　赵　珊等:香石竹坏死斑点病毒的鉴定与检测
nm,寄主除香石竹之外 ,还有肥皂草(Saponariavac-
caria),传播方式主要是贸易传播 ,媒介昆虫为桃蚜
(Myzuspersicae)[ 8 ～ 11] 。 S.A.Lommel等人采用
ELISA检测发现加利福尼亚州温室 CNFV发病率为
13 %。要减少香石竹病毒危害 , 首先就是加强检
疫 ,对从国外引进的香石竹组培苗要进行严格的检
疫 , 检出的有毒苗要进行彻底销毁 , 或处理后再种
植 。
许多研究表明国内外 ELISA检测仍然在 CNFV
检测中占主要地位。但 ELISA检测存在假阳性或
假阴性现象 。而 PCR技术由于检测专一性强 、灵敏
度高 、特异性好 、检测时间短 ,是一种更可靠的检测
方法。本研究首次建立香石竹坏死斑点病毒 RT-
PCR检测方法 ,该方法具有较好的特异性 ,避免了
ELISA检测方法假阳性结果的出现 ,同时也避免了
由于一些植株病毒含量较少 , ELISA漏检的情况 。
更重要的是本实验建立的 RT-PCR检测方法不需要
病毒提纯 ,直接提取植物总 RNA,检测灵敏度即可
达到 107稀释倍数 ,比血清学检测更为灵敏 。为检
测香石竹坏死斑点病毒提供了准确 、灵敏 、快速的检
测方法 。
参考文献:
[ 1]李　鹏,朱　宏 ,赵　凯 ,等.香石竹分子育种研究进展 [ J] .黑龙
江农业科学 , 2008(5):152-154.
[ 2]孔宝华 , 陈海如 ,蔡　红 ,等.云南省花卉病毒病种类及防治对策
[ J] .植物保护 , 2001, 27(5):25-26.
[ 3]张仲凯 , 李　毅.云南植物病毒 [ M] .北京:科学出版社 , 2001.
17-18.
[ 4]董家红 , 岳建强 , 尹跃艳 ,等.云南柠檬生产区衰退病检测与分
析 [ J] .云南大学学报(自然科学版), 2008, 30(S1):73-76.
[ 5] AlexanderVK, OlgaVN, EugeneVK, etal.Screeningofthe
closterovirusgenomebydegenerateprimer-mediatedpolymerasechain
reaction[J] .JournalofGeneralVirology, 1994, 75:1415-1422.
[ 6]洪雪玉 ,陈剑平.长线形病毒科成员编码蛋白的功能 [ J] .浙江农
业学报 , 2004, 16(1):47-52.
[ 7]陈　晶 ,李小军.保护地香石竹病毒病的发生与防治 [ J] .农业工
程技术:温室园艺 , 2006(12):51-52.
[ 8] RaikhyG, HalanV, KulshresthaS, etal.FirstreportofCarnation
necroticfleckvirus(CNFV)infectingcarnationsinIndia[ J] .Plant
Pathology, 2003, 52(6):801.
[ 9] AlanDoddsJ, MosheBar-Joseph.Double-StrandedRNAfromPlants
InfectedwithClosteroviruses[ J] .Phytopathology, 1983, 73(3):419
-423.
[ 10] DoljaVV, KarasevAV, KooninEV.MolecularBiologyandEvo-
lutionofClosteroviruses:SophisticatedBuild-upofLargeRNAGe-
nomes[ J] .Phytopathology, 1994, 32:261-285.
[ 11] BoligalaC, RajuandConrad, OlsonJ.IndexingSystemsforProdu-
cingCleanStockforDiseaseControlinCommercialFloriculture[ J].
PlantDisease, 1985, 69(3):189-192.
(责任编辑　王家银)
106 西　南　农　业　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　23卷