全 文 ：波 谱 学 杂 志第 18卷第 3期
2001年 9月　 Chinese Journal of M agnetic Resonance
Vol.18 No.3
　Sep.2001
文章编号:1000-4556(2001)03-0229-6
高效液相色谱—核磁共振联用技术
在蛇葡萄根提取混合物中的应用研究
王映红 , 李　娜 , 贺文义 , 刘　欣 , 李　斌 , 林　茂
(中国医学科学院 中国协和医科大学药物研究所 , 北京 100050)
摘　要:建立了用高效液相—核磁共振联用技术(LC-NM R)检测微量级蛇葡萄(Ampelopsis
sinica)根提取物中混合组分结构的方法.用停止流动的方法 , 对混合物的各个组分进行分离 ,
并获得1H NMR及 COSY 谱 ,通过与此类化合物所建立的氢谱数据库进行比较 , 分析 , 确定了
微克级的天然产物混合物中的主要组分的化学结构及立体结构.
关键词:高效液相色谱—核磁共振联用技术;蛇葡萄;白藜芦醇低聚艹氐;核磁共振谱
中图分类号:O482.53+2　　文献标识码:A
1　引言
当前 LC-NMR技术已广泛应用于药物代谢 ,药品 、食品的质量控制 ,高聚物分析环境
化学等诸多方面.在天然产物化学方面 , 1995 年 Spring[ 1]利用 LC-NMR技术 ,采用停止
流动模式 ,进行了 Zaluzalia Grayana中倍半萜成分的分离鉴定.获得1H NMR和 COSY
谱 ,最终鉴定了三个倍半萜内酯的化学结构.1996年 , Schot terbeck[ 2]研究了鲸肝油中的
鲸醇及其衍生物的结构 ,采用超高场毛细管 LC-NMR ,并使用氘代试剂进行 1D和 2D-
NMR试验.
由于 LC-NMR技术所提供的结构信息 ,仅限于以1H 作为发射道的各类谱 ,而不能提
供有13C的信息 ,从而大大地限制了其在未知物结构分析中的应用 ,但 LC 无可比拟的分
离效果 ,加之核磁共振技术所得到的化学结构信息 ,使 LC-NMR技术在同类化合物的结
构分析中仍不失为一种好的方法.
蛇葡萄(Ampelopsis sinica (Miq.)W.T.Wang)为葡萄科(Vitaceae)蛇葡萄属植物 ,
　　收稿日期:2001-04-19;收修改稿日期:2001-05-30
　　基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30070889)
　　作者简介:王映红(1965-),女 ,硕士 ,助研
　　图 1　混合物的 HPLC 图谱
　　Fig.1　HPLC of the mixture
具有祛风 、消肿止痛 、治风湿关节炎的作
用[ 3] .据文献[ 4]报道 ,葡萄科植物中富含白
藜芦醇低聚艹氐类化合物 ,该类化合物具有抗
炎 、抗菌 、抗癌 、抗爱滋病等作用.目前已从
自然界中分离得到 140余种该类化合物.我
们在大量文献的基础上 ,对该类化合物的氢
谱进行了整理 ,建立了该类化合物的氢谱数
据库.
在对蛇葡萄根的化学成分的研究过程
中 ,得到一份混合物 ,由于该混合物的氢谱只
能辨认出它们为白藜芦醇低聚体的混合物 ,
而不能确定其确切结构.又因该混合物的量
较少 ,用一般的分离方法不能得到满意的结
果.LC-NMR技术对微量成分的分离鉴定具
有突出的优点 ,因此我们采用该法对混合物
的分离 、结构鉴定进行了系统研究 ,结果鉴定
出其中主要成分的结构为一白藜芦醇四聚体
Vit isin B(1)(图 1).
该法用量少 ,速度快 ,对混合物结构鉴定有重要意义.
2　实验方法
2.1　仪器及实验条件
蛇葡萄根(8 kg)用 95%的酒精提取三次 ,所得浸膏(430 g)在沙氏提取器中提取 ,以
氯仿 、乙酸乙酯 、丙酮 、甲醇分别提取.乙酸乙酯部分(66 g)用硅胶柱分为七份(A-G).
第五份(E)通过硅胶柱又分为六份(E1 ～ E6).E1 通过 MPLC得到一份混合物(2 mg).
采用 Varian公司的 LC-NMR联用仪 ,其中高效液相色谱仪为 Prostar-230 ,分析柱为
Inertsil ODS-3柱(250×4.6 mm).流动相为 D2O ,CH3CN ,采用梯度洗脱 ,其洗脱比例为 ,
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D2O∶CH3CN =57∶43(0 ～ 10 min),以后逐渐增加乙腈的比例至 40 分钟时达到 D2O∶
CH3CN=40∶60.流速为 1mL/min ,检测器为 Varian Prostar-330二极管振列检测器 ,紫外
检测波长为 280 nm.
将 2mg 混合物样品溶于 80μL 乙腈和水的混合溶剂中.
2.2　实验内容
1.在 Mercury-300核磁共振仪上采集普通的混合物的1H NMR谱 ,内标为 TM S ,以
CD3OD为溶剂 ,采样时间 1.5s ,累加次数为 32次.
2.在 INOVA-500 LC-NMR 上 , 用停止流动的方法采集 LC-NMR 1H NMR 谱及
WEGCOSY谱.进样量为 25μL , 1H NMR谱采样时间为 1.5 s ,累加次数为 416.WETG-
COSY的 F 1 , F2均为 60000.0 Hz , nt=24 , ni=128 ,总采样时间为 1h 7min 37s.
3　结果与讨论
白藜芦醇低聚艹氐类化合物是指由白藜芦醇(2)为单元聚合而成的一类化合物 ,到目
前为止发现这类化合物的聚合度最高为六聚体.该类化合物的氢谱具有很强的规律性.
我们在大量文献的基础上 ,对此类化合物的氢谱数据进行了整理 ,建立了该类化合物的氢
谱数据库.
图 2　Vit isin B的1H NMR谱
Fig　2　The 1H NM R spect rum of Vit isin B(1)
在通过 LC-NMR得到的1H NMR谱(图 2)及WETGCOSY谱(图 3)中显示如下信号:
三套 4-羟基苯基上的 A2B2系统的质子信号;一套 3位取代的 4-羟基苯基上的ABX系统
的质子信号;两套 3 ,5-二羟基苯基上的 AB2 系统的质子信号;两套 2位取代的 3 ,5-二羟
231第 3期 王映红等:高效液相色谱—核磁共振联用技术在蛇葡萄根提取混合物中的应用研究
图 3　Vit isin B的 WETGCOSY谱
Fig.3　The WETGCOSY spect rum of Vi tisin B(1)
基苯基上的AB系统的质子信号;一对反式烯氢
的信号;三个二氢苯骈呋喃环上的六个脂肪质
子信号.由以上信息 ,我们可以推测出该化合物
的平面结构为 3.文献中报道的具有该种平面
结构的化合物共有三种:Vitisin B , Heyneanol A
(4)和 Vitisin C(5).根据该化合物的三个二氢
苯骈呋喃环上的H7 ,H8 的偶合常数均较小为5.
5 Hz ,排除结构 5的可能性 ,因 5中有一对顺式
的H7 ,H8 ,偶合常数为 9.6 Hz.因 LC-NMR中
用乙腈-水为溶 剂 , 稍不 同于 Vitisin B 及
Heyneanol A 的文献[ 5 , 6]数据 ,为此很难直接
通过氢谱比较出它们的立体结构.在平面结构
确定的基础上 ,再观察混合物的氢谱 ,可以明确
的比较出混合物主要成分的氢谱数据与 Vitisin
B完全一致 ,由此推测出了 1的立体构型.
　　通过以上的 LC-NMR实验 ,我们得出以下几点经验与体会:
1.HPLC与 NMR在对样品量的需求上存在相对的矛盾.要想取得较好的 HPLC紫
外光谱吸收峰线形 ,样品的进样量要求尽量少 ,这样可保证一个组分的绝大部分保留在
NMR探头液池中 ,因为探头液池的体积仅有 60μL.而过少进样 ,会使探头液池中液体溶
质的含量较低 ,影响 NMR谱的质量 ,甚至无法获得相应的 2D谱.
2.在溶剂的使用上 ,采用乙腈和重水较好 ,虽然采用甲醇会降低成本 ,但是甲醇在核
磁谱中水峰压制的效果不如乙腈.采用重水可大大降低核磁谱中水峰的强度及降低水峰
对样品峰的影响.
3.在我们的实验中 ,天然产物混合物其成分较复杂 ,除主要组分外 ,还含有其它许多
小组分 ,如果不考虑紫外吸收效应 ,吸收峰线形较好时 ,其 UV 谱吸收峰强度达到 100 μA
时 ,可获得较好的1H NMR谱.
4.本实验采用 LC-NMR联用技术 ,使微量天然混合物中的主要组分的化学结构及
立体结构得到证实 ,充分体现了 LC-NMR技术的微量 、快速的特点.
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实践证明 LC-NMR在结构具有规律性的同类化合物的鉴定中 ,可起到提高工作效
率 、避免盲目重复劳动的作用.在天然产物的提取分离工作中不但有指导作用 ,在某些情
况下 ,还可确定其结构和立体构型.
表 1　Vitisin B 的1H NM R谱
Tab.1　The 1H NMR spectrum of Vitisin B.
Posi tion δH(J Hz) COSY
2 , 6a 7.175 d(8.5) 3 , 5a
3 , 5a 6.813 d(8.5) 2 , 6a
7a 5.499 d(5.5)
8a
10 , 14a 6.126 d(2.0)
12a 6.107 t (2.0)
2 , 6b 6.647 d(8.5) 3 , 5b
3 , 5b 6.571 d(8.5) 2 , 6b
7b 5.449 d(5.5)
8b 4.461 d(5.5)
12b 6.341 d(2.0)
14b 6.114 d(2.0)
2c 6.780 d(1.5)
5c 6.772 d(8.0)
6c 7.100 dd(8.0 , 1.5)
7c 6.547 d(16.0)
8c 6.789 d(16.0)
12c 6.314 d(2.0)
14c 6.612 d(2.0)
2 , 6d 7.202 d(8.5) 3 , 5d
3 , 5d 6.836 d(8.5) 2 , 6d
7d 5.376 d(5.5)
8d 4.461 d(5.5)
10 , 14d 5.951 d(2.0)
12d 6.011 t (2.0)
233第 3期 王映红等:高效液相色谱—核磁共振联用技术在蛇葡萄根提取混合物中的应用研究
参 考 文 献
[ 1] 　Spi rng M , et al.Phytochemist ry[ J] , 1995 , 39(3):609-612
[ 2] 　Abert K , S chlotterberk G , et al.J Chromatogr[ J] , 1996 , A750:303-309
[ 3] 　贵州省中医研究院.贵州中草药名录[ M] .贵阳:1988 , p331
[ 4] 　Sotheesw aran S , Pasupathy V.Phytochemistry[ J] , 1993 , 32:1083-1092
[ 5] 　Oshima Y , Kamijou A , Ohizumi Y , et al.Novel oligost ilbenes f rom Vit is coignetiae[ J] .T et rahedron, 1995 , 51
(44):11979-11986
[ 6] 　Li W W , Li S D , Li BG , et al.Oligost ilbenes f rom Vit is heyneana[ J] .Phytochemit ry , 1996 , 42(4):1163-1165
DETECTING COMPOSITION OF MIXTURE OF AMPELOPSIS
SINICA WITH LC-NMR TECHNOLOGY
WANG Y ing-hong , LI Na , HE Wen-yi , LIU X in , LI Bin and LIN Mao
(Insti tute of Materia Medica , Chinese Academy of Medical S ciences and Peking Union Medical College , Beijing 100050)
Abstract
This paper will give a descript ion of an ef fective method that analyzes a mix ture from
the roots of Ampelopsis sinica with direct-coupled LC-NMR.Stop-flow experiments w ere
carried out.The main composi tion w as determined as a resverat rol tet ramer Vi tisin B by
means of 1H-LCNMR and WETGCOSY.
Key words:Liquid chromatog raphy-nuclear magnetic resonance;NMR spectroscopy;Ampelopsis sinica
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