全 文 ：2009年 10月
第 24卷第 10期
中国粮油学报
JournaloftheChineseCerealsandOilsAsociation
Vol.24, No.10
Oct.2009
绿豆皮中总黄酮的提取工艺研究
张　燕 1　么　杨2　潘国清 3　任贵兴2　白根本 1
(北京中医药大学中药学院 1 ,北京　100102)
(中国农业科学院作物科学研究所 2 ,北京　100081)
(中国农业科学院特产研究所3 ,吉林　132109)
摘　要　利用正交试验方法优化得到绿豆皮中总黄酮的最佳提取工艺 。以芦丁为标准品 ,采用分光光度
法在 510nm下对提取液中总黄酮含量进行测定。通过提取时间 、乙醇体积分数 、提取温度 、固液比与提取次
数 5个因素的单因素试验 ,设计 L16(45)正交试验筛选最佳工艺 。结果表明:提取时间 150 min,乙醇体积分数
50%,提取温度 80 ℃,固液比 1∶10,提取次数 2次 ,绿豆皮中总黄酮的提取量为 3.879 mg/g,平均回收率为
100.84%,精密度试验 RSD为 0.18%。
关键词　绿豆皮　总黄酮　正交试验　分光光度法
中图分类号:S522　　文献标识码:A　　文章编号:1003-0174(2009)07-0124-04
基金项目:北京市农业技术试验示范项目(20080807);中国农业
科学院人才基金项目(2060302-14)
收稿日期:2008-11-20
作者简介:张燕,女 , 1984年出生 ,硕士 ,微生物与生化药学
通讯作者:白根本 ,男 , 1958年出生 ,教授 ,硕士生导师 ,生物制药
　　绿豆 (Mungbean),又名青小豆 ,具有清热解
毒 ,泻火明目 ,滋补强身的功效 ,深受人们的喜爱 。
绿豆芽生产过程中产生大量的绿豆皮 ,绿豆皮中含
有丰富的黄酮 、生物碱 、皂苷 、鞣质 、强心甘等化学
成分 ,具有多种生理学活性 ,如抗肿瘤 [ 1] 、抑制血管
紧张素 I转换酶(ACE)[ 2] 、抗氧化 [ 3] 、降血脂 、降血
糖 [ 4]等 。其中黄酮类物质抗氧化活性成为研究的
热点 [ 5 -6] 。
目前对绿豆皮中黄酮类化合物提取工艺方面的
研究较多 [ 7-9] ,但是对发芽过程脱下的绿豆皮中总黄
酮提取方法的研究鲜有文献报道。旨在通过单因素
和正交试验 ,探讨乙醇提取绿豆皮中总黄酮的最佳
工艺 。
1　试验材料和方法
1.1　试验材料
绿豆皮:北京东升方圆农业种植开发有限公司;
芦丁:中国药品生物制品检定所;无水乙醇:北京化
工厂;亚硝酸钠:北京化学试剂有限公司;硝酸铝:北
京化学试剂有限公司;氢氧化钠:北京化学试剂有限
公司 ,均为分析纯。
1.2　试验设备
RJ-TDL-5A低速台式大容量离心机:常州诺
基仪器有限公司;SHA-C水浴恒温振荡器:江苏金
坛市环宇科学仪器;SmartspecTMplus型紫外可见分光
光度计:美国伯乐公司 。
1.3　试验方法
1.3.1　材料的预处理
绿豆芽生产过程中脱下的绿豆皮干燥后 ,经粉
碎机粉碎 ,过 80目筛 ,备用 。
1.3.2　绿豆皮总黄酮提取液的制备
精确称取 1.0 g绿豆皮干粉于 50 mL的三角瓶
中 ,以一定浓度和体积的乙醇做溶剂 ,在一定的提取
次数 、温度和时间下恒温振荡提取。离心收集提取
液 ,定容至 50 mL,待测。
1.3.3　单因素试验
分别以水浴温度 、溶剂浓度 、提取时间 、固液
比 、提取次数为影响因素 ,设置各因素的不同水平 ,
以确定相关因素对绿豆皮提取液中总黄酮含量的
影响 。
1.3.4　正交试验
为了获得最佳工艺条件 ,以不同的提取温度 、
乙醇浓度 、提取时间 、提取次数和固液比为考察因
素 ,通过单因素试验结果 ,运用正交设计试验法 ,考
察 5因素间的相互影响 ,选用 5因素 4水平来确定
提取绿豆皮中总黄酮的最佳条件 。试验设计见
表 1。
第 24卷第 10期 张　燕等　绿豆皮中总黄酮的提取工艺研究
1.3.5绿豆皮总黄酮的测定
1.3.5.1　芦丁标准溶液的配制
准确称取干燥至恒重的芦丁标准品 0.035 7 g,
用约 60mL40%的乙醇加热溶解 ,待冷却后转移至
100 mL的容量瓶中 ,定容至刻度 ,充分混匀 。芦丁标
准品溶液的浓度为 0.357mg/mL,备用。
表 1　正交试验因素水平表
水
平
因素
A提取温度
/℃
B乙醇浓度
/%
C提取时间
/min
D提取次数
/次 固液比
1 60 20 60 1 1∶6
2 70 30 90 2 1∶8
3 80 40 120 3 1∶10
4 90 50 150 4 1∶12
1.3.5.2　绘制标准曲线
精确吸取芦丁 标准液 0.2、 0.8、 1.4、 2.0、
2.6 mL,分别置于 10 mL的容量瓶中 ,加 40%乙醇至
5mL。先加 0.3mL的亚硝酸钠溶液(50mg/mL),摇
匀 ,放置 6 min;再加入 0.3 mL硝酸铝溶液 0.3 mL
(100mg/mL),摇匀 ,放置 6min;最后加入 4 mL的氢
氧化钠(40mg/mL),用 40%乙醇定容 ,摇匀 ,放置 15
～ 20 min。以溶剂作空白 ,用分光光度计于 510 nm
处测定吸光度 ,绘制吸光度与浓度的标准曲线 ,计算
线性方程:Y=0.087 4x+0.000 6, 相关系数 r2 =
0.999 5。
1.3.5.3　绿豆皮中总黄酮的含量测定
精确量取提取液 5mL,置于 10 mL的容量瓶中 ,
以溶剂作空白对照 。依 1.3.5.2方法测定吸光度 ,根
据标准曲线计算提取液中总黄酮含量。
2　结果与分析
2.1　回收率试验
精密量取已知含量的绿豆皮总黄酮提取液
4mL,分别加入浓度为 0.357 mg/mL的芦丁标准液
1mL,最后定容至 10 mL。按 1.3.5.2方法测定吸光
度 ,经线性回归得平均回收率为 100.84%。
2.2　稳定性试验
取最佳工艺下提取溶液 ,按标准曲线绘制项下
的分析方法操作 ,分别在 0、0.5、1、2、3、4 h测其吸光
度值 。结果 RSD%=0.57%,表明提取液 4 h内显色
稳定 。
2.3　精密度试验
取同一标准品芦丁溶液 ,连续测样 5次 ,结果
RSD%=0.182%(n=5),表明仪器精密度良好。
2.4　单因素试验
2.4.1　提取温度的影响
在乙醇浓度为 40%,提取时间为 1 h,固液比为
1∶10,提取次数为 2次的条件下 ,分析提取温度对绿
豆皮总黄酮的影响。从图 1可以看出 ,随着提取温
度的升高 ,总黄酮的提取量相应的增加 ,但是当温度
达到 90 ℃时 ,提取液呈现出明显的黄褐色 ,可能原
因是黄酮类物质在高温下遭到破坏 ,或者有其他杂
质被提取出来 ,不利于进一步的分离纯化 ,与文献报
道结果一致 [ 6, 8] 。因此 ,选择提取温度为 80℃。
图 1　提取温度对总黄酮提取量的影响
2.4.2　乙醇浓度的影响
在提取温度为 70 ℃,提取时间为 1 h,固液比为
1∶10,提取次数为 2次的条件下 ,分析乙醇浓度对提
取绿豆皮中总黄酮的影响 。从图 2可以看出 ,在乙
醇浓度为 30%时 ,总黄酮的提取量达到最大 ,随后增
加乙醇浓度 , 提取量增加不显著 。试验结果表明
30%的乙醇浓度为宜。
图 2　乙醇浓度对总黄酮提取量的影响
2.4.3　固液比的影响
在提取温度为 70 ℃,提取时间为 1 h,乙醇浓度
为 40%,提取次数为 2次的条件下 ,分析固液比对提
取绿豆皮中总黄酮的影响 。由图 3可知 ,当固液比
为 1∶10时 ,总黄酮的含量达到峰值。当继续增加固
液比时 ,提取量反而下降 ,分析原因可能是当固液比
增加到一定程度时 ,原料内部与溶剂之间溶质已经
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中国粮油学报 2009年第 10期
达到平衡 ,反而使杂质溶解增加 ,相应减少总黄酮的
提取量[ 6] 。
图 3　固液比对总黄酮提取量的影响
2.4.4　提取时间的影响
在提取温度为 70 ℃,固液比为 1∶10 ,乙醇浓度
为 40%,提取次数为 2次的条件下 ,分析提取时间对
提取绿豆皮中总黄酮的影响。结果如图 4所示 ,随
着提取时间的延长 ,总黄酮的提取量也有所增加 ,但
是 90 min以后增加量不显著。当提取时间为 150
min时 ,总黄酮的提取量只增加了 0.1 mg/g,从节约
时间和能耗角度分析 ,选择提取时间 90 min为宜 。
图 4　提取时间对总黄酮提取量的影响
2.4.5　提取次数的影响
在提取温度为 70 ℃,固液比为 1∶10 ,乙醇浓度
为 40%,提取时间为 1h的条件下 ,分析提取次数对
提取绿豆皮中总黄酮的影响 ,见图 5。
图 5　提取次数对总黄酮提取量的影响
由图 5可知 ,提取次数达到 3次时 ,总黄酮的提取
量已经基本平衡。由于试验中采用的原料是绿豆发芽
过程中脱下的皮 ,原料经过水浸泡 ,部分总黄酮溶水后
已损失 ,因此提取 3次后 ,总黄酮已基本提取完全。
2.5　正交试验
采用 L16(45)正交表对绿豆皮提取液进行分析 ,
以总黄酮提取量为指标 ,研究各因素间相互作用下
的最佳提取工艺 。结果及方差分析见表 2和表 3。
表 2　L16(45)正交试验设计与直观分析
试验号 因素A B C D E
提取量
/mg/g
1 1 1 1 1 1 0.615
2 1 2 2 2 2 1.695
3 1 3 3 3 3 2.000
4 1 4 4 4 4 3.425
5 2 1 2 3 4 2.320
6 2 2 1 4 3 3.170
7 2 3 4 1 2 1.135
8 2 4 3 2 1 2.355
9 3 1 3 4 2 3.525
10 3 2 4 3 1 2.800
11 3 3 1 2 4 2.705
12 3 4 2 1 3 2.060
13 4 1 4 2 3 2.640
14 4 2 3 1 4 1.415
15 4 3 2 4 1 3.710
16 4 4 1 3 2 2.875
K1 1.933 2.275 2.341 1.306 2.370
K2 2.245 2.27 2.446 2.349 2.308
K3 2.773 2.388 2.324 2.499 2.468
K4 2.660 2.679 2.500 3.458 2.466
R 0.840 0.409 0.176 2.152 0.160
表 3　方差分析
方差来源 离均差平方和 自由度 方差 F P
A 3.582 3 1.194 151.016 <0.01＊＊
B 0.883 3 0.294 37.22 <0.01＊＊
C 0.171 3 0.057 7.209 <0.01＊＊
D 18.616 3 6.205 784.845 <0.01＊＊
E 0.147 3 0.049 6.196 <0.01＊＊
注:F0.01(3 , 3)=29.46, ＊＊双尾检验在 0.01水平极显著
根据表 3正交试验数据 ,运用 SAS(Vesion8)-
ANOVA软件分析各试验点 ,可得出最优化组合:
A3B4C4D4E3;即提取温度为 80 ℃,乙醇浓度为 50%,
提取时间为 150 min,提取次数 4次 ,固液比为 1∶10。
各因素的影响顺序为 D>A>B>C>E,即提取次数对
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第 24卷第 10期 张　燕等　绿豆皮中总黄酮的提取工艺研究
总黄酮的提取量影响最大 。但考虑实际提取过程中 ,
增加提取次数会大幅增加能耗 ,而提取量并不能相应
增加。而且试验所研究的绿豆皮是绿豆发芽过程中脱
下的绿豆皮 ,总黄酮含量较低 ,所以综合考虑 ,选择提
取 2次为最佳。最终确定绿豆皮总黄酮的最佳工艺
为:提取温度 80℃,乙醇浓度为 50%,提取时间为 150
min,提取次数为 2次 ,固液比为 1∶10。在此工艺下得
到的总黄酮提取量为 3.879mg/g。
3　结论
绿豆是我国重要的粮食作物 ,绿豆皮作为绿豆
芽生产过程中的副产物 ,目前主要用于肥料 ,造成了
资源浪费和环境污染 。而绿豆皮中含有的总黄酮具
有天然抗氧化活性 ,是良好的生理活性物质 。本试
验采用正交试验方法 ,确定绿豆皮中总黄酮的最佳
提取工艺:提取温度 80℃,乙醇浓度为 50%,提取时
间为 150 min,提取次数为 2次 ,固液比为 1∶10。在
最佳条件下 ,总黄酮的提取量为 3.879 mg/g。为工
业化提取绿豆皮中总黄酮提供新的线索 ,为以后的
进一步研究奠定了科学依据 。
参考文献
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ExtractionConditionsforFlavonoidsfrom
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ZhangYan1　YaoYang2　PanGuoqing3　RenGuixing2　BaiGenben1
(SchoolofChinesePharmacy, BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine1 , Beijing　100102)
(InstituteofCropScience, ChineseAcademyofAgriculturalSciences2 , Beijing　100081)
(InstituteofSpecialWildEconomicAnimalandPlantScience, ChineseAcademyof
AgriculturalSciences3 , Jilin　132109)
Abstract　Onthebasisofsinglefactorexperiment, fiveinfluencingfactors, namelyextractingtime, ethanol
concentration, extractiontemperature, material-liquidratioandextractiontimesforextractingflavonoidsfrommung
beancoatwereestablished.ThusaL16(45)orthogonalexperimentwasappliedtooptimizetheextractionconditions,
usingspectrophotometrytodeterminethetotalflavonoidsat510nmwavelength.Results:Theobtainedoptimalextrac-
tionconditionsareextractingtime150min, ethanolconcentration50%, extractiontemperature80℃, material-liq-
uidratio1∶10andextractiontimes2 times.Undertheconditionstheextractionrateofflavonoidsis3.879 mg/g, the
averagerecoveryis100.84% andRSDis0.18%.
Keywords　mungbeanhul, totalflavonoids, orthogonalexperiment, spectrophotometry
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