全 文 ：第 37卷 第 1期
2010年
北京化工大学学报(自然科学版)
JournalofBeijingUniversityofChemicalTechnology(NaturalScience)
Vol.37, No.1
2010
椰子油为原料酶法制备脂肪酸甲酯
高伯良　聂开立　王　芳　邓　利＊　谭天伟
(北京化工大学 北京市生物加工过程重点实验室 , 北京　100029)
摘　要:以椰子油为原料利用固定化 Candidaantarcticasp.99-125脂肪酶转酯化制备了脂肪酸甲酯。 分析了椰子
油的脂肪酸组成 , 并测定了椰子油平均分子量 , 考查了关键因素对反应的影响及反应历程。实验结果表明:椰子油
平均分子量为 655.27;最优反应条件为:酶最小加入量为 20%,水加入量为 15%,正己烷加入量为 4mL/2g椰子油。
此反应条件下原料油转化率达到 90%。
关键词:椰子油;固定化脂肪酶;转酯化反应;甲酯
中图分类号:TQ225.24
收稿日期:2009-03-17
基金项目:国家 “ 863”计划(2002AA514030);国家自然科学
基金(20176002)
第一作者:男 , 1981年生 , 硕士生
＊通讯联系人
E-mail:dengli@mail.buct.edu.cn
引　言
生物柴油是一种绿色能源 ,作为石化柴油的替
代品和补充品具有可再生 、易于生物降解 、燃烧排放
的污染物低 、基本无温室效应等特点[ 1-2] 。菜籽油 、
大豆油 、蓖麻油 、动物脂肪 、米糠油 、桐油 、餐厨废油
等都可以作为生物柴油的原料油。目前研究和报道
多为以大豆油 、菜籽油 、动植物油脂和餐厨废油等高
产量油脂为原料 [ 3-7] 。
大多数天然油脂脂肪酸主要为十六碳到二十
碳 [ 8-9] ,而椰子油中链长较短的十二碳和十四碳脂
肪酸含量丰富。植物油生物柴油主要由混合脂肪酸
甲酯组成 ,其脂肪酸甲酯的分布与所用的植物油密
切相关 ,并决定生物柴油的物性 ,故植物油的脂肪酸
分布可预测生物柴油的物性。黏度是生物柴油最重
要的理化性质之一 ,大多数油脂的脂肪酸甲酯的粘
度在 3.31 ～ 3.94mPa·s范围内 ,油菜籽油甲酯的黏
度较高为 4.72mPa·s,椰子油为 2.25mPa·s[ 10] 。以
椰子油为原料生产的脂肪酸甲酯可调和其他类型脂
肪酸甲酯的品质(降低动力粘度)以达到使用标准 ,
所以椰子油为原料制备生物柴油有研究前景。
本文以气相色谱法分析了椰子油的脂肪酸组成
和甘油酯组成 ,优化了影响椰子油甲酯化的关键因
素并考查了最优条件下的反应历程。
1　实验部分
1.1　材料与试剂
甲醇 、正己烷 、三氟化硼 、氢氧化钾 、椰子油 ,北
京市化学试剂公司 。标准品:棕榈酸 、棕榈酸单甘
酯 、棕榈酸二甘酯 、棕榈酸三甘酯 、油酸 、油酸单甘
酯 、油酸二甘酯 、油酸三甘酯 , Sigma化学试剂公司。
固定化 Candidasp.99-125脂肪酶 ,实验室自制 [ 11] ,
表观酶活力 25000U/g。分析用试剂为色谱纯 ,其他
试剂为分析纯 。
1.2　主要仪器设备
HZQ-X100型振荡培养箱 ,哈尔滨东联电子技
术开发有限公司;电子天平 ,赛多利斯公司;GC2010
气相色谱仪 ,岛津公司;空气发生器 ,氢气发生器 ,北
京东西电子研究所 。
1.3　酶催化实验
反应体系含椰子油 、甲醇 、正己烷和固定化酶 ,
于 50mL具塞锥形瓶中密闭 ,恒温摇床内反应。将
固定化酶 、椰子油和正己烷置于锥型瓶中 40℃下振
摇 10min使体系混合均匀 。加入水和 361.99μL甲
醇(1mol当量)开始反应。反应中甲醇分 3次等量
加入 ,每次加入间隔为 4h,总反应时间为 12h。
1.4　气相色谱法分析椰子油组分
1.4.1　气相色谱仪升温程序
岛津 GC2010型气相色谱仪 , DB1-ht毛细管柱
(0.25mm×15mm, Agilient);高纯氮载气;二阶程
序升温 ,升温速率:柱温 100 ～ 300℃, 10℃/min;300 ～
350℃, 5℃/min;氢离子火焰检测器 , 检测器温度
DOI :10.13543/j.cnki.bhxbzr.2010.01.011
375℃,气化室温度 370℃。
1.4.2　甘油酯组成分析
20μL油脂溶于 1mL正己烷中 ,分析确定游离
脂肪酸(FFA),单脂肪酸甘油酯(MAG),二脂肪酸
甘油酯(DAG),三脂肪酸甘油酯(TAG)质量分数。
1.4.3　脂肪酸组成分析
三氟化硼-甲醇法进行油脂甲酯化。取椰子油
30mg于 10mL试管 ,加入 1.0mL氢氧化钾-甲醇溶
液 , 60 ℃恒温水浴 10 min, 冷却后加入 1.0 mL
12.5%三氟化硼 -甲醇溶液 ,恒温水浴煮沸 2min;冷
却后加入 1.5mL石油醚震荡 ,使脂肪酸甲酯转入醚
层 ,再向试管中加入一定量饱和氯化钠溶液 ,使醚层
上浮至管颈 ,分析脂肪酸组成。
1.5　原料油转化率测定
取 20μL反应液 ,加入 1mL正己烷 ,充分混合 ,
取 1μL样品气相色谱分析 。产品转化率采用峰面
积归一化法计算 。反应体系中脂肪酸甲酯(FAME)
质量分数为原料油转化率 。
2　结果与讨论
2.1　椰子油脂肪酸组成
图 1为实验用椰子油甲酯化后的气相谱图 ,计
算后椰子油脂肪酸组成见表 1。甲酯化常用植物油
及动物油脂脂肪酸组成以 C16碳以上脂肪酸为主 ,
而椰子油中含有大量 C12和 C14脂肪酸 ,这使得椰
子油平均分子量小于常用油脂 。计算得椰子油脂肪
酸平均分子量为 209.86。实验用椰子油甘油酯成
分见表 2 ,可见有少量酸败 。由表 1和表 2结果计
算得椰子油平均分子量 655.27。
图 1　椰子油甲酯化后 GC分析
Fig.1　GCanalysisofthecoconutoilmethylesters
2.2　椰子油甲酯化反应条件优化
实验室前期大量工作表明 , Candidasp.99-125
固定化脂肪酶用于合成生物柴油具有良好的反应特
性 ,反应所需水含量较高 [ 3, 12-14] ,并且原料不同 ,所
需水含量及溶剂量有所变化 ,因此本文重点考察了
酶用量 、水加入量及溶剂量几个工艺参数 ,并研究了
最优反应条件下椰子油甲酯化历程。
表 1　椰子油脂肪酸组成
Table1　Fattyacidcompositionofcoconutoil
峰序号 脂肪酸种类 w/%
1 C6∶0 0.4425
2 C8∶0 6.9245
3 C10∶0 5.528
4 C12∶0 45.3944
5 C14∶0 18.021
6 C16∶0 9.5189
7 C18∶0 2.5447
8 C18∶1 8.0927
9 C18∶2 3.186
10 C18∶3 0.1841
11 C20∶0 0.0767
表 2　椰子油甘油酯组成
Table2　Glyceridecompositionofcoconutoil
甘油酯成分 w/% 甘油酯成分 w/%
FFA 0.8 DAG 0.139
MAG 0.063 TAG 8.99
2.2.1　酶使用量
酶用量直接影响反应速度和转化率 。酶剂量越
大 ,催化活性越强 ,剂量达饱和后 ,由于酶促反应界
面的限制 ,再增加酶用量不会提高催化效率。实验
条件为 15%外加水(水与油质量比),正己烷 4mL,
考察了 10% ～ 40%(酶质量与椰子油质量比)酶用
量 ,反应结果如图 2。反应 12h后 10%酶用量下反
应转化率为 76%, 增加到 20%后转化率提升至
90%,再增加酶用量转化率没有提高 。说明 20%的
固定化酶使用量对该反应体系达到饱和 。
2.2.2　水加入量
酶需要少量水保持其活性三维构象 。酶周围的
水能降低酶分子中极性氨基酸的相互作用 ,防止产
生不正确构象结构。有证据表明 ,酶分子周围水化
层作为酶表面和反应介质之间的缓冲剂 ,它是酶微
环境主要成分 。有机溶剂中酶含水量低于最适水含
量时酶构象过于 “刚性”而失去催化活性;含水量过
·94· 北京化工大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　2010年
图 2　酶使用量对原料油转化率的影响
Fig.2　Efectofenzymedosageonthe
conversionrateoftherawoil
高时 ,酶结构柔性过大 ,酶的构象将向疏水环境下热
力学稳定状态变化 ,引起酶结构改变和失活 。只有
在最适水量时蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳
定性之间达到平衡 ,酶才表现出最大活力 。
图 3　水加入量对原料油转化率的影响
Fig.3　Efectofwaterdosageontheconversion
rateoftherawoil
实验条件为 20%酶 , 4mL正己烷。实验研究了
0 ～ 40%(水与油质量比)外加水量对反应的影响 ,
结果如图 3所示 。发现无外加水条件下 ,反应转化
率极低(22%),反应甲酯产率随反应外加水含量升
高而迅速增大 ,并在 15%外加水条件下出现一极值
(91%);继续增加外加水量 ,反应甲酯产率开始缓
慢下降 。分析其原因可能有 3点:①水改变了酶的
活性中心的构象 ,降低了甲醇对酶的毒性;②水稀释
了反应体系中底物甲醇 ,减少了甲醇对脂肪酶的毒
性作用 ,同时也稀释了产物甘油 ,使反应平衡向正方
向移动;③水加入后 ,油脂会在脂肪酶的催化下发生
水解反应 ,水解生成的脂肪酸又会和甲醇发生酯化
反应 ,致使甲酯由酯化和转酯化两反应同时生成 ,并
且研究表明 , Candidasp.99-125脂肪酶催化水解及
酯化反应的能力远远高于其催化转酯化反应能力 。
过量水的加入引起了酶活性中心水簇形成 ,影响脂
肪酶活力 ,并造成固定化酶脱落 ,反应转化率下降。
确定最佳水加入量为 15%。
2.2.3　溶剂加入量
溶剂可能与许多因素有关 ,如体系传质 ,反应体
系匀质性 ,底物抑制等等。实验选择了文献中经常
使用的几种酶促反应体系[ 15]有机溶剂 ,并对比了无
溶剂体系与各种溶剂体系对 Candidasp.99-125脂
肪酶催化效果的影响。使用的有机溶剂为正己烷 、
正庚烷 、环己烷 、石油醚和三氯甲烷 ,正己烷做溶剂
转化率最高。因此 ,对正己烷作溶剂条件下的溶剂
量进行优化。实验条件为 20%酶 , 15%水 ,结果如
图 4所示 。
图 4　溶剂用量对原料油转化率的影响
Fig.4　Effectofsolventdosageonthe
conversionrateoftherawoil
在无正己烷情况下反应的转化率为 78%,随着
溶剂量增大甲酯产率升高 ,并在溶剂用量为 4mL时
出现最大值 90%。当体系中溶剂量超过 5mL后 ,反
应转化率又有所降低。这种现象说明反应体系中加
入溶剂后 ,反应底物的浓度降低 ,活动空间大 ,有利
于与酶活性中心进行立体定位接触 ,使反应转化率
提高 。但是底物浓度稀释到一定程度后 ,底物与酶
的接触机率变小 ,不利于反应的进行。确定 4mL正
己烷 /2g油的比例为最佳溶剂比例 。
2.3　椰子油甲酯化反应历程
在单因素实验基础上对实验体系以进行了放
大 ,采用 40g油 , 20%酶 , 15%水 , 80mL正己烷的实
验条件。甲醇分 3次等量加入 ,为了减小反应体系
中累积甲醇对脂肪酶毒性 ,每次加入甲醇间隔增加
至 5h。 15h后 FAME质量分数为 87.8%, FFA质量
分数为 5.72%。图 5为该反应体系的反应历程 。
3次加入甲醇反应过程中 , FAME质量分数增
加趋势基本一致 ,每次加入甲醇后 20min, FAME质
·95·第 1期　　　　　　　　 　　　　　高伯良等:椰子油为原料酶法制备脂肪酸甲酯
图 5　椰子油甲酯化反应历程
Fig.5　Variationinthecontentsoffattyacidandfaty
acidmethylesterduringthemethylester-
ificationofcoconutoil
量分数迅速增长 ,之后 FAME质量分数增长缓慢 ,
说明在固定化 Candidasp.99-125酶催化下 ,甲酯化
反应初速度非常高 , 20min内反应可进入减速阶段 ,
之后反应速度较慢。
酯肪酸含量在反应开始后持续升高 ,体系内
TAG不断被水解;第 2次加入甲醇后 ,由于 FFA同
甲醇酯化生成脂肪酸甲酯 ,体系内 FFA质量分数迅
速下降;360min后 , FFA质量分数又有提高的趋势 ,
此时 ,体系内的甲醇消耗殆尽 ,水解反应又成为反应
体系内主导反应 。从 FAME质量分数变化情况可
知 ,反应达平衡时间较长 ,超过 300min,平衡时间过
长可能是受传质条件制约 。
3　结论
以椰子油(平均分子量 655.27)为原料 ,利用固
定化 Candidasp.99-125脂肪酶制备脂肪酸甲酯的
最优反应条件为:酶用量 20%,水加入量 15%, 4mL
正己烷 /2g椰子油 。最优反应条件下原料转化率达
90%。反应分为 2个阶段 ,第 1阶段反应速度快;第
2阶段反应速度慢且平衡时间长。
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Preparationoffatyacidmethylestersfrom
coconutoilbyanenzymicmethod
GAOBoLiang　NIEKaiLi　WANGFang　DENGLi　TANTianWei
(BeijingKeyLaboratoryofBioprocess, BeijingUniversityofChemicalTechnology, Beijing100029, China)
Abstract:FatyacidmethylestershavebeenpreparedfromcoconutoilusingimmobilizedCandidaantarcticasp.
99-125 lipase.Thefatyacidcompositionofthecoconutoilwasalsoanalysed.Thekeyfactorsinfluencingthe
transesterificationreactionandthereactionmechanismwereinvestigated.Theaveragemolecularweightoffatyacid
methylestersobtainedwas655.27 andtheoptimumconditionswerefoundtobe:enzymedosageof20% (mass
fractionbasedonoil);waterdosageof15%(massfractionbasedonoil);hexane, 4mL/2goil.Atransesterifica-
tionyieldof90% canbeobtainedundertheoptimumconditions.
Keywords:coconutoil;lipaseimmobilization;transesterification;methylesters
·97·第 1期　　　　　　　　 　　　　　高伯良等:椰子油为原料酶法制备脂肪酸甲酯