全 文 ：第 26卷 ,第 6期 光　谱　实　验　室 Vol . 2 6 , No . 6
2 0 0 9年 1 1月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory November , 2 00 9
HPLC分析四川不同产地珙桐叶槲皮素的含量①
① 国家自然科学基金资助项目 ( 30670209) ;四川省科技厅应用基础项目 ( 05 JY029-107) ;四川省教育厅重大培育项目 ( 07ZZ015)
② 联系人 ,手机: ( 0) 13108152596; E-mail: jialing jiangnz@ 126. com
作者简介:张悦 ( 1983— ) ,女 ,河南省南阳市人 ,在读硕士生 ,主要从事植物化学研究工作。
收稿日期: 2009-04-21;接受日期: 2009-05-11
张 悦a ,b　苏智先②b　罗明华b　胡进耀b　邹利娟b　潘文慧b , c
a (四川省环境科学与生物多样性重点实验室西华师范大学生科院　四川省南充市师大路 1号　 637002)
b(四川省生态与环境保护技术重点实验室绵阳师范学院　四川省绵阳市　 621000)
c(绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室　四川省绵阳市　 621000)
摘　要　采用 Agilent1100色谱仪 , TC-C18柱为色谱柱 ,流动相为乙腈 -0. 02%磷酸水溶液 ( 30∶ 70) ,
流速为 1mL· min- 1 ,检测波长 360nm ,按外标法定量测定四川省内不同产地珙桐叶槲皮素的含量。平均加
样回收率为 96. 6% , RSD= 1. 0% ( n= 5)。该方法简便、快速、重现性好 ,为珙桐叶总黄酮有效成分槲皮素的
鉴定提供了准确、灵敏的含量测定方法。 结果表明:四川绵竹 、峨眉、宝兴、雷波 4个样地中 ,雷波麻咪泽保
护区珙桐叶片槲皮素含量最高。
关键词　珙桐叶 ;槲皮素 ;黄酮 ;高效液相色谱法
中图分类号: O657. 7+ 2　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1004-8138( 2009) 06-1500-04
1　前言
珙桐 (Davidia involucrata Baill )又名鸽子树 ,为我国特有的珙桐科 (Davidiaceae)单型属植物。系
第三纪古热带植物区系的孑遗种 ,有“活化石”之称 ,具有极高的观赏价值和研究价值 ,被列为国家
一级珍稀濒危保护植物 [1 ]。
目前国内外对珙桐的研究主要集中在生态学、人工繁育技术以及生物学特性的描述等方
面 [2, 3 ]。植物化学和药用成分方面研究很少 ,仅对珙桐所含的化学成分进行过初步研究 [ 4, 5]。而不同
地区间珙桐叶黄酮化合物含量的测定与比较迄今未见报道。 黄酮类化合物是自然界中重要的一大
类天然有机化合物 ,是植物的一种次级代谢产物 ,具有祛痰止咳、抗肿瘤、抗衰老、增强免疫力等药
理作用 [6, 7 ]。许多长寿树种的黄酮类化合物已在保健品和药品方面取得很广泛的应用 ,而珙桐作为
千年孑遗的长寿植物 ,其中所含的黄酮类物质理应具有很大的研究和开发价值。用组织培养的方法
批量繁殖珙桐幼苗且炼苗成活率高达 80%的生物技术已有报道 [8 ] ,理论上克服了珙桐作为保护植
物无法大量取材的实际困难 ,为研究和开发珙桐药用价值提供了取材上的可行性。本文首次采用高
效液相法对四川省内不同地区的珙桐叶黄酮类化合物中的一种有效成分槲皮素含量进行测定 ,以
期为以后进一步研究和开发珙桐的药用价值奠定基础。
2　实验部分
2. 1　主要仪器与材料
Agilent 1100高效液相色谱仪 (美国 Agi lent公司 ) ; Sartorius BP211D型电子天平 (德国赛多利
斯公司 ) ; WD-9405B型水平摇床 (北京市六一仪器厂 ) ; Galanz G7020IIYSL-V2型微波炉 (广东佛
山市格兰仕集团 ) ; Milli-Q纯水系统 (美国 Millipore公司 ) ; Eppendorf centrifug e5810R离心机 (德国
Eppendorf公司 ) ;色谱级己腈 (美国 Honeyw ell公司 ) ;槲皮素标准品:纯度≥ 98% ,批号为 10081-
200406,中国药品生物制品检定所 ;其他试剂均为分析纯。
实验材料: 2008年 10月 ,于四川绵竹白云山、峨眉山珙桐保护区、宝兴蜂桶寨自然保护区、雷
波麻咪泽自然保护区采集珙桐叶片 ,经绵阳师范学院罗明华博士鉴定后 ,将其置于烘箱中低温干
燥 ,粉碎后密封备用。
2. 2　色谱条件
色谱柱: Agilent TC-C18色谱柱 ( 150mm× 4. 6mm, 5μm) ;经过反复优化 ,最佳分离条件为流动
相:乙腈 -0. 02%磷酸水溶液 ( 30∶ 70) ,流动相流速 1mL· min- 1 ,检测波长 360nm,柱温 25℃ ,进样
量 10μL,外标法定量。
2. 3　对照品溶液的制备
准确称取槲皮素对照品 0. 00831g ,加入甲醇溶解 ,于 25mL容量瓶中定容 ,得到 0. 3324
μg· mL- 1槲皮素对照品母液。用其配制成 1. 662, 3. 324, 16. 62, 33. 24, 66. 48μg· mL- 1 5个浓度梯
度备用。
2. 4　样品溶液的制备
准确称取 2. 0000± 0. 0002g干燥的珙桐叶粉 ,加 30mL的体积分数为 70%的乙醇置于水平摇
床中速摇 12h,在功率 700W下间歇微波 4min提取 ,转移至离心管离心 ,用 70%的乙醇溶液将上清
液定容至 50mL, 0. 22μm滤膜过滤得待测液。
3　结果与讨论
图 1　槲皮素标品校准曲线
3. 1　校准曲线
取不同浓度的标准品溶液 ,按上述色谱条件分
别进样 ,进样量均为 10μL。 以进样量 x (μg)为横坐
标 ,色谱峰面积 y为纵坐标作图 ,求得回归方程 y=
3115. 2x - 2. 6087, r
2
= 0. 9999,槲皮素在 0. 01661—
1. 661μg范围内线性关系良好 , HPLC校准曲线如图
1所示。
3. 2　精密度试验
取 3. 324μg· mL- 1的对照品溶液 ,按照含量测
定方法连续进样 5次 ,每次 10μL,得到峰面积 ,计算
得出 RSD= 1. 6% (n= 5) ,说明精密度试验结果良
好。
3. 3　重现性试验
取绵竹采样品 ,按供试品溶液的制备方法分别处理成 5份 ,每份依次进样 10μL,测得峰面积的
1501第 6期 张悦等: HPLC分析四川不同产地珙桐叶槲皮素的含量
RSD= 3. 8% (n= 5) ,表明该方法重现性较好。
3. 4　稳定性试验
取绵竹采样品 ,按 2. 3项方法制备供试品溶液 ,分别在 0, 4, 8, 16, 24h进样 10μL,记录峰面积 ,
计算出峰面积的 RSD= 4. 5% (n= 5) ,表明供试品溶液在 24h内稳定。
3. 5　加标回收试验
准确称取已知含量的绵竹采样品 2. 0000± 0. 0002g共 5份 ,分别准确加入槲皮素对照品母液
1 mL,依 2. 3项供试品溶液的制备方法处理 ,按上述色谱条件进样测定 ,计算得出平均回收率为
96. 6% , RSD= 1. 0% (n= 5)。回收率试验结果良好 ,结果见表 1。
表 1　珙桐叶片中槲皮素的加样回收率
称样量 ( g ) 样品中含量 (μg) 加入量 (μg) 测得量 (μg) 回收率 (% ) 平均值 (% ) RSD(% )
1. 9998 86. 01 332. 4 407. 29 96. 7
2. 0001 86. 36 332. 4 407. 51 96. 6
2. 0002 88. 83 332. 4 414. 41 97. 9 96. 6 1. 0
2. 0001 86. 24 332. 4 402. 39 95. 1
2. 0002 89. 05 332. 4 410. 95 96. 8
3. 6　样品测定结果
3. 6. 1　色谱图
样品按照 2. 4的方法处理后进样 ,槲皮素与样品中其他成分分离良好 ,与对照品对比色谱图如
图 2所示。 1号峰为槲皮素的色谱峰 ,保留时间为 8. 7min。
图 2　槲皮素对照品及珙桐叶提取物色谱图
A—— 槲皮素标品 ;B—— 绵竹珙桐样品 ; 1——槲皮素。
3. 6. 2　样品的测定
取不同产地的珙桐叶粉 ,按 2. 4项方法操作 ,每个样品提取 3份 ,得各供试品溶液。进样体积设
为 10μL,测定峰面积 ,带入回归方程计算含量 ,取 3次测定结果的平均值 ,结果见表 2。
表 2　不同产地采样品槲皮素含量测定结果 (n= 3)
样品来源 称样量 ( g) 色谱峰面积 ( m Au) 含量 (μg)
绵竹 2. 0001 107. 04 87. 99
宝兴 2. 0002 104. 24 85. 75
峨眉 2. 0000 127. 65 104. 53
雷波 2. 0001 185. 69 151. 11
1502 光谱实验室 第 26卷
4　结论
植物中常含有水解苷类的酶 ,在提取此类化合物时一定要使酶失活 [9 ]。 本研究做了索式提取、
微波提取和超声辅助提取 3种方法的比较 ,以及甲醇、乙醇不同溶剂对黄酮类物质提取的影响。 结
果发现甲醇与乙醇提取效果相当 ,微波提取效率最高。接着在微波条件下进行了四因素三水平的优
化 ,确定了最佳提取方案。 以乙腈-0. 02%磷酸水溶液 ( 30∶ 70)作为流动相可使槲皮素与其他成分
得到良好的分离 [10, 11 ]。
本研究系首次将 HPLC应用到珙桐叶黄酮化合物含量的测定 ,建立了珙桐叶中槲皮素这种黄
酮化合物含量的高效液相分析方法。 分析得出四川省内 4个较有代表性的地区珙桐叶片槲皮素含
量在 85. 75— 151. 11μg /g之间 ,雷波麻咪泽保护区的珙桐叶槲皮素含量比其他三地的含量略高 ,造
成该地区含量较高的原因有待于进一步从环境因子、分子水平等方面进行详细的研究。本研究数据
与牟新利等的研究结果有一定的差异 ,一方面可能是实验材料采集的时间和地点不一样造成的 ;另
一方面与实验方法有关 ,他以芦丁为对照品 ,用硝酸铝显色法测定的珙桐叶黄酮化合物含量值偏
高 [12 ]。已有大量研究显示硝酸铝显色法测得的数据比 HPLC得到的数据偏大 [ 13] ,故本研究实验数
据更加真实可靠。 该结果为珙桐药理化学等方面的后续研究奠定了一定的基础。
参考文献
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Analysis of Quercetin inDavidia involucrata in the Different Areas
in Sichuan Province by HPLC
ZHANG Yue
a ,b　 SU Zhi-Xianb　 LUO Ming-Huab　 HU Jin-Yaob　 ZOU Li-Juanb　 PAN Wen-Huib ,c
a( Sichuan Provincial Key Laborator y of Environmental Science and Biodiversity Conservation,
China West N ormal University , Nanchong , Sichuan 637002,P . R. China )
b( Sich uan Provincial Key Laborator y of Ecolog y and Environmental Technolog y ,Mianyang , Sichuan 621000, P. R. China )
c( Key laboratory for Molecular Biolog y and Bio pharmaceuticals, Mianyang , Sichuan 621000, P. R. China )
Abstract　 The content of flavonoids-quercetin in the Davidia invol_ crata leaves in the different
areas in Sichuan province was determined by HPLC. The analytical column was TC-C18
( 4. 6mm× 250mm , 5μm); acetonit rile - 0. 02% phosphate buffer ( 30∶ 70) was used as mobi le phase
w ith f low rate 1mL· min- 1 . The detected w avelength was 360nm. The average analytical recovery of
quercetin is 96. 6% , and the method which is quick and simple wi th good repetition can be used for
quali ty cont rol. The highest content of the quercetin is in Lei Bo M amize protected area among the
four areas.
Key words　 Davidia Involucrate; Quercetin; Flav onoid; HPLC
1503第 6期 张悦等: HPLC分析四川不同产地珙桐叶槲皮素的含量