全 文 ：分子诊断与治疗杂志 2015 年 7 月 第 7 卷 第 4 期 J Mol Diagn Ther， July 2015， Vol． 7 No． 4
誗论 著誗
基金项目：2014 广东省大学生创新创业训练计划项目·广东药学院创新强校工程资助项目（201410573024）
作者单位：广东药学院药科学院，广东，广州 510000
★通讯作者：孔繁晟， E-mail：kmkfs＠163．com
响应面优化黄皮叶中的活性因子超声提取工艺及其
抗氧化活性研究
苏志鹏 孔繁晟★ 方宇洪 杨妙婷 刘欣 陈泽丹
［摘 要］ 目的 优化黄皮叶中活性因子总黄酮的超声提取工艺条件 ，并测定其抗氧化活性 。
方法 以乙醇体积分数、超声时间及料液比为影响因子 ，以黄皮叶总黄酮得率为评价指标 ，在单因素试
验基础上 ，采用响应面法优选黄皮叶总黄酮超声提取工艺 ，并测定黄皮叶总黄酮体外清除 1，1－二苯
基 －2－三硝基苯肼 （1 ， 1 -diphenyl - 1 -picryl hydrazyl ，DPPH ）自由基 、羟自由基和总抗氧化的活性 。
结果 黄皮叶总黄酮的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数 18％、超声时间 73 min、料液比 31∶1（mL ／ g）。
在此条件下，黄皮叶总黄酮得率达到（1．300 ± 0．006）％。 黄皮叶总黄酮得率大小的主次因素为乙醇体积
分数＞超声时间＞料液比 ， 其中超声时间与料液比因素之间的交互作用显著 。 黄皮叶总黄酮体外清除
DPPH 和羟自由基的 IC50 值分别为 0．282 mg ／ mL、1．152 mg ／ mL， 用三价铁还原抗氧化能力 （ferric-re-
ducing antioxidant power， FRAP）法测得 1 mg ／ mL 黄酮的 FRAP 值为 533．3 μmol ／ L。 结论 该所选
工艺合理、可行，可用于黄皮叶总黄酮的超声提取 ；三种测定方法均说明黄皮叶总黄酮在一定浓度下有
抗氧化活性。
［关键词］ 响应面分析法； 提取； 总黄酮； 黄皮叶； 抗氧化活性
Optimization of extraction technology from Clausena lansium leaves by response surface and their an-
tioxidant activity study
SU Zhipeng， KONG Fansheng★， FANG Yuhong， YANG Miaoting， LIU Xin， CHEN Zedan
（School of Pharmacy， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou， Guangdong， China， 510000）
［ABSTRACT］ Objective To investigate the extraction of active factors of total flavonoid from
Clausena lansium leaves by ultrasound and the antioxidant activity of flavonoid． Methods Compounds in-
Clausena lansium leaves were extracted by ultrasound under different levels of factors， such as alcohol con
centration， ultrasonic time and ratio between solid and solvent． Total flavonoids in the compounds were test-
ed． Extraction was optimized by response surface． The antioxidant activity against 1， 1-diphenyl-1-picryl hy-
drazyl（DPPH）， the antioxidant activity against hydroxyl radical ， and the total antioxidant activity were
investigated ． Results The optimum extraction conditions were 18％ volume fraction of ethanol， 73 min-
utes of ultrasonic time and 31∶1 of solid-to-solvent ratio （mL ／ g）． Under these conditions， the yield of total
flavonoid was （1．300 ± 0．006）％． The order for the factors of the yield of total flavonoid were volume frac-
tion of ethanol， ultrasonic time and solid-to-solvent ratio． The interaction between the ultrasonic time and sol-
id-to-solvent ratio was significant． The IC50 of the obtained total flavonoid against DPPH and the ion ofhy-
droxyl were 0．282 mg ／ mL and 1．152 mg ／ mL， respectively． The ferric-reducing antioxidant power （FRAP）
value of 1 mg ／ mL flavonoid was 533．3 μmol ／ L． Conclusion Optimization of extraction technology by
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黄皮［Clausena lansium （Lour．） Skeels］是芸香
科黄皮属植物，主要化学成分有香豆素类、卡巴唑
和酰胺生物碱类、黄酮等。 黄皮叶，性味属辛、苦、
平，可疏风解表，除痰行气，有治疗温病身热、咳嗽
哮喘、气胀腹痛、黄肿、疟疾、小便不利、热毒疥癞
等功效， 在民间常用于治疗急性黄疸型肝炎、感
冒、胃痛、疝气、牛臌胀、哮喘、高血脂等病症 ［1］。 此
外，黄小桃等 ［2］研究发现，黄皮叶有明显的治疗 2
型糖尿病的作用， 能促进胰岛 β 细胞的修复和生
长增殖，增加胰岛素分泌，对受损的胰岛功能具有
一定的改善作用， 可以缓解由于胰岛 β 细胞受损
而引起的高血糖症状。 广东地区是黄皮的一个较
大产地， 而目前对黄皮叶中黄酮类化合物的研究
鲜见报道。 从原料的易获得性和对资源综合利用
的角度出发， 本实验选择广东阳春地区的黄皮叶
为研究对象，旨在探讨乙醇－水浸提黄皮叶总黄酮
的提取工艺，并采用响应面法优化工艺条件，同时
采用体外实验测定其抗氧化活性， 以期为合理开
发和利用黄皮叶的功能性价值提供实验依据。
1 材料与方法
1．1 材料、试剂与仪器
黄皮叶， 于 2014 年 6 月份采集于广东阳春市
双滘镇的种植园，经我校中药学院腾希峰博士鉴定
为黄皮叶 ［Leaves of Clausena lansium （Lour．）
Skeels］，样品经干燥、粉碎处理；芦丁对照品（批号
12040302，纯度≥98％），购自成都曼思特生物科技
有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1， 1-diphenyl-
1-picryl hydrazyl， DPPH）（批号 A1415038）、三吡啶
三吖嗪 ［2， 4， 6-Tri （2-pyridyl）-s-triazine， TPTZ］
（批号 K1319026），分析纯，购自上海 Sigma 公司；
硫酸亚铁、氯化钠、氯化钾、30％过氧化氢溶液、水
杨酸、 亚硝酸钠、 无水乙醇等均为市售分析纯。
752N 型紫外可见光分光光度计（上海仪电分析仪
器有限公司）；JA2003 型电子分析天平 （上海恒平
科学仪器公司 ）；移液器 （大龙兴创实验仪器 （北
京）有限公司）；PHS-3D 型 pH 计（上海精密科学仪
器有限公司）；KQ-400DB 型台式数控超声波清洗
仪（东莞市科桥超声波设备有限公司）；粉碎机（温
岭市林大机械有限公司）。
1．2 方法
1．2．1 黄皮叶总黄酮的测定
1．2．1．1 对照品溶液的制备 精密称取 25．0 mg
芦丁对照品，加入 70％乙醇定容至 100 mL，得到
浓度为 0．25 mg ／ mL 芦丁标准溶液，作为对照品储
备液。
1．2．1．2 供试品溶液的制备 称取黄皮叶粉末样
品 1．0 g，置锥形瓶中，固定提取温度 50 ℃，料液比
为 40∶1（mL ／ g），提取时间 70 min，超声功率 360
W，乙醇体积分数 30％，超声提取后再进行减压过
滤，得到的滤液用 30％乙醇定容至 50 mL，即得。
1．2．1．3 测定方法及方法学考察 ［3］ 精密吸取芦
丁对照品储备液适量于 25 mL 容量瓶中 ， 加入
70％乙醇至 10．0 mL，再加入 5％亚硝酸钠溶液 1．0
mL，摇匀 ，放置 6 min；加入 10％硝酸铝溶液 1．0
mL，摇匀，放置 6 min；加入 4％氢氧化钠溶液 10．0
mL，再加入 70％乙醇定容至刻度线，摇匀，放置 15
min， 于 510 nm 下测定各浓度样品液的吸光度值
（absorbence， A），计算。 样品中黄酮含量测定：准
确移取 3．0 mL 的样品液于 25 mL 的容量瓶中，按
照上述方法测定吸光度。 根据标准曲线回归方程
计算总黄酮质量。 总黄酮得率计算公式为：
黄酮得率 ／ ％ ＝ CV ／ M×100％ （C 为提取液浓
度，g ／ mL；V 为提取液原始体积，mL；M 为黄皮叶
质量）
1．2．1．4 标准曲线的制备 精密吸取芦丁对照储
备液 0．0 mL、1．0 mL、2．0 mL、3．0 mL、4．0 mL、5．0
mL、6．0 mL 于 25 mL 容量瓶，按 1．2．1．3 项的测定
方法操作，以各样品液的浓度为横坐标，对应各样
品液的吸光度值为纵坐标制定标准曲线。
1．2．1．5 稳定性试验 取 1．2．1．2 项的供试品溶
液，按 1．2．1．3 项方法于 1 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48
h 时测定吸光度。 并计算其相对标准偏差。
1．2．1．6 重现性试验 准确称取黄皮叶 1．0 g，共
response surface is convenient and feasible．In some certain concentration of total flavonoids， all of the three
methods have showed the antioxidant activity of total flavonoids extracted from the Clausena lansium leaves．
［KEY WORDS］ Response surface methodology； Extraction； Total flavonoids； Clausena lansium
（Lour．） Skeels leaves； Entioxidant activity
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5份，按 1．2．1．2 项制备的供试品液 ，精密吸取 3．0
mL 于 25 mL 的容量瓶中，按 1．2．1．3 项方法操作，
平行试验，于 510 nm 波长处测定。
1．2．1．7 加样回收试验 准确称取丁对照品
100．0 mg，置于 100 mL 容量瓶中，以 30％乙醇超
声、溶解，并稀释至刻度，摇匀，得芦丁贮备液。 准
确称取黄皮叶粉末 1．0 g 各 5 份， 置于锥形瓶瓶
中，准确加入上述芦丁贮备液 10．0 mL，按 1．2．1．1
项方法操作， 精密量取 3．0 mL 按 1．2．1．3 项处理，
于 510 nm 波长处测定吸光度，计算回收率。
1．2．2 黄皮叶总黄酮提取工艺流程
取干燥的黄皮叶于粉碎机中粉碎， 将各试验
量与所需量溶剂混合，在不同条件下超声提取，然
后过滤浓缩。
1．2．3 黄皮叶总黄酮提取条件单因素试验
1．2．3．1 乙醇体积分数 准确称取黄皮叶 1．0 g
（经预实验黄皮叶取量为 1．0 g～2．0 g 时，所测定的
样品溶液吸光度在 0．2～0．8 之间，为便于实验的操
作与数据的处理分析等选用质量 1．0 g 的黄皮叶
粉末） 固定提取温度 50 ℃， 料液比为 30∶1（mL ／
g），超声提取时间 60 min，超声功率 360 W，考察
乙醇体积分数为 10％、20％、30％、40％、50％条件
下黄皮叶总黄酮得率。
1．2．3．2 提取温度 准确称取黄皮叶 1．0 g，乙醇
体积分数用 1．2．3．1 中的最优结果， 固定料液比为
30∶1（mL ／ g），超声提取时间 60 min，超声功率 360
W， 考察提取温度为 30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70
℃条件下黄皮叶总黄酮得率。
1．2．3．3 料液比 准确称取黄皮叶 1．0 g， 乙醇体
积分数用 1．2．3．1 中的最优结果 ， 提取温度用
1．2．3．2 中的最优结果，固定提取时间 60 min，超声
功率 360 W，考察料液比（mL ／ g）为 10∶1、20∶1、30∶
1、40∶1、50∶1 条件下黄皮叶总黄酮得率。
1．2．3．4 提取时间 准确称取黄皮叶 1．0 g，乙醇
体积分数用 1．2．3．1 中的最优结果 ， 提取温度用
1．2．3．2 中的最优结果，料液比（mL ／ g）用 1．2．3．3 中
挑选的结果，超声功率 360 W，考察提取时间为 40
min、50 min、60 min、70 min、80 min 条件下考察黄
皮叶总黄酮得率。
1．2．3．5 超声功率 准确称取黄皮叶 1．0 g，乙醇
体积分数用 1．2．3．1 中的最优结果 ， 提取温度用
1．2．3．2 中的最优结果，料液比（mL ／ g）用 1．2．3．3 中
的最优结果，提取时间用 1．2．3．4 中的最优结果，考
察超声功率为 200 W、240 W、280 W、320 W、360
W 条件下考察黄皮叶总黄酮得率。
1．2．4 响应面法优化总黄酮提取工艺条件的确定［4］
在单因素的试验的结果基础上， 考虑单因素
对总黄酮得率影响的显著性和实验条件的可行
性，固定总黄酮得率最高的温度（70 ℃）和超声功
率（320 W），选择乙醇体积分数、超声时间、料液比
为考察因素，分别用 X1，X2，X3 表示（下文同 ），并
且每个因素选择 3 个水平。 根据中心组合试验设
计原理， 采用三因素三水平的三元二次响应面分
析方法，优化黄皮叶中总黄酮的提取工艺。 试验水
平分别以-1，0，1 进行编码， 各因素与各水平编码
结果见表 1。
1．2．5 黄皮叶总黄酮的抗氧化活性试验
按照响应面分析确定的黄皮叶总黄酮提取最
佳条件进行提取最佳条件进行提取， 提取液浓缩
后经苯乙烯型弱极性共聚体的大孔树脂纯化 ，乙
醇洗脱（体积分数 50％），所得洗脱液旋转蒸发浓
缩低温烘干得黄皮叶总黄酮粗品。 配制适宜质量
浓度溶液进行抗氧化活性实验。
1．2．5．1 DPPH 自由基清除率活性的测定 ［5］ 配
制 DPPH 自由基溶液 0．20 mmol ／ L 及具有一定浓
度梯度 （0．12 mg ／ mL，0．24 mg ／ mL，0．36 mg ／ mL，
0．48 mg ／ mL，0．60 mg ／ mL） 的黄皮叶总黄酮样品
液。 取 2．0 mL 各浓度样品液于试管中，再各加入
2．0 mL DPPH 乙醇溶液（浓度为 0．20 mmol ／ L），混
合均匀，避光放置 30 min，用分光光度计在 517 nm
处测定其吸光度 Ai； 同时在相同实验条件下测定
2．0 mL DPPH 溶液与 2．0 mL 蒸馏水混合后的吸光
度 A0及 2．0 mL 各浓度样品液与 2．0 mL 无水乙醇
混合后的吸光度 Aj，按下式计算清除率：
X1（乙醇体积分数 ／ ％）
X2（超声时间 ／ min）
X3（料液比 ／ mL ／ g）
－1
10
60
25∶1
0
20
70
30∶1
1
30
80
35∶1
编码水平
因素
表 1 试验设计因素和水平
Table 1 Factors and levels of experiment design
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清除率（％） ＝ ［1－（Ai－Aj） ／ A0］ × 100％
用软件 SPSS 19．0 计算出其清除率的 IC50，即
自由基被清除一半时所需的样品溶液的浓度。
1．2．5．2 羟自由基（·OH）清除活性的测定 参照
张黎明等 ［6］的方法。在 10 mL 试管中依次加入 6．0
mmol ／ L FeSO4 溶液 2．0 mL、不同质量浓度的总黄
酮样品液 2．0 mL、6．0 mmol ／ L 的 H2O2 溶液 2．0
mL，摇匀静置 10 min，再加入 6．0 mmol ／ L 的水杨
酸溶液 2．0 mL，摇匀，静置 30 min 后于 510 nm 处
测其吸光度 A，用软件 SPSS 19．0 计算出其清除率
的 IC50。 清除率计算公式为：
清除率 Y ／ ％ ＝ ［1－（Di－Dj） ／ D0］ × 100（D0 为空
白对照；Di 为某质量浓度黄酮类组分的吸光度；Dj
为无水杨酸时的吸光度）
1．2．5．3 三价铁还原抗氧化能力 （ferric-reducing
antioxidant power， FRAP）值法总抗氧化能力的测
定［7－8］ 标准曲线制作：将醋酸-醋酸钠缓冲液（pH＝
3．6，300 mmol ／ L）、10mmol ／ L TPTZ （40 mmol ／ L
HCL 溶液配制） 和 20 mmol ／ L FeCL3 溶液按体积
10∶1∶1 配制而成 FRAP 试剂。 取浓度 0．2 mmol ／ L、
0．4 mmol ／ L、0．6 mmol ／ L、0．8 mmol ／ L、1．0 mmol ／ L
FeSO4 溶液各 150 μL， 分别加入 4．5 mL FRAP 试
剂，混匀后 37 ℃水浴条件下反应 10 min，测定 593
nm 处吸光值，制作标准曲线。
不同活性物质还原力的测定：经预实验，配黄
酮浓度为 0．5 mg ／ mL，1．0 mg ／ mL，1．5 mg ／ mL，2．0
mg ／ mL，2．5 mg ／ mL，各取 150 μL 按上述方法分析
测定，由标准曲线查得相同吸光值处对应的 FeSO4
浓度， 还原力用对应的 FeSO4浓度 μmol ／ L 表示。
双蒸水作为空白对照， 样品抗氧化能力（μmol ／ L）
FeSO4 ＝ 样品抗氧化能力-空白抗氧化能力。
2 结果
2．1 方法学的考察
2．1．1 标准曲线的制备
由试验结果得到总黄酮标准曲线方程为：Y＝
11．50X－0．0097，r＝0．9998，其中 Y 为样品液的吸光
度值，X 为样品液的浓度，r 为相关系数（correlation
coefficient）。 结果表明芦丁含量在 10 μg ／ mL～60
μg ／ mL 范围内与吸收值线性关系良好。
2．1．2 稳定性试验
试验结果的吸光度的相对标准偏差 （relative
standard deriation，RSD）＝1．040％。 表明样品显色后
48 h 内稳定性良好。
2．1．3 重现性试验
试验结果测得总黄酮的平均含量为 12．1mg ／ g
（RSD＝0．670％），表明本方法重现性良好。
2．1．4 加样回收试验
试 验 结 果 的 平 均 回 收 率 为 98％ （RSD ＝
1．160％），说明本测定法可行。
2．2 乙醇-水提取条件选择
乙醇体积分数，提取温度，料液比，提取时间，
超声功率对黄皮叶总黄酮得率影响的结果分别如
图 1 所示 。 由图 1（A）知 ，随乙醇体积分数的增
大， 黄皮叶总黄酮得率呈先升后降的趋势。 当乙
醇体积分数为 20％时，总黄酮得率最高。 说明黄
皮叶中黄酮苷类等水溶性较好的黄酮类物质含量
较高。由图 1（B）知，当温度从 30 ℃升至 70 ℃时，
总黄酮得率显著增加，在 70 ℃达到最大值，其可
能与升高温度，加快黄皮叶中总黄酮的溶出有关。
由图 1（C）知，当料液比从 10∶1 增加至 30∶1（mL ／
g）时，总黄酮得率增加，在 30∶1 时达到最大值。 继
续升高料液比，总黄酮得率反而下降，可能是料液
比增加使杂质溶出增多和影响超声效果， 从而降
低黄皮叶中总黄酮的溶出与扩散。 由图 1 （D）可
知，在 70 min 内，总黄酮的得率随提取时间的延长
而增加，提取时间为 70 min 时，总黄酮得率最大。
继续延长提取时间，黄酮得率下降。 可能是过长时
间的加热使黄皮叶中总黄酮氧化变性。 超声功率
对黄皮叶中总黄酮的得率影响见图 1 （E），320 W
内，超声功率升高，黄皮叶中总黄酮得率升高。 超
声功率为 320 W 时 ，总黄酮得率最高 ，继续升高
超声功率，总黄酮得率下降，可能与过高的功率导
致黄酮苷类化合物苷键断裂等有关。 综合以上因
素，确定进行响应面分析的各因素考察范围为乙醇
体积分数 10％～30％，料液比为 25∶1～35∶1（mL ／ g），
超声时间 60 min～80 min。 固定提取温度 70 ℃，超
声功率 320 W。
2．3 黄皮叶总黄酮提取工艺优化
根据单因素试验结果， 采用 3 因素 3 水平设
计 Box-Benhnken 试验中心组合试验，响应面分析
方案及结果见表 2。 利用 Design-Expert．V8．0．6 软
件对表 2 试验数据进行多元回归拟合， 得到总黄
酮得率响应值的回归方程为 ：Y＝1．30－0．022X1＋
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A：乙醇体积分数； B：提取温度； C：料液比； D：提取时间； E：超声功率
图 1 各因素对总黄酮得率的影响
Figure 1 Effects of the factors on the extraction yield of total flavonoids
A B C
D E
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
X1（乙醇体
积分数 ／ ％）
10
30
20
20
10
20
20
30
20
10
20
20
10
30
30
20
20
X2（超声
时间 ／ min）
80
80
60
70
70
80
70
70
70
70
70
80
60
60
70
70
60
X3（料液比 ／
mL∶g）
30：1
30：1
25：1
30：1
25：1
25：1
30：1
35：1
30：1
35：1
30：1
35：1
30：1
30：1
25：1
30：1
35：1
1．24
1．21
1．19
1．29
1．18
1．19
1．31
1．18
1．30
1．25
1．29
1．24
1．21
1．16
1．15
1．29
1．17
实际值
试验
编号
Y（总黄酮
得率 ／ ％）
表 2 黄皮叶总黄酮得率响应面方案及结果
Table 2 Designs and results of the extraction of total
flavonoids
0．019X2 ＋0．016X3 ＋（5．00 ×10 －3）X1X2 －0．010X1X3 ＋
0．018X2X3－0．049X12－0．042X22－0．057X32。
上述回归方程的方差分析结果见表 3。 由表 3
可知 ：模型 P＜0．0001 （显著 ），失拟项 P＝0．1717＞
0．05（不显著），说明方程对实验有较好的拟合性，
实验误差较小 。 相关系数 r＝0．9892 和调整系数
（adjustment coefficient，Adj）R2＝0．9510 也表明模型
拟合程度较好。 变异系数（coefficient of variation，
CV）为 0．9700％，说明模型的重现性很好，该模型
可用于黄皮叶总黄酮提取的工艺条件。 从上表各
因素显著性水平可知， 对黄皮叶总黄酮得率的影
响次序为：乙醇体积分数 X1＞超声时间 X2＞料液比
X3。 且乙醇体积分数 X1的二次项，料液比 X3的二
次项对总黄酮得率的影响极显著（P＜0．001）；乙醇
体积分数 X1，超声时间 X2，料液比 X3，超声时间的
二次项对总黄酮得率的影响均显著（P＜0．010）；超
声时间 X2 和料液比 X3 的交互项（X2X3）对总黄酮
得率的影响具有统计学意义（P＜0．050）。
根据回归方程得出不同因子的响应面和等高
线结果见图 2。 图 2（A）表示乙醇体积分数和超声
时间的交互作用对黄皮叶总黄酮得率的影响。 从
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方差来源
模型
X1
X2
X3
X1X2
X1X3
X2X3
X12
X22
X32
残差
失拟项
纯误差
总和
平方和
0．045
4．050 × 10－3
2．813 × 10－3
2．113 × 10－3
1．000 × 10－4
4．000 × 10－4
1．225 × 10－3
0．010
7．339 × 10－3
0．014
9．950 × 10－4
6．750 × 10－4
3．200 × 10－4
0．046
R2 ＝ 0．9786
自由度
9
1
1
1
1
1
1
1
1
1
7
3
4
16
Adj．R2 ＝ 0．9510
CV％ ＝ 0．970
均方
5．044 × 10－3
4．050 × 10－3
2．813 × 10－3
2．113 × 10－3
1．000 × 10－4
4．000 × 10－4
1．225 × 10－3
0．010
7．339 × 10－3
0．014
1．421 × 10－4
2．250 × 10－4
8．000 × 10－5
F 值
35．48
28．49
19．79
14．86
0．70
2．81
8．62
71．85
51．63
95．40
2．81
P 值
＜ 0．0001
0．0011
0．0030
0．0063
0．4293
0．1373
0．0218
＜ 0．0001
0．0002
＜ 0．0001
0．1717
显著性
觹觹觹
觹觹
觹觹
觹觹
觹
觹觹觹
觹觹
觹觹觹
表 3 回归统计分析结果
Table 3 Results of regression analysis
觹：表示 P ＜ 0．050； 觹觹：表示 P ＜ 0．010； 觹觹觹：表示 P ＜ 0．001
图 2（A）可以看出，乙醇体积分数、超声时间对得
率的影响都是明显的， 但它们的交互作用并不明
显（P＝0．4293）；图 2（B）表示乙醇体积分数和料液
比的交互作用对得率的影响。 其响应面图曲面陡
峭，等高线图呈椭圆形。 由此可知，乙醇体积分数
和液料比对得率的影响是明显的；图 2（C）表示超
声时间和料液比的交互作用对得率的影响。从图 2
（C）可以看出，超声时间和料液比对得率的影响明
显，且超声时间和料液比的交互作用显著。 当超声
时间较低时，得率随料液比的提高变化不大；当超
声时间在 70 min～73 min 时，得率随料液比的增加
变化明显，且能达到最大值。
通过软件 Design-Expert V8．0．6 软件分析得黄
皮叶总黄酮的最佳提取条件： 当乙醇体积分数为
17．63％、超声时间 72．53 min、液料比 31．01∶1（mL ／
g）、提取温度 70℃、超声功率 320W 时，黄皮叶总
黄酮得率预测可达到最大值 1．302％。 考虑到实际
操作的可行性，将上述最优提取条件修正为乙醇体
积分数为 18％、 超声时间 73 min、 料液比 31∶1
（mL ／ g）、 超声功率 320W。 以此同取黄皮叶粉末
1．0 g，进行 3 次重复试验，黄皮叶总黄酮得率平均
值为（1．300±0．006）％，与预测值 1．302％基本一致，
说明了此响应面法得到的回归模型具有较好的可
靠性。
2．4 黄皮叶总黄酮的抗氧化活性分析
2．4．1 对 DPPH 自由基的清除效果
不同浓度下黄酮、 对 DPPH 自由基的清除率
如表 4 所示，可知随着黄酮浓度的增加，对自由基
的清除率逐渐增大， 当浓度为 0．60 mg ／ mL 时，其
清除率为 78．97％； 总黄酮提取物的 IC50 为 0．28
mg ／ mL， 说明黄皮叶总黄酮类在一定浓度条件下
对 DPPH 自由基具有一定的清除能力。
2．4．2 对·OH 自由基的清除效果
不同浓度下黄酮对·OH 的清除率如图 4 所
示，随着黄皮叶总黄酮质量浓度的增加，对·OH 的
清除率均逐渐增大，其 IC50 为 1．152 mg ／ mL，说明
黄皮叶中的黄酮类成分在一定浓度条件下对·OH
的清除具有清除能力。
2．4．3 FRAP 值法总抗氧化能力的测定
由试验结果求得三价铁还原抗氧化能力的线
性回归方程 y＝0．0006x－0．0143，相关系数 r＝0．9986。
其表明 FeSO4浓度在 0 μmol ／ L～1 200 μmol ／ L 范围
内与吸光度有良好的线性关系。 不同浓度黄酮的
还原能力如表 5所示， 由图 5可知， 随着浓度的
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A： 超声时间和乙醇体积分数； B： 乙醇体积分数和料液比； C： 超声时间和料液比
图 2 各因素对得率的响应面分析
Figure 2 Interactive effects of the factors on respond surface method analysis
A
B
C
表 4 DPPH 法测定黄皮叶总黄酮抗氧化能力
Table 4 DPPH assay for estimating antioxidant capacity from
the flavonoids of Clausena lansium leaves
浓度（mg ／ mL）
清除率（％）
IC50（mg ／ mL）
0．12
20．87
0．24
41．17
0．2820
0．36
59．15
0．48
71．51
0．60
78．97
逐渐增加 ， FRAP 值 越高 ，即 其 还原能力也逐
渐增加 ［9］，并呈现出一定的相关性（r＝0．9987）。
3 讨论
黄酮是一类在植物界中分布广泛、 具有多种
生物活性的化合物，经研究发现，天然来源的生物
黄酮具有分子量小，能被人体迅速吸收，有明显的
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抗衰老、抗菌抗氧化、降血脂、降血糖、抗癌防癌及
调节免疫功能的作用 ［10－11］。 黄酮含量的测定方法
有紫外-可见分光光度法和高效液相色谱法等。 本
实验采用了紫外-可见分光光度法，该法线性、重现
性和稳定性良好，操作简便、可行。 响应面法作为
一种有效的试验设计方法， 近年来不断地应用于
中药提取工艺的优化 ［12］。 因它可进行多因素、多水
平以及各因素的交互作用研究， 并根据综合指标
得到最优化的工艺结果， 所以这种方法显示出较
其他设计方法有明显的优势。 本实验采用响应面
法优化超声辅助提取黄皮叶总黄酮的工艺， 以总
黄酮提取率为指标， 考察提取过程中乙醇体积分
数，超声时间，和料液比对指标的影响。 其中超声
时间与料液比因素之间的交互作用显著。 利用响
应面法得到的黄皮叶总黄酮提取工艺参数真实 、
可靠，具有实用价值。
由实验结果可知，黄皮叶总黄酮在一定浓度条
件下对·OH，DPPH 自由基均具有清除作用， 其清
除率随质量浓度的增加而增大、具有一定的量效关
系 ， 所得的 IC50 分别为 1．152 mg ／ mL，0．282 mg ／
mL，甚至比名贵中药，如：铁皮石斛多酚和黄铜的
抗氧化性要好 ［13］ （氯仿层提取物的·OH，DPPH 自
由基的 IC50 分别为 1．589 mg ／ mL，0．394 mg ／ mL）。
抗氧化物质的抗氧化活性主要表现在抑制脂质氧
化降解、清除自由基、抑制促氧化剂（如螯合过渡金
属）、 还原性或者促进机体产生内源性抗氧化物质
［如抗超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，
SOD）， 触媒 （cata-lase， CAT）， 谷胱甘肽（Glu-
tataione， GSH）］等几方面 ［14－15］。 用化学反应法测定
抗氧化活性的方法有很多，大多数方法仅是对某一
种自由基的清除活。 铁离子还原法（FRAP）法利用
Fe3＋被还原成 Fe2＋， 从而使其与三吡啶三吖嗪 ［2，
4， 6-Tri（2-pyridyl）-s-triazine， TPTZ］形成的复合
物吸光度发生变化这一原理来测定样品的抗氧化
活性，不是针对某一种自由基的清除活性，而是反
映总的抗氧化活性。 黄小桃等 ［2］研究发现黄皮叶具
有治疗糖尿病的作用，并能有效提高糖尿病大鼠血
清的抗氧化作用，改善活性氧自由基代谢紊乱。 而
Ma 等 ［16］研究发现黄皮叶具有降血糖 、抗氧化活
性，同时张福平等 ［17］也发现黄皮叶中黄酮具有良好
抗氧化活性。因此根据本试验结果提示这可能与黄
皮叶中黄酮有关，值得进一步深入研究，如对黄皮
叶总黄酮提取物进行纯化和分离，进一步确定其中
的抗氧化有效成分结构，进行体内活性试验等。
现有研究表明， 黄皮叶主要化学成分为氨基
酸、多糖及多种黄酮类等化合物。 所以，研究黄皮
叶中黄酮类化合物的提取工艺及活性的作用，对
充分、综合利用该物具有积极意义，且黄皮叶原料
较丰富、总黄酮含量较高、黄皮叶总黄酮类清除自
图 4 黄皮叶总黄酮对羟自由基的清除效果
Figure 4 Scavenging capacity of total flavonoids extracted
from Clausena lansium leaves for hydroxyl free radicals
图 5 黄皮叶总黄酮浓度与还原能力的相关性
Figure 5 Relevance between total flavonoid extracted from
Clausena lansium leaves and reducing ability
表 5 黄皮叶总黄酮 FRAP 法还原能力的测定结果
Table 5 Determination of total flavonoids in Clausena
lansium leaves FRAP reduction ability
浓度（mg ／ mL）
吸光度
FRAP 值（μmol ／ L）
0．5
0．26
283．3
1．0
0．41
533．3
1．5
0．60
845．0
2．0
0．81
1183．0
2．5
0．99
1500．0
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由基能力较强、 黄酮化合物又具有多种生理活性
功能，值得深入开发利用研究。
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