全 文 ：亮菌多糖提取中脱蛋白和脱色方法比较＊
黄 纯 ,马 驰 ,宋慧智 ,李甜甜
中国药科大学高等职业技术学院 , 镇江 212003
摘 要 目的:探讨亮菌多糖提取过程中的脱蛋白和脱色方法 。方法:以蛋白质脱除率和多糖保留率为考察指标 , 比
较 Sevage法 、氯化钠法 、氯化钙法 、三氯乙酸法及盐酸法脱蛋白效果。以色素脱除率作为考察指标 , 比较过氧化氢和活性炭
的脱色效果。结果:Sevage法脱蛋白效果较好且多糖得率最高;过氧化氢的脱色效果优于活性炭。结论:确定 Sevage法和
过氧化氢法为亮菌多糖提取的脱蛋白和脱色的方法。
关键词 脱蛋白;脱色;亮菌多糖
中图分类号 R965.1 文献标志码 文章编号 1673-7806(2007)01-45-02
＊基金项目 中国药科大学校青年教师科技基金(编号:D0510)
作者简介 黄纯 ,女 ,讲师 Tel:0511-4448673
Studyondeproteinizationanddecolorationin
extractionofArmilarielapolysaccharide
HUANGChun, MAChi, SONGHui-zhi, LITian-tian
SchoolofAltitudeVocational, ChinaPharmaceuticalUniversity, ZhenjiangJiangsu212003, China
Abstract Objective:ToinvestigatethemethodondeproteinizationanddecolorationinextractionofArmilariel-
lapolysaccharide.Methods:Theefectofdeproteinizationwithdiferentmethods(suchasSevage, Sodium
chloride, Calciumchloride, TCAandHydrochloricacid)wereevaluatedintermsoftheratioofproteinremoving
andpolysaccharideholding, andthedecolorationefectofhydrogenperoxide(H2O2)oractivatedcarbonwas
alsocalculated.Results:ThedeproteinizationefectwasoptimalwithSevagemethodandH2O2 alsoachievea
highdecolorationrate.Conclusion:SevagemethodandH2O2 couldbeusedforextractionofArmilarielapoly-
saccharide.
Keywords Deproteinization;Decoloration;Armilarielapolysaccharide(ALP)
亮菌学名白蘑科假密环菌 (Armilarielata-
bescens(Scop.EX.Fr)Sing)经专家鉴定为一种真
菌 。 20世纪 60年代从江苏省丹徒县一棵发光的
老柳树中分离得到 ,故形象地称之为亮菌[ 1] 。经
科学家多年的研究 ,发现亮菌菌体中含有多种生物
活性成分———亮菌多糖 、多肽 、氨基酸 、亮菌甲素 、
亮菌乙素 、亮菌丙素等。目前 ,未见国内外对亮菌
多糖的系统研究 ,对其种类 、结构 、功能亦未有深入
的探讨 ,亮菌多糖的药理作用还有待于进一步研
发;而完成这些任务的前提是建立和完善亮菌多糖
的纯化方法 、获得较高纯度的亮菌多糖。本实验系
对亮菌多糖 (Armilarielapolysaccharide, ALP)提
取过程中脱蛋白和脱色工艺进行了探索;确定
Sevage法为亮菌粗多糖提取的脱蛋白方法;过氧化
氢法为亮菌粗多糖提取的脱色方法 。
1 仪器与试剂
722型分光光度计(上海第三分析仪器厂)。
亮菌菌粉(无锡百方吉生物科技有限公司);
小牛血清蛋白 (南京生光生物技术有限公司);考
马斯亮蓝 G-250 (华美生物技术有限公司);硫酸 、
苯酚 、葡萄糖 、30%H2O2、活性炭(市售 ,药用级);
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药学与临床研究 2007年第 15卷第 1期
DOI :10.13664/j.cnki.pcr.2007.01.013
所用试剂均为分析纯 。
2 方法与结果
2.1 亮菌粗多糖的提取步序
亮菌菌粉※热水提取※离心※上清液浓缩※
脱蛋白※脱气※透析※脱色※醇沉※无水乙醇 、丙
酮洗涤※真空干燥※ALP粗品
2.2 亮菌粗多糖脱蛋白方法比较
采用 5种方法分别对亮菌菌粉热水提取液进
行脱蛋白。脱蛋白方法:
(1)Sevage法:向浓缩液中加入其体积 1/5的
氯仿和 1 /5的正丁醇 ,振摇 30 min, 离心取上清
液 ,重复以上操作 5次 。
(2)氯化钠法:沸腾状态下调浓缩液 pH值 9
～ 10,加入氯化钠使终浓度为 5%(w/v),搅拌 ,煮
沸 30 min,冷却至室温 ,离心 。
(3)氯化钙法:调浓缩液 pH值 8 ～ 9,加热至
85℃,加氯化钠使其浓度为 5%(w/v),搅拌 ,冷却 ,
离心[ 2] 。
(4)三氯乙酸法(TCA法):浓缩液置冰水浴中
加入等体积 5%三氯乙酸 ,搅拌 10min, 4℃放置
4 h,调 pH值至中性 ,浓缩至原体积 ,离心 ,取上清
液重复以上操作 2次 。
(5)盐酸法:向浓缩液中逐滴加入 2 mol·L-1
的盐酸溶液 ,调 pH值为 3, 4℃放置 12h,离心 。
各方法中脱蛋白试剂的最佳加入量通过单因
子试验获得。脱蛋白后按 “ 2.1”项下流程操作。
蛋白质含量和糖含量测定分别采用 CBG250染料
结合法和苯酚硫酸法 。结果见表 1。
表 1 不同方法脱蛋白效果比较(n=2)
Table1 Comparisonofdifferenttechniquesfordeproteinization
脱蛋白方法 糖含量(%)
蛋白质含量
(%)
蛋白脱除率
(%)
糖保留率
(%)
Sevage法 67.55 2.43 91.2 34.53
氯化钠法 46.15 16.49 32.76 6.23
氯化钙法 60.56 2.12 92.3 21.62
三氯乙酸法 67.42 1.78 93.5 20.18
盐酸法 60.91 1.16 95.7 19.26
由表 1可知 ,除氯化钠法外 ,其余 4种方法的
蛋白质脱除率相近。糖保留率由高到低的顺序是:
Sevage法 、氯化钙法 、三氯乙酸法 、盐酸法 、氯化钠
法 。Sevage法的糖保留率明显高于其它方法 。
2.3 亮菌粗多糖脱色方法比较
对亮菌粗多糖水溶液在 360 nm～ 600 nm波
长范围内进行扫描 ,发现溶液在可见光区无最大吸
收峰 ,而从 360 nm到 600nm吸收呈递减趋势 。
由于 ALP溶液为橙黄色 ,从互补色角度考虑 ,选择
蓝光的波长中间段 450 nm作为检测波长。
2.3.1 过氧化氢法
向脱蛋白液中分别加入终浓度为 3%、5%、8%
的 H2O2 , 60℃保温脱色 30min,加热驱除 H2O2 ,以
高锰酸钾溶液作为检测试剂 ,浓缩至原体积后测定
吸光度。脱色率分别为 68.3%、85.4%、78.0%。
2.3.2 活性炭法
向脱蛋白液中分别加入终浓度为 3%、5%、
8%的活性炭 , 80℃保温脱色 3h,滤去残渣后补水
至原体积后测定吸光度 。脱色率分别为 17.1%、
43.1%、20.6%。实验结果表明 , H2O2 脱色效果
优于活性炭 ,且 H2O2浓度为 5%时脱色效果最好 。
3 讨 论
3.1 对 5种脱蛋白方法进行比较 , Sevage法蛋白
质脱除率较高 , 且其糖保留率最高 ,故确定其为亮
菌粗多糖提取工艺的脱蛋白方法;但该法也存在明
显的缺陷 ,即所用试剂氯仿具有毒性。氯化钙法因
成本低廉 、操作简单 、脱蛋白效果及糖保留率尚可 ,
在工业生产中较有优势 。三氯乙酸法和盐酸法脱
蛋白效果虽较好 ,但糖保留率低 ,且存在多糖水解
的缺点 ,因而不宜采用。
3.2 过氧化氢的脱色原理是其在受热和光照条件
下迅速分解 , 产生初生态氧而破坏有色物质 [ 3] 。
试验结果表明 ,过氧化氢的脱色效果优于活性炭 。
本实验用加热的方法驱除过氧化氢 ,并以高锰酸钾
溶液作为检测试剂判断过氧化氢有无残留 ,方法简
便易行。多糖的进一步分离纯化往往采用离子交
换色谱法 ,色素的残留会对离子交换树脂产生毒
害。用过氧化氢脱色处理后的 ALP为浅黄色 ,色
素明显减少 ,对进一步分离纯化非常有益 。
参考文献
[ 1] 江苏省 “亮菌 ”科研协作组微生物小组.假密环菌的研究
[ J] .微生物学报 , 1974, 14(1):5-8.
[ 2] 刘光铨 ,江南生.果脯生产中废糖液的澄清与脱色研究 [ J] .
云南工业大学学报 , 1995, 11(4):28-31.
[ 3] 朱越雄 ,石 亮 ,曹广力.野生树舌多糖的脱色和脱蛋白 [ J] .
氨基酸和生物资源 , 2005, 27(3):1-3.
(收稿日期 2006-8-18)
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PharmaceuticalandClinicalResearch 2007 Vol.15 No.1