全 文 ：1999-09-09收到 , 1999-12-27接受。
霍英东教育基金和广东省自然科学基金(980163)资助项目。
＊通讯作者。
草酸对黄瓜根中铁还原的促进作用
张锦鹏　彭新湘＊　李明启
(华南农业大学生物技术学院分子植物生理研究室 ,广州 510642)
摘要:用黄瓜为材料 , 研究了草酸对植物根切段还原
Fe(Ⅲ)EDTA 的促进作用。在 2～ 14 mmol/ L范围内随
着草酸浓度的加大 , 其促进作用不断提高;在 4 h 内随
着反应时间的推移 , Fe(Ⅲ)EDTA的还原量成线性上升
趋势。进一步用完整根 、粗酶提取液和提纯的质膜证
明:促进作用并非草酸本身作为电子供体直接或间接
地加速了铁还原反应 , 而是形成的草酸铁螯合态是根
中铁还原酶更有效的底物。整体根还原草酸铁的活力
和质膜铁还原酶催化草酸铁的效率(Vmax/ Km)都远大
于还原柠檬酸铁和 Fe(Ⅲ)EDTA的活力和效率。
关键词:草酸 , 铁还原 ,黄瓜根
学科分类号:Q945
　　根系分泌有机酸在植物铁素营养中的作用越
来越受到人们的关注 。有机酸一方面可螯溶土壤
中难溶性铁氧化物 , 与 Fe3+形成相对稳定的 Fe
(Ⅲ)-有机酸复合物 ,通过扩散作用到达根系表面 ,
利于根中铁还原酶的作用;另一方面还可作为根际
微生物利用的碳源 ,经过微生物的代谢活动建立起
还原性的微环境而提高土壤铁对根系的可给性
(Lindsay 1991)。对双子叶植物和非禾本科单子叶
植物(机理 I植物)而言 ,三价铁还原成二价铁是铁
素进 入 细 胞 的 必 要 环 节 (Chaney 等 1972 ,
Brǜggemann等 1993),可见铁还原在植物对铁素吸
收 、转运和再分配等过程起着至关重要的作用 。
草酸作为最简单的双羧酸 ,在植物体内和根分
泌物中普遍存在(彭新湘和李明启 1992 , Libert和
Vincent 1987 ,Strom等 1994)。杨荣金等(2000)发现
用草酸涂抹黄瓜叶片时可大大提高其内源 Fe2+的
含量;Macur等(1991)的研究也表明草酸可以促进
动物铁蛋白的光还原 。本文报告草酸对黄瓜根中
铁还原的促进作用及其机理。
1　材料与方法
1.1　材料培养和处理
以黄瓜(Cucumis sativus L.)品种特选长春密刺
为供试材料。挑选大小均匀的黄瓜种子用0.1%
HgCl2 溶液灭菌 5 min ,洗净后转入培养皿内预发芽
3 d(28℃),然后移栽至土盆或溶液培养。待长至
3片真叶后取样测定黄瓜根的铁还原活性 。溶液
培养时 ,先将催过芽的种子播于盛有蛭石的瓦盆
内 ,每天浇适量的 1/2 Hoagland 营养液 。待第一片
真叶完全展开后移入盛有 10 L 营养液(1/2
Hoagland)的塑料盆内(26 cm×34 cm×13 cm)。每
盆种 12株 ,用气泵向营养液中持续供气 。在网室
内自然光下正常培养 6 ～ 8 d后 ,更新营养液同时
进行缺铁处理[不加 Fe(Ⅲ)EDTA ,以加 20 μmol/L
Fe(Ⅲ)EDTA的为对照] 。营养液一律用去离子水
配制 ,初始 pH 值调至 6.0 ～ 6.2 ,每天添加适量蒸
馏水以补充因蒸腾损失的营养液中的水分 。
1.2　铁还原活性测定
用根切段测定铁还原活性:参考 Steven 等
(1990)方法并加以修改。称取土培黄瓜根切段
0.2 g(根长 1 cm),放入盛有 5 ml预反应液的试管
内 ,预反应液含 HEPES-KOH 10 mmol/L (pH 6.0)、
邻二氮杂菲 1 mmol/L 、不同浓度的草酸(pH 值都调
为 6.0 ,对照中不加),在 30℃恒温水浴内避光保温
5 min ,然后加入Fe(Ⅲ)EDTA(终浓度 100 μmol/L)
启动反应 ,不同时间点取反应液在 510 nm 下比色
测定 。每次测定设 3个取样重复。铁还原活性单
位是μmol Fe2+ g-1 DW h-1。
用完整根测定铁还原活性:参考 Steven 等
(1990)方法并加以修改。取水培黄瓜完整植株 ,
用蒸馏水把根系残留营养液清洗干净 ,轻轻吸干水
珠后 ,迅速将根部浸没在 50 ml反应液中 , 反应液
含HEPES-KOH 10 mmol/L(pH 6.0)、邻二氮杂菲 1
mmol/L。平衡 5 min 后加入 Fe(Ⅲ)-螯合物(终浓
度100 μmol/L)启动反应 ,室温(28 ～ 30℃)下反应
不同时间后取反应液在 510 nm下比色测定。每次
测定设 3个取样重复。盛反应液的三角瓶外壁用
铝箔包裹遮光 。铁还原活性单位是μmol Fe2+ g-1
DW h-1 。
311植物生理学报 , Acta Phytophysiologica Sinica　2000 , 26(4):311 ～ 316
1.3　根粗酶液 、细胞质膜的制备及其铁还原酶活
性测定
粗酶液提取参照焦新之等(1992)的方法略作
修改。取黄瓜新鲜根 2 g ,用 4 ml提取液于 4℃冰
浴中研磨成匀浆 ,13 000×g 下冷冻离心 10 min ,上
清液即为粗酶液 。提取液含山梨醇 0.25 mol/L 、
EDTA 2 mmol/L 、DTT 1 mmol/L 、Tris-HEPES 25
mmol/L(pH 7.8)。
黄瓜根质膜分离采用两相分离方法 , 参考
Rabotti和 Zocchi(1994)和 Memon等(1987)的方法 。
取新鲜根洗净 、吸干 ,称取 20 g 用 20 ml 提取液在
4℃下研磨成匀浆 。提取液含蔗糖 330 mmol/L 、
Tris-HEPES 50 mmol/L (pH 7.5)、EDTA 5 mmol/L 、
DTT 5 mmol/L 、PMSF 2 μg/ml 、BSA 1 mg/ml。匀浆
液在 13 000×g 下低温离心 15 min ,然后取上清液
于80 000×g 下超速离心 30 min ,收集沉淀(即膜微
囊部分)。膜微囊部分用 2 ml悬浮液(含蔗糖 330
mmol/L 、KCl 5 mmol/L 、pH 7.8 磷酸钾缓冲液 5
mmol/L 、DTT 1 mmol/L 、EDTA 0.1 mmol/L)溶解 ,然
后加入 10 g 两相分离系统[ 6.5%(W/W)PEG
3350 、6.5% (W/W) Dextran T500 、蔗 糖 250
mmol/L 、KCl 4 mmol/L 、pH 7.8 磷酸钾缓冲液 5
mmol/L ] 。剧烈震荡后 ,混合液在 2 000×g 下离
心10 min ,上相用 2倍体积的稀释缓冲液(含蔗糖
250 mmol/L 、pH 6.8 Tris-HEPES 5 mmol/L)稀释 ,然
后于100 000×g 下超速离心 30 min ,沉淀部分即细
胞质膜 ,用少量稀释缓冲液悬浮溶解后立即用于酶
活性测定 。
质膜铁还原酶活性测定参照 Sueyoshi 等
(1997)的方法略作修改 。反应液总体积 2 ml中含
pH 6.0 Tris-HEPES 20 mmol/L 、蔗糖 250 mmol/L 、
0.05% (W/ V) Triton X-100 、 bathophenanthroline-
disulfonic acid 0.6 mmol/L 、NADH 0.5 mmol/L、Fe
(Ⅲ)-螯合物 0.5 mmol/L。反应体系预先在26℃恒
温水浴中遮光保温 10min ,然后加入蛋白含量为10
～ 30μg 细胞质膜悬浮液启动反应 ,在 535 nm下比
色测定 ,每隔 30 s读数 1次 ,共测 2 min。每个样品
重复测定 3次。质膜铁还原酶的活性单位是 nmol
Fe
2+
mg
-1
protein min
-1 。
1.4　蛋白质含量测定
参照 Bradford(1976)的方法 ,标准曲线用 BSA
制作 。
2　结果
2.1　草酸对根还原 Fe(Ⅲ)EDTA的影响
当向反应体系中加入不同浓度的草酸时 ,黄瓜
根切段还原 Fe(Ⅲ)EDTA 的速度随草酸浓度的增
加而增加 (图 1A);随着反应时间的推移 ,Fe(Ⅲ)
EDTA的还原量成线性上升 (图 1B)。反应体系中
单加草酸对反应没有影响。
图 1　草酸促进活体根(根切段)还原 Fe(Ⅲ)EDTA的浓度效应(A)和时间效应(B)
Fig.1　The enhancing effect of oxalate on reduction of Fe(Ⅲ)EDTA by excised roots
◆ :Fe(Ⅲ)EDTA+oxalate;■:Fe(Ⅲ)EDTA;★:Oxalate.The reaction time was 1 h in “A” , oxalate concentration was 12 mmol/L in
“ B” .The bars represent S.E.(3 replicates).
2.2　完整根对不同铁螯合态的还原活性的比较
发现草酸有促进黄瓜根切段还原 Fe(Ⅲ)EDTA
之后 ,首先推测可能是草酸自身作为还原剂直接或
通过NAD+/NADH 提供电子还原Fe(Ⅲ)EDTA。但
实验显示:当外加的草酸浓度低于 4 mmol/L时(图
1),没有促进效果 ,意味着这种促进作用需要较高
的草酸浓度 ,这就较难用草酸是自身作为电子供体
促进了铁的还原来解释。当向含有粗酶液的反应
312 植　物　生　理　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　26卷
体系中同时加入 NAD+、Fe(Ⅲ)EDTA和不同浓度
的草酸时 ,并未观察到有 Fe(Ⅲ)EDTA 的还原 ,只
有加入 NADH时才有铁的还原(数据未示出)。可
见草酸本身作为还原剂促进铁还原的可能性很小 ,
而可能是草酸先与 EDTA竞争 Fe3+后形成部分草
酸铁螯合物 ,这种铁螯合态更适于根中铁还原酶的
作用。据此 ,比较了 3种铁螯合态 [ Fe(Ⅲ)EDTA 、
柠檬酸铁 、草酸铁]为底物的铁还原活性 。结果表
明:黄瓜根的铁还原活性依次是草酸铁>柠檬酸铁
>Fe(Ⅲ)EDTA ,草酸铁为底物时的活性远远高于
柠檬酸铁和Fe(Ⅲ)EDTA (图2)。
图 2　完整根还原不同铁螯合物的活性比较
Fig.2 　Ferric-reducing activity in intact roots with different
Fe(Ⅲ)-chelates as substrates
The bars represent S.E.(3 replicates).
2.3　以不同铁螯合物为底物时质膜铁还原酶的动
力学参数比较
进一步以分离纯化的质膜作为铁还原酶 ,比较
了3种铁螯合态底物的 Km和 Vmax。结果表明:铁
还原酶以草酸铁为底物时的 Km值比以另外两种
底物时的小 ,而 Vmax则均大于另两种底物(图 3);
催化草酸铁还原的效率(Vmax/Km)就要比催化其它
两种铁螯合态铁还原的效率要高得多。
2.4　缺铁对不同铁螯合物还原活性的影响
缺铁处理 9 d后 ,完整根的铁还原活性被诱导
提高 。以 Fe(Ⅲ)EDTA为底物时 ,铁还原活性缺铁
的为 5.24 μmol Fe2+ g-1 DW h-1 ,而对照为 1.06;
以柠檬酸铁为底物时 ,铁还原活性缺铁的为 2.95
μmol Fe2+ g-1 DW h-1 ,而对照为 2.48;以草酸铁为
底物时铁还原活性缺铁的为 14.8 μmol Fe2+ g-1
DW h
-1 ,而对照为 3.87。缺铁处理后质膜铁还原
酶活性同样明显高于对照 ,但提高的幅度比完整根
的小(表 1)。
图 3　质膜铁还原酶催化不同铁螯合物还原的 Lineweaver-
Burk作图
Fig.3　Lineweaver-Burk plot for PM-ferric reductase using differ-
ent Fe(Ⅲ)-chelates as substrates
3　讨论
草酸能显著促进黄瓜根对 Fe(Ⅲ)EDTA 的还
原 ,其促进作用随草酸浓度和反应时间的增加而增
加(图 1A 、 B)。Tipton 和 Thowsen(1985)报告苹果
酸能促进大豆根对 Fe(Ⅲ)EDTA的还原 ,认为是根
中存在NAD+-苹果酸脱氢酶 , 外源苹果酸经催化
脱氢产生的NADH 作为铁还原的最适电子供体用
于Fe(Ⅲ)EDTA的还原。Macur 等(1991)的实验表
明:草酸可以促进动物铁蛋白的光还原 ,认为光下
草酸自身可直接充当还原剂 。我们曾推测草酸促
进黄瓜根对 Fe(Ⅲ)EDTA 的还原也可能是草酸提
供电子直接还原 Fe(Ⅲ)EDTA ,或是 NAD+/NADH
作为铁还原酶的底物介导了草酸与Fe(Ⅲ)EDTA
3134 期　　　　　　　　　　　　　　张锦鹏等:草酸对黄瓜根中铁还原的促进作用
表 1　缺铁对黄瓜完整根和质膜铁还原活性的影响
Table 1　Ferric-reducing activity of intact roots and plasma membrane in response to Fe deficiency
F(Ⅲ)-chelates Treatment Ferric-reducing activity
Intact roots(μmol Fe2+g-1 DW h-1) Plasma membrane(nmol Fe2+ mg-1 protein min-1)
Fe(Ⅲ)-EDTA +Fe 1.06±0.15 127±0.00
-Fe 5.24±0.77 146±2.73
Fe(Ⅲ)-citrate +Fe 2.48±0.64 175±1.61
-Fe 2.95±0.35 287±1.36
Fe(Ⅲ)-oxalate +Fe 3.87±0.41 427±19.3
-Fe 14.8±3.11 601±1.82
Data are means of 3 replicates ±S.E.
之间的氧化还原反应 。曾有报告表明烟草叶片中
存在NAD-草酸脱氢酶(Peng 和 Li 1992)。但实验
结果显示:其促进作用需要较高的草酸浓度(>2
mmol/L)(图 1),这就较难用草酸是自身作为电子
供体促进了铁的还原来解释 。当用根粗酶提取液
与NAD+ 、Fe(Ⅲ)EDTA和不同浓度的草酸一起保
温时 ,并未发现有 Fe(Ⅲ)EDTA 的还原发生 ,只有
加入NADH时才发生铁的还原(数据未示出)。因
此排除了这里观察的还原是草酸作为还原剂直接
进行的可能性。另一种可能性是:草酸先与
Fe(Ⅲ)EDTA竞争 Fe3+后形成部分草酸铁螯合物 ,
这种铁螯合态更适于根中铁还原酶的作用 ,从而促
进了铁的还原。因为植物铁还原酶的实质性底物
Fe3+在体内或根际容易形成沉淀 ,因而很难以游离
形式存在 ,必须靠与某些物质形成可溶性螯合态才
可供植物还原利用。负责铁素运输和还原的天然
载体还不很清楚 , 有人认为是柠檬酸铁(Tiffin
1972 ,White等 1981)。而在植物水培和缺铁土壤中
施铁时常用的是 Fe(Ⅲ)EDTA(Mortvedt 1991)。因
此 ,我们比较了 3种铁螯合态 [ Fe(Ⅲ)EDTA 、柠檬
酸铁 、草酸铁]为底物时整体根和质膜的铁还原活
性。结果表明:以草酸铁为底物时整体根的活性远
远高于以柠檬酸铁和 Fe(Ⅲ)EDTA 为底物时的(图
2);质膜铁还原酶催化草酸铁的效率(Vmax/Km)也
远高于其它两种螯合态(图 3)。
前已述及 ,植物铁还原酶的实质性底物 Fe3+
的螯合和还原均为植物铁素吸收利用所必需 ,因此
阐明植物体内或根际负责铁素运输和还原的天然
载体是一项有意义的工作 。有报告表明柠檬酸铁
可能充当其天然载体(Tiffin 1972 ,White 等 1981),
但还缺少强有力的证据 。本文的结果意味着如果
草酸铁能作为天然载体的话 ,它明显优于柠檬酸
铁:因一方面草酸铁还原效率大于柠檬酸铁 ,另一
方面 ,因草酸是最简单的双羧酸 ,并且是一种代谢
副产物 ,利用时所消耗的碳和能量也应少于柠檬
酸。植物缺铁失绿是一个全球性问题 ,主要发生在
石灰性土壤上(Chen 和 Barak 1982)。这种土壤中
的铁以铁氧化物或磷酸铁盐的形式沉淀 ,难于被植
物吸收利用(Guerinot和 Yi 1994)。所以螯溶土壤
中难溶性铁是植物适应缺铁土壤的重要机制 。草
酸对铁氧化物和磷酸铁均有很好的螯溶效果
(Schwertmann 1991 ,张锦鹏 1999);溶液中的少量草
酸就可以把铁的溶解度提高几个数量级(Graustein
等 1977)。大部分土壤中富含草酸 ,它的来源主要
有三个方面:(1)植物分泌(Strom 等 1994);(2)微生
物分泌(Allen等 1996);(3)从土壤中的有机物质转
化(Graustein 等 1977)。草酸含量较高的植物一般
适于生长在缺铁的石灰性土壤上 ,比如生长在白垩
土上的仙人掌科 、蓼科 、藜科 、唇形科 、石竹科植物
都含有较高量的草酸(Larcher 1997)。草酸铁的还
原也可被缺铁条件所诱导 ,这应在植物缺铁适应中
发挥作用 。但缺铁是否能诱导植物分泌草酸尚不
清楚 ,我们将作进一步的研究报告 。但不管草酸来
源如何或各种来源的贡献大小如何 ,土壤中的草酸
可能通过螯溶土壤中难溶性铁和提高植物对铁素
还原效率的双重功能在植物铁高效利用或适应缺
铁胁迫等方面起着重要作用 。
参 考 文 献
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3154 期　　　　　　　　　　　　　　张锦鹏等:草酸对黄瓜根中铁还原的促进作用
Enhancement of Ferric Reduction by Oxalate in Cucumber Roots
ZHANG Jin-Peng　PENG Xin-Xiang　LI Ming-Qi
(Lab of Molecular Plant Physiology , College of Biotechnology , South China Agricultural University , Guangzhou 510642)
Abstract:The paper reports the enhancing effect
of oxalate on Fe(Ⅲ)EDTA reduction and its
mechanism in plant roots by using cucumber as
material.The enhancement could be strengthened
with an increase in oxalate concentration and with
reaction time prolongation as well (Fig.1A , B).
The first possibility is the action of oxalate as an
electron donor directly or indirectly through the
mediation by NAD/NADH.This is ruled out by
the finding that (Ⅰ)only a high enough concen-
tration of oxalate(>2 mmol/L)was effective in
producing an enhancing effect (Fig.1A);(Ⅱ)
ferric iron could not be reduced when oxalate or
oxalate plus NAD was incubated with Fe(Ⅲ)ED-
TA in the presence of crude enzyme , but could be
when oxalate plus NADH was used.Strong evi-
dence , however , was obtained to support the sec-
ond guess that oxalate first competed with EDTA
for Fe3+ to form ferric oxalate which was a better
substrate than Fe(Ⅲ)ETDA.Activity of Fe3+ re-
duction in intact roots and plasma membrane was
compared when Fe(Ⅲ)EDTA , ferric citrate , or
ferric oxalate was used as substrate.Not only the
highest reducing activity but also the highest
catalytic efficiency (Vmax/Km)was observed with
ferric oxalate as substrate for intact roots and plas-
ma membrane reductase (Figs.2 , 3).The ferric
reduction activity in intact roots and plasma mem-
brane was increased in response to Fe defficiency
(Table 1).It has been suggested that oxalate in
soil may contribute to iron use efficiency in plants
by chelating iron to render it readily reducible.
Key words:oxalate , ferric reduction , cucumber roots
316 Acta Phytophysiologica Sinica　2000 , 26(4):311～ 316