全 文 ：亮菌多糖的纯化工艺及抗肿瘤活性研究＊

★　黄纯 　周凤娟　(中国药科大学高等职业技术学院　镇江 212003)
摘要:目的:研究亮菌多糖的分离纯化工艺及体内抗肿瘤活性。方法:采用 DEAE-纤维素色谱柱对粗品亮菌多糖 ALPII 进行
纯化 , 以上样回收率为考察指标 , 通过单因素试验研究不同浓度的 NaCl溶液对纯化效果的影响。 以抑瘤率为考察指标 , 采用
荷瘤小鼠研究 ALP2体内抗肿瘤活性。结果:粗品 ALPII 经纯化后得到精品多糖 ALP1 和ALP2;NaCl浓度为 0.2 mol/ L时上
样回收率最高 , ALP2对实体型肉瘤 S180 和实体型腹水瘤 EAC 都有明显的抑制作用。结论:以 DEAE-纤维素色谱柱分离纯
化粗品亮菌多糖 , NaCl的适宜浓度为 0.2mol/ L;初步药效试验表明 ALP2 具有抗肿瘤活性。
关键词:亮菌多糖;分离纯化;抗肿瘤活
中图分类号:R 285.5 　　文献标识码:A
Study on the Technique of Purification and Antitumor Activities of Armillariella Lucidum
Polysaccharide
HUANG Chun, ZHOU Feng-juan
China Pharmaceutical University Altitude Vocational School , Zhenjiang 212003
Abstract:Objective:To study on purification technology and anti-tumor activity of A rmillariella Lucidum Polysaccharide(ALP)
.Methods:Crude ALPⅡw ere purificated through DEAE-cellulose ion-exchange chromatography.The effect of different concentra tions
of NaCl was tested by single factorial test.The in vivo antitumor activity w as studied on ALP2 Results:Tw o pure poly saccharide ,
ALP1 and ALP2 were obtained.The highest recycling rate of Poly saccharide w as found by the concentration of 0.2mol/ L Na-
Cl.ALP2 can inhibit the grow th of S180 and EAC.Conclusions:The optimum concentration of NaCl is 0.2mol/ L.The primary effect
showed that ALP2 has the anti-tumor activity.
Key Words:Armillariella Lucidum Poly saccharide(ALP);Purification;Anti-tumor activity
　　亮菌学名为白蘑科密环菌属假密环菌[ Armil-
lariella tabescens(Scop.ex.f r)sing] ,上世纪 60年代
发现于镇江 ,是我国首次发现并拥有自主知识产权
的一种真菌。因为能发出浅蓝色的荧光 ,在暗处清
晰可见 ,故名为亮菌[ 1] 。亮菌发酵菌粉由假密环菌
的培养体经提取获得 ,其化学成分复杂且因所用菌
种 、培养法 、提取手段不同而异 ,亮菌多糖是其中主
要的有效成分之一。本实验室从亮菌发酵菌粉中提
取出亮菌多糖粗品ALPⅡ ,ALPⅡ经 DEAE-纤维素
色谱柱纯化后得 2种均一多糖 ALP1 和 ALP2 。本
文以多糖上样回收率作为考察指标 ,通过单因素实
验研究了不同浓度的 NaCl 溶液对纯化效果的影
响 ,并对 ALP2的体内抗肿瘤活性进行了初步的研
究 。
1　仪器与材料
1.1　仪器　BS-100A 自动部分收集器 , 722型分光
光度计 ,上海沪西分析仪器厂 。
1.2　试剂　亮菌菌粉 ,无锡百方吉生物科技有限公
司提供;DEAE 纤维素 ,上海恒信化学试剂有限公
司;注射用环磷酰胺 ,江苏恒瑞医药股份有限公司;
氯化钠注射液 ,江苏亚邦生缘药业有限公司;氯化
钠 、硫酸 、苯酚 、葡萄糖 ,中国医药集团上海化学试剂
公司 。其余试剂皆为国产分析纯 。
1.3　实验动物　ICR小鼠 ,18 ～ 22 g ,雄雌各半 ,由
江苏省肿瘤医院提供。
2　方法与结果
2.1　亮菌多糖的含量测定　采用硫酸-苯酚法
2.2　亮菌粗多糖的提取(采用水提醇沉法)工艺　
亮菌菌粉※热水提取※离心※上清液浓缩※脱蛋白
※脱气※流水透析※70%乙醇沉淀※无水乙醇 ,丙
酮洗涤※真空干燥※亮菌多糖粗品ALP Ⅱ。
2.3　亮菌多糖的纯化工艺(柱色谱法)　ALP Ⅱ※
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江西中医学院学报2 0 0 7 年1 2月第 1 9 卷第6 期
JOURN AL OF JIANGXI UNIVERSITY OF TCM2007 Vo l.19 No.6
作者简介:黄纯 ,女 ,中国药科大学高等职业技术学院教师基金项目:中国药科大学青年教师基金(D0510)
　
○实验研究○
DEAE 纤维素柱※蒸馏水洗脱(硫酸-苯酚法测定洗
脱曲线 ,收集洗脱液 ,浓缩 、冷冻干燥 ,得白色精品多
糖 ALP1)※NaCl溶液洗脱※收集洗脱液※透析※
透析液浓缩 、冷冻干燥 ,得淡黄色精品多糖 ALP2 。
硫酸-苯酚法测定 ALP1和 ALP2 的糖含量均接近
100%。
2.4　分离纯化的单因素考察　流速 18 ml/h ,上样
量 80 mg/次 ,柱高约 18 cm 。以上样回收率为考察
指标 ,选择 0.05 、0.1 、0.15 、0.2 、0.25 、0.3 mol/L 不
同浓度的 NaCl进行洗脱 ,重复实验 3 次取平均值 ,
确定适宜的盐洗浓度 。实验结果见表 1。
表 1　不同浓度 NaCl溶液洗脱的上样回收率
NaCl浓度/mol·L -1 上样回收率(%)
0.05 43.6
81.0 2.1
0.15 84.1
0.2 85.1
0.25 85
0.3 84.9
2.5　ALP2的抗肿瘤活性研究　取小鼠 100只 ,雌
雄各半 ,按移植性肿瘤研究法[ 2] 接种实体型肉瘤
S180 ,腹水瘤 EAC 各 50只 ,接种后 24 h 称鼠重 ,随
机分为 5组。空白对照组 、环磷酰胺组(20 mg/kg)
分别为阴 、阳性对照组 ,A LP2组设高 、中 、低 3个剂
量组(80 、20 、5 mg/kg)。接种 24 h 后腹腔给药 ,每
天一次 ,共给药 8次 ,于停药后第二天处死荷瘤小鼠
称重 ,并分离瘤块称重 ,记录瘤重 。计算抑瘤率。抑
瘤率=(1-给药组瘤重/空白组瘤重)×100%,所得
数据进行统计学处理(t检验)。
实验结果见表 2 , 与生理盐水对照组相比 ,
ALP2高 、中剂量组及环磷酰胺组对 EAC 瘤株的肿
瘤生长有显著抑制作用 ,ALP2高剂量组及环磷酰
胺组对 S180 瘤株的肿瘤生长有显著抑制作用。
ALP2组对小鼠体重无明显影响 ,而环磷酰胺组对
小鼠体重增长有抑制作用。
表 2　ALP2 体内抗肿瘤效果
瘤种 组别 n 剂量/mg·kg-1
给药前体重/g 给药后体重/ g 瘤重/g 抑瘤率(%)
S180 生理盐水 10 18.97±1.33 24.36±1.58 1.03±0.16
环磷酰胺 10 20 18.55±0.66 23.2±0.58 0.37±0.04＊＊ 64.1
ALP2 10 80 19.38±0.85 24.18±2.16 0.64±0.09＊＊ 37.9
ALP2 10 20 19.27±0.79 24.3±2.15 0.88±0.06＊ 14.6
ALP2 10 5 19.28±1.46 24.58±1.90 0.96±0.16 6.7
EAC 生理盐水 10 20.67±1.78 28.2±2.77 1.71±0.1
环磷酰胺 10 20 20.70±1.34 22.56±2.06＊＊ 0.48±0.08 71.9
ALP2 10 80 20.43±1.08 25.85±1.29 0.94±0.18＊＊ 45
ALP2 10 20 20.58±1.65 27.00±2.60 1.32±0.19＊＊ 23
ALP2 10 5 20.59±1.94 25.43±2.95 1.41±0.44＊ 17.5
　　　　　注:与生理盐水组比较 , ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01。
3　讨论
亮菌粗多糖 ALPII 是亮菌发酵菌粉经热水提
取醇沉得到的淡棕色粉末状样品 。为了提高其纯
度 ,本实验采用国产 DEAE-纤维素(OH-型)柱色谱
法对粗品其进一步分离纯化 ,所得水洗组分 ALP1
和盐洗组分 ALP2 的糖含量接近 100%。本实验以
上样回收率作为考察指标 ,选择不同浓度的 NaCl
洗脱液进行单因素考察 ,发现随着 NaCl浓度的增
加上样回收率先是增加然后基本不变 , 0.2 、0.25 、
0.3 mol/ L 的 NaCl溶液洗脱的上样回收率基本接
近 。考虑到 NaCl浓度过低则样品中的多糖洗脱不
完全 ,损失太多;过高会使得洗脱液中混有过多的
NaCl等小分子物质 ,不仅给透析带来不便而且造成
浪费 ,所以确定最适宜的洗脱浓度为用 0.2 mol/L 。
真菌多糖作为一类低毒而免疫活性强 、毒副作
用少 、来源广的生物大分子 ,受到人们的广泛注意。
本实验选用精品亮菌多糖 ALP2 作为研究对象 ,以
环磷酰胺作为阳性对照 ,考察了 ALP2对移植性实
体型肉瘤 S180 、腹水瘤 EAC的抑制作用 ,初步的药
效实验已表明 ALP2具有较好的抗肿瘤活性 ,而且
ALP2具有较好的水溶性 ,注射方便 ,具有良好的开
发前景 。目前对亮菌多糖的抗肿瘤虽有研究 ,但研
究的还不够透彻和全面 ,至今尚未有文献报道亮菌
多糖在临床上用于癌症治疗 ,故有待于我们进一步
加强这方面的研究 。
参考文献
[ 1] 江苏省“亮菌”科研协作组微生物小组.假密环菌的研究[ J] .微
生物学报 , 1974 , 14(1):9.
[ 2] 徐淑云 ,卞如濂 ,陈修.药理实验方法[ M ] .第 3版.北京:中国
医药科技出版社 , 1995.120-125.
(收稿日期:2007-07-25)
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江西中医学院学报　2007 年第 19 卷第 6 期
　
○实验研究○