全 文 ：No.8.2008
酶解蚕蛹蛋白制备蚕蛹
活性肽工艺条件优化
刘旭辉 1,2,赖泰君 1,孙建华 1,谭 真 1,覃勇荣 2,廖丹葵 1*
(1.广西大学化学化工学院,南宁 530004;
2.广西河池学院化学与生命科学系,宜州 546300)
摘要:以经超临界CO2萃取除去大部分蚕蛹油的脱脂蚕蛹蛋白质为原料,研究不同酶种类制备蚕蛹活
性肽的酶解效果,选用碱性内切蛋白酶水解蚕蛹蛋白质制备活性肽,研究水解温度、酶用量([E]/
[S])、底物浓度([S])和pH值等因素变化时水解度DH随时间的变化规律,结果表明,以DH为考察指
标得到该碱性内切蛋白酶水解蚕蛹蛋白质的适宜条件为:水解时间300min,酶用量[E]/[S]为0.3%,[S]
为8%,pH值9.5,水解温度50℃,此时DH为22.66%,酶解物主要由小肽分子组成。
关键词:酶解;蚕蛹蛋白;工艺条件
中图分类号:TS201.2 文献标志码:A 文章编号:1005-9989(2008)08-0177-03
Studyofoptimizationtechnicalconditionforpreparingbioactivepeptides
fromsilkwormpupaproteinwithalkaliproteasehydrolyzing
LIUXu-hui1,2,LAITai-jun1,SUNJian-hua1,TANZhen1,QINYong-rong2,LIAODan-kui1*
(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,GuangxiUniversity,Nanning530004;
2.DepartmentofChemistryandLifeScience,HechiUniversity,Hechi546300)
Abstract:Aftersilkworm pupawasdegreasedbysupercriticalextractionofcarbondioxideandethanol,
Bioactivepeptideswithalkaliproteasehydrolyzingwerepreparedfrom defatedsilkworm pupaprotein.The
relationsbetweendegreeofhydrolysis(DH)ofhydrolysateanditshydrolysistimewerestudiedwhilethe
technicalconditionswerechangedsuchashydrolysistime,hydrolysistemperature,theratioofenzymeto
substrate([E]/[S]),theconcentrationofsubstrate([S])andpH.Theresultshowedthattheoptimaltechnical
conditionhydrolyzingdefatedsilkwormpupaproteinwashydrolysistime300min,hydrolysistemperature50℃,
[E]/[S]0.3%,[S]8% andpH9.5,thentheDHwas22.66%,andthehydrolysatesweremostlycomposedof
oligopeptidesintheproducts.
Keywords:enzymatic;silkwormpupaprotein;bioactivepeptides
生物活性肽是一类具有清除自由基、提高机体
免疫能力、延缓衰老、降低血压等特殊功能的功能
因子。在过去几十年里,这些可减少慢性疾病的危
害和促进天然免疫力保护并存在于食品蛋白中的肽
的潜能唤起了人们极大的兴趣,其中备受瞩目的是
存在于自然界中大量具有调节生理和代谢功能的生
物活性多肽的发现。这些肽在原蛋白质序列中并没
有活性,当用体内肠道酶或体外酶作用蛋白质时,这
些肽将从原来的序列中释放出来,并表现出特殊的
活性,如免疫肽、酪蛋白磷酸肽、抗菌肽以及降血压
肽等[1-2]。随着人民生活水平的不断提高,膳食结构
有了明显变化,利用功能食品来调节生理状况的观
收稿日期:2007-10-20 *通讯作者
基金项目:广西自然科学基金资助项目(桂科自0728237);广西教育厅科研项目(200607MS031);广西大学基金资助项目(X071029)。
作者简介:刘旭辉(1962—),女,广西宜州人,副教授,研究方向为应用化学。
提取物与应用
177
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2008.08.011
No.8.2008
点,已越来越为消费者所接受,天然食物中的功能因
子的摄入今后将成为重要组成部分。
蚕蛹中含有大量的全价蛋白,是一种优质蛋白质
资源。蛋白质占干蛹的 40%,脂肪占干蛹的 30%[3]。
国内生产的蚕蛹蛋白制品主要为蚕蛹蛋白粉,但这种
蛋白粉水溶性差,且异味物质及色素的脱除不彻底,
极大地阻碍其在食品工业中的应用。现代医药学研
究证明,蚕蛹蛋白质经酶水解生成的蚕蛹多肽对四
氧嘧啶模型小鼠具有明显的降血糖作用[4],近年来利
用蚕蛹蛋白制备蚕蛹多肽以及复合氨基酸的研究时
有报道,其中蚕蛹多肽制备多以胃蛋白酶、胰蛋白酶
和木瓜蛋白酶酶解为主[5-6],未见应用其他蛋白酶制
备蚕蛹多肽的研究报道。本文通过几种不同的蛋白
酶在各自适宜条件下酶解蚕蛹蛋白进行比较,利用
碱性蛋白酶制备蚕蛹多肽,采用单因素实验法,分别
考察了酶用量([E]/[S])、底物浓度([S])、pH值和酶解
温度等因素变化时对蚕蛹蛋白水解的影响,以水解
度为参考指标,得到了可控酶解制备蚕蛹多肽的适
宜条件。
1 材料和方法
1.1 实验材料和仪器
干蚕蛹:宜州,粉碎,经超临界萃取蚕蛹油得
脱脂蚕蛹粉,过40目筛后待用。酸性蛋白酶和碱性
蛋白酶:酶活均为 50000U/g,北京东盛华强生物技
术公司;Neutrase中性蛋白酶:酶活为 50000U/g,
诺维信(中国)公司;其他化学试剂为国产分析纯;标
准低分子蛋白(14.4~97ku):上海国药生产。
FW100高速万能粉碎机:天津市泰斯特仪器有
限公司;S212恒速搅拌器:上海申顺生物科技有限
公司;高速离心机:美国Sigma公司;LB801恒温水
浴锅:辽阳市恒温仪器厂;DYY-6C电泳仪:北京六
一电泳仪厂。
1.2 实验方法
1.2.1 分析方法 脱脂蚕蛹粉主要成分分析方法如
下:水分采用 105℃常压干燥法,按 GB5009.3测
定;灰分采用 550℃高温灼烧氧化法,按 GB
5009.4-2003测定;蛋白质采用微量凯氏定氮法,按
GB5009.5-2003测定;脂肪含量采用索式提取法,
按 GB/T5009.6-2003测定;酸性蛋白酶酶解水解度
用甲醛滴定法计算,中性蛋白酶和碱性蛋白酶酶解
水解度用pH-stat法来测定;蚕蛹蛋白及酶解产物分
子量分布采用SDS-PAGE凝胶电泳法[7]。
1.2.2 蚕蛹蛋白酶解 称取一定量的原料蛋白质,加
水配置成一定浓度的溶液后,煮沸灭菌 10min,置
恒温搅拌器上加热至指定温度并恒温;称取一定量
的蛋白酶,置于 37℃的恒温水浴锅中预热 10min,
用盐酸或NaOH溶液调pH至要求范围,然后迅速加
入已准备好的酶进行酶解,酶解过程中不断加入盐
酸或NaOH溶液以维持溶液的pH恒定,计算不同时
间的水解度(DH),酶解解结束后,加热溶液沸腾 15
min使酶失活,然后经8000r/min离心,取上清液冷
冻干燥后冷藏备用[8]。
2 结果及讨论
2.1 蚕蛹主要成分分析
按国标分析方法检测本实验所用脱脂蚕蛹原料
中的几种主要成分含量如表1所示。
蚕蛹原料中蚕蛹油的含量一般为 30%~35%,经
超临界脱脂后,蚕蛹油含量已降至 10%以下,大部
分油脂已经除去,脱脂蚕蛹中其他成分主要包括粗
纤维等物质[3],从上述结果可以看出,经脱脂处理后
原料中蚕蛹粗蛋白质含量较高。
2.2 蚕蛹蛋白质酶解种类筛选
确定底物浓度为6%,将所选取的蛋白酶在各自
适宜的条件下酶解脱脂蚕蛹蛋白 360min,其酶解结
果如表2所示。
由上述结果可知,相同时间下,3种蛋白酶对脱
脂蚕蛹蛋白的酶解效果相差较大,其中碱性蛋白酶
酶解的水解度DH最高,换算成平均肽链长度,3种
酶解液产品的平均肽链长度则分别为9.3、4.4和5.9。
即碱性蛋白酶酶解生成的肽平均分子量更小一些,
因此,后续研究选用碱性蛋白酶作为酶解蚕蛹蛋白
质的酶类。
2.3 蚕蛹蛋白质酶解条件优化
2.3.1 酶解时间确定 确定底物浓度为 6%,水解温
度45℃,水解pH为9.5,酶用量[E]/[S]为0.3%,DH
随时间的变化如图1所示,由图1可知酶解初期酶解
速率较快,水解度DH变化较大,随着酶解时间的增
加,水解度DH增加较为缓慢,原因是因为碱性蛋白
酶为限制性内切酶,只能酶解特定的肽键,随着酶解
时间增加,可酶解的肽键数越来越少,因此,水解度
DH变化已不明显,此时可认为是可控酶解的终点。
由实验结果可知,酶解开始至150min水解度DH变
化很大,之后 DH增加较为缓慢,300min时 DH已
达为21.67%,因此,确定酶解时间为300min。
成分 蛋白质 灰分 水分 脂肪 其他
含量/% 64.86 6.26 9.8 6.3 12.78
表1 脱脂蚕蛹主要成分分析
表2 3种蛋白酶酶解脱脂蚕蛹蛋白结果
酶的种类 水解度DH/%
Z537酸性蛋白酶 10.73
碱性蛋白酶 22.67
Neutrase中性蛋白酶 16.84
提取物与应用
178
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1低分子标准蛋白
2蚕蛹蛋白原料
3蚕蛹蛋白酶解液
图6 蚕蛹蛋白酶解后分子量分布图
2.3.2 酶最适用量的确定 确定底物浓度[S]为 6%,
水解温度45℃,水解 pH为 9.5,改变酶用量[E]/[S],
水解度DH随时间的变化如图2所示。
由图2可知,由于底物浓度[S]远大于酶用量[E],
相同时间水解度DH随着酶用量的增加而增大,添加
0.3%以上酶用量水解度DH值均能达到20%,但从节
约成本考虑,酶用量选择[E]/[S]为0.3%。
2.3.3 底物最适浓度的确定 确定酶用量[E]为 0.018
g,水解温度 45℃,水解 pH为 9.5,改变底物浓度
[S]时水解度DH的变化如图3所示。
由图 3可知,相同时间内随底物浓度增大水解
度 DH逐步减小,当底物浓度[S]为 8%时,酶解 300
min水解度DH仍能达到19.67%,此时平均肽链长度
约为5.08,若酶解时底物浓度太小则后续分离纯化需
要耗费更多的时间和能量,而底物浓度[S]为 10%时
蛋白质溶液过于黏稠,搅拌效果不是很好,因此确定
酶解底物浓度[S]为8%。
2.3.4 酶解最适pH的确定 确定底物浓度[S]为8%,
水解温度 45℃,酶用量[E]/[S]为0.3%,改变酶解pH
时水解度DH随时间的变化如图4所示。
由图4结果可知,随着酶解pH的增大,相同时
间内水解度 DH随之增加,但 pH为 11.5时酶解 50
min后水解度DH增加显著,由于蛋白质在酸或碱的
作用下均能发生水解,而溶液pH在7.5~11.5范围内
碱性蛋白酶均能对蛋白质进行酶解,因此pH为11.5
的条件下,由于溶液中碱含量太大,此时不仅仅是蛋
白酶在进行酶解,蛋白质在碱性条件下进行水解占
了主导地位,从而导致水解度DH增加明显,从实验
结果确定酶解pH为9.5较适。
2.3.5 酶解最适作用温度的确定 确定底物浓度为
8%,水解pH值为9.5,酶用量[E]/[S]为0.3%,不同酶
解温度下水解度DH的变化如图5所示。
由图 5可知,随着酶解温度的升高,相同时间
内水解度DH增大,但在55℃与50℃酶解时相同时
间水解度DH变化不大,说明50~55℃该蛋白酶酶解
速度以达到最大,若再提高酶解温度,则可能导致酶
的变性失活,所以酶解适宜温度取 50℃,此时水解
度DH可达到22.66%。
2.3.6 酶解后分子量分布 蚕蛹蛋白经蛋白酶酶解后
30
25
20
15
10
5
0
0 50 100 150200250 300350 400
时间/min
D
H
/%
图1 DH随时间的变化趋势
图2 DH随酶用量的变化趋势
图3 DH随底物的变化趋势
图4 DH随pH的变化趋势
图5 DH随温度的变化趋势
30
25
20
15
10
5
0
0 50 100 150 200 250 300 350
0.1%
0.2%
0.3%
0.4%
0.5%
时间/min
D
H
,/%
30
25
20
15
10
5
0
0 50 100 150 200250 300350
0.2%
1.0%
0.8%
0.6%
0.4%
时间/min
D
H
/%
30
25
20
15
10
5
0
0 50 100 150200 250300 350
7.5
8.5
9.5
10.5
11.5
时间/min
D
H
/%
25
20
15
10
5
0
0 50 100 150 200 250 300 350
35℃
40℃
45℃
50℃
55℃
时间/min
D
H
/%
1 2 3
提取物与应用
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No.8.2008
分子量变化如图6所示,从图6可以看出,蚕蛹蛋白
质主要由43ku的分子组成,而酶解产物的电泳图已
看不到的蚕蛹活性肽形成的分子量条带,说明经过
碱性蛋白酶的酶解作用,蚕蛹蛋白质分子均已被酶
解成小分子多肽,且分子量均小于低分子标准蛋白的
最小分子量,这与赵鹏等的研究结果也一致[5]。
3 结论
以水解度DH为指标,比较了3种不同蛋白酶在
各自适宜条件下酶解蚕蛹蛋白质的效果,确定以碱
性蛋白酶酶解蚕蛹蛋白制备蚕蛹活性肽,考察了酶
用量([E]/[S])、底物浓度([S])、pH值和酶解温度等
因素变化时对蚕蛹蛋白水解的影响,得到该蛋白
酶可控酶解制备蚕蛹多肽的适宜酶解工艺条件为
水解时间为 300min,酶用量[E]/[S]为 0.3%,底物浓
度[S]为 8%,水解 pH为 9.5,水解温度 50℃,此时
水解度 DH为 22.67%,酶解产物主要由一些小肽
分子组成。
参考文献:
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一种双歧杆菌胞外多糖
活性炭脱色工艺研究
陈 倩,李伟欣,程 静,李平兰 *
(中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083)
摘要:通过对活性炭添加量、脱色pH、脱色温度以及脱色时间不同因素水平的研究确定一种双歧杆
菌胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)的活性炭脱色条件,并对其进行Langmuir动力学方程拟合。通过
计算可知,在30℃、pH7.0、5%活性炭添加量 (m/m)、脱色时间40min的条件下,吸附参数为 qo=
0.152Abs,K=-0.350Abs。
关键词:胞外多糖;活性炭;脱色
中图分类号:TS201.3 文献标志码:A 文章编号:1005-9989(2008)08-0180-04
Studyonactivecarbondecoloratingofexopolysaccharideproducedby
bifidobacteriumspp.
CHENQian,LIWei-xin,CHENGJing,LIPing-lan*
(FoodScienceandNutritionEngineeringColege,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083)
收稿日期:2007-12-19 *通讯作者
基金项目:北京市自然科学基金项目(5072025)。
作者简介:陈倩(1984—),女,广西人,硕士研究生,研究方向为食品微生物与生物技术。
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