全 文 ： 2010, Vol. 31, No. 22 食品科学 ※工艺技术6
亮叶杨桐叶总类黄酮的提取工艺优化及
对肺腺癌细胞A549生长的影响
战 宇，曾庆祝，方 玲
(广州大学化学化工学院，广东 广州 510006)
摘 要：采用响应面法对亮叶杨桐叶中类黄酮物质的提取工艺条件进行优化。结果表明，提取时间 10min、乙醇
体积分数 63%、提取温度 70℃、比料液 1:20时，亮叶杨桐叶中总类黄酮提取率为(95.58± 0.49)%。采用MTT法
对亮叶杨桐叶类黄酮抗肺腺癌细胞A549生长的活性进行研究，结果显示亮叶杨桐叶类黄酮对肺腺癌细胞A549具有
良好的抑制作用，并呈现显著的时间效应和剂量效应关系。
关键词：亮叶杨桐；类黄酮；提取条件；生理活性
Optimization of Total Flavonoids Extraction from the Leaves of Adinandra nitida and Their
Inhibitory Effect on Lung Cancer A549 Cells
ZHAN Yu，ZENG Qing-zhu，FANG Ling
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China)
Abstract ：Adinandra nitida is a traditional Chinese herb for health drink, of which leaves are rich in flavonoids. The optimization
of total flavonoids extraction from the leaves of Adinandra nitida with ethanol as the extraction solvent was conducted in this work,
which was also aimed at examining if the total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida have the ability to inhibit the
proliferation of lung cancer A549 cells. The optimal extraction conditions of total flavonoids from Adinandra nitida leaves were
determined by response surface methodology to be: extraction time, 10 min; ethanol concentration, 63%, extraction temperature,
70 ℃; and material/liquid ratio, 1:20. The extraction rate of total flavonoids was (95.58 ± 0.49) % under the optimal extraction
conditions. The inhibitory effect of the total flavonoids from the leaves of Adinandra nitida on the proliferation of lung cancer
A549 cells was evaluated by MTT assay. The total flavonoids could significantly inhibit the proliferation of lung cancer A549
cells in significant time-dependent and dose-dependent manners.
Key words：Adinandra nitida；total flavonoids；extraction condition；physiological function
中图分类号：TQ91 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)22-0006-05
收稿日期：2010-01-17
基金项目：广州市科技局项目(2006J1-C0251)；广州大学食品加工与安全重点实验室资助项目(2010)
作者简介：战宇(1974—)，女，讲师，博士，主要从事天然产物及其开发研究。E-mail：yuzhan@scut.edu.cn
亮叶杨桐(Adinandra nitida Merr. Ex H. L. Li)是一种主
要分布于我国广西、广东和贵州等省区的天然野生植物
资源，以其鲜嫩叶制成的代茶——石崖(芽)茶在华南民
间有着悠久的饮用历史，具有消炎、解毒、降压、退
热、止血、杀菌、镇痛等多种功能 [ 1 ]。近年来研究发
现，亮叶杨桐富含以芹菜素为苷元的类黄酮，主要为
山茶苷 A [2]，其次含有少量的山茶苷 B及芹菜素，总量
可达 28.4%[3]。药理学研究证明，芹菜素具有抗高血压、
抗炎症、抗溃疡、抗 HIV 的活性，其中抗肿瘤作用最
为突出[ 4 -6 ]。因此，从廉价易得的亮叶杨桐叶中制备高
附加值的黄酮类化合物，深度开发和高效利用丰富的亮
叶杨桐植物资源，对促进华南山区经济发展具有重要的
现实意义。本实验采用响应面试验设计(response surface
method，RSM)对亮叶杨桐叶中总黄酮的提取工艺条件
进行优化，并采用MTT法对亮叶杨桐叶中所含的类黄
酮的抗肿瘤活性进行研究。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
亮叶杨桐干叶：2008年春购于广西省来宾县，粉
7※工艺技术 食品科学 2010, Vol. 31, No. 22
碎后过 50目筛备用；芹菜素(纯度 98%) 陕西慧科植物
开发有限公司；山茶苷 A(纯度 98%以上) 实验室自
制；肺腺癌细胞A549 美国ATCC公司；DMEM培养
基(含 25mmol/L Hepes缓冲液、60mg/L青霉素、100mg/L
链霉素以及 2g/L碳酸氢钠)、RPMI 1640培养基、噻唑
蓝(MTT)、二甲基亚砜 美国 Sigma公司；胎牛血清
G ibco 公司；其他试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
TA2004电子天平 上海天平仪器厂；752紫外 -可
见分光光度计 上海精密仪器有限公司；RE-52旋转蒸
发仪 上海亚荣生化仪器公司；SHZ-D(Ⅱ)循环水式真
空泵 巩义市英裕予华仪器厂；DHG-9000A电热恒温鼓
风干燥箱 上海博讯公司医疗设备厂；Elisa 酶标仪
TECAN 公司。
1.3 亮叶杨桐叶总类黄酮提取工艺参数的优化
1.3.1 溶剂的选择
实验发现用水做溶剂时，溶剂用量大，固形产品
回收困难，特别是在较高温度时，杂质含量大，不但
影响产品纯度而且过滤困难。乙醇作为溶剂时对类黄酮
化合物具有较好的溶解性，不易引入较多杂质。甲醇
作溶剂提取率与乙醇相差不大，但甲醇容易挥发且有
毒，因此本实验采用乙醇作为提取溶剂。
1.3.2 单因素试验
提取温度、乙醇体积分数、提取时间、液固比、
提取次数 5个因素会影响总类黄酮的提取率。考虑到乙
醇的沸点及成本，设定提取温度变化范围为 30～70℃，
乙醇体积分数为 40%～100%；提取次数为 1次。为确
定提取时间与液固比的变化范围，实验考察上述因素对
提取率的影响。
类黄酮化合物提取率 /%＝(提取出的类黄酮化合物
的质量 /亮叶杨桐中含有的类黄酮化合物的质量)× 100。
已用体积分数 80%乙醇溶液对亮叶杨桐叶进行 10h索氏
提取，紫外分光光度法测得类黄酮化合物含量为(31.84
± 0.42)%。提取液的类黄酮化合物的质量，通过紫外
分光光度法在 330nm波长处测定吸光度，再用以山茶苷
A 为标样制作的标准曲线计算而得。标准曲线回归方
程：y＝ 31.348x－ 0.976，R2＝ 0.9982。
1.3.3 响应面试验
采用Design-Expert 7.0中的响应面试验设计法，设
计 4 因素共 30 个试验点，24 个析因点，6 个中心点。
1.4 亮叶杨桐叶类黄酮抗肿瘤活性的研究
1.4.1 亮叶杨桐叶类黄酮溶液的制备
称取一定量的亮叶杨桐干叶，在优化的工艺条件下
提取总类黄酮，所得提取液抽滤后，在 40℃的条件下
真空旋转浓缩，蒸去乙醇后的残余物冷冻干燥，所得
固态产品测定总类黄酮含量为(31.84± 0.42)%，山茶苷
A含量为(27.57± 0.92)%，以蒸馏水溶解，备用。
1.4.2 细胞培养
A549细胞分别接种于RPMI 1640培养基和含10%胎
牛血清的 DMEM培养基中，37℃、5% CO2孵育，每
周传代 2 次。取对数生长期细胞进行实验。
1.4.3 MTT实验
将A549细胞接种于 96孔培养板中，每孔细胞密度
为 2× 104/mL，分别加入终质量浓度为 20、10、2.5、
1.25、0.625mg/L的亮叶杨桐叶类黄酮溶液，分别培养
24、48、72h。对照组则加入培养液，每组各设 3个复
孔。每孔加入 1μg/mL MTT各 100μL，避光、37℃、
5% CO 2条件下继续孵育 4h后终止培养。将培养板于
1100r/min离心 5min，弃去上清液。每孔加入 200mL
DM SO，振荡 15min，使结晶物充分溶解。将培养板
置于酶标仪上，测定各孔在 570nm和 630nm处的光密度
值，计算亮叶杨桐叶总类黄酮对 A549细胞的细胞抑制
率，绘制生长抑制曲线。采用 DPS9.5软件包中连续变
量的概率单位分析法，计算亮叶杨桐叶类黄酮对 A549
细胞的半数抑制浓度(50% concentration of inhibition，
IC 50) [7]。
细胞抑制率 /% ＝(1－实验组OD值 /对照组OD值)×100
2 结果与分析
2.1 提取时间对亮叶杨桐叶总类黄酮提取率的影响
图 1 提取时间对提取率的影响
Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids
from the leaves of Adinandra nitida
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
提
取
率
/%
提取时间 /min
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
如图 1所示，在提取温度 50℃、液固比 20:1、乙
醇体积分数 80%条件下，改变提取时间研究其对提取率
的影响。结果表明，当提取时间超过 10min 后，提取
率上升趋缓，这说明亮叶杨桐叶类黄酮的提取是一个非
常迅速的过程，因此 RSM 实验中的提取时间变化范围
设定为 10～40min。
2.2 液固比对亮叶杨桐叶总类黄酮提取率的影响
如图 2所示，在提取温度 50℃、提取时间 15min、
乙醇体积分数 80%条件下，改变液固比观察其对提取率
的影响。结果表明随着液固比的增大，提取率迅速上
2010, Vol. 31, No. 22 食品科学 ※工艺技术8
升，当液固比超过 20:1时，提取率上升趋缓，而当液
固比低于 10:1(mL/g)时，提取操作不便，因此将RSM实
验中液固比的变化范围设定为 10:1～30:1(mL/g)。
图 2 液固比对提取率的影响
Fig.2 Effect of liquid/material ratio on extraction rate of total
flavonoids from the leaves of Adinandra nitida
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
提
取
率
/%
0:1 5:1 10:1 15:1 20:1 25:1 30:1 35:1 40:1
液固比(mL/g)
2.3 亮叶杨桐叶总类黄酮提取工艺参数的优化
因素 最小值 中间值 最大值
A提取时间 /min 10 25 40
B水浴温度 /℃ 30 50 70
C液固比(mL/g) 10:1 20:1 30:1
D乙醇体积分数 /% 40 70 100
表 1 响应面试验因素及其取值范围
Table 1 Factors and levels in response surface design
试验 提取 提取 液固比 乙醇体积 提取
号 时间 /min 温度 /℃ (mL/g) 分数 /% 率 /%
1 25 50 20:1 70 90.09
2 25 50 20:1 40 88.14
3 40 50 20:1 70 90.64
4 10 70 30:1 40 90.75
5 10 30 30:1 40 72.04
6 25 30 20:1 70 89.16
7 25 50 20:1 70 87.97
8 25 50 20:1 100 61.21
9 40 70 30:1 40 68.61
10 10 70 10:1 100 67.74
11 25 50 20:1 70 89.72
12 10 30 10:1 40 69.46
13 10 70 10:1 40 88.79
14 40 70 10:1 100 77.85
15 10 50 20:1 70 90.19
16 10 30 30:1 100 55.92
17 40 70 10:1 40 84.39
18 25 50 10:1 70 85.81
19 25 50 30:1 70 86.57
20 25 50 20:1 70 89.42
21 40 30 30:1 40 83.92
22 25 50 20:1 70 88.99
23 40 70 30:1 100 80.75
24 25 50 20:1 70 86.04
25 10 70 30:1 100 75.56
26 10 30 10:1 100 48.23
27 40 30 30:1 100 57.15
28 40 30 10:1 100 51.19
29 25 70 20:1 70 90.90
30 40 30 10:1 40 64.12
表 2 响应面试验设计及结果
Table 2 Response surface design layout and experimental results
项目 平方和 自由度 均方 F值 P值
模型 4656.28 14 332.59 9.12 ＜ 0.0001
A 2× 10-4 1 2× 10-4 5.485× 10-6 0.9982
B 999.79 1 999.79 27.42 0.0001
C 63.06 1 63.06 1.73 0.2082
D 1006.81 1 1006.81 27.61 ＜ 0.0001
AB 30.17 1 30.17 0.83 0.3774
AC 3.21 1 3.21 0.088 0.7707
AD 97.47 1 97.47 2.67 0.1229
BC 95.70 1 95.70 2.62 0.1260
BD 134.62 1 134.62 3.69 0.0739
CD 15.62 1 15.62 0.43 0.5227
A2 0.76 1 0.76 0.021 0.8873
B2 0.063 11 0.063 1.723× 10-6 0.9674
C2 35.17 1 35.17 0.96 0.3416
D2 598.55 1 598.55 16.42 0.0010
残差 546.93 15 36.46
总差 5203.21 29
表 3 响应面试验方差分析
Table 3 Variance analysis for extraction rate of total flavonoids from
the leaves of Adinandra nitida with various extraction conditions
注：P＜ 0.05表示该因素对响应面影响显著。
表 1为响应面试验验因素及其变化范围，表 2为响
应面试验设计及结果。
表 3为响应面试验的方差分析结果，在选定的试验
范围内，提取时间和液固比对提取率的影响不显著(P值
分别为 0.9982、0.2082)。水浴温度和乙醇体积分数对提
取率的影响显著(P=0.001)，且水浴温度和乙醇体积的交
互作用对提取率也有影响(P=0.0739)。
将实验结果按标准二次项多项式回归，回归方程
为：提取率＝1.04342－0.21570A＋0.35430B＋2.11642C＋
1.67033D－4.57708×10-3AB－2.98750×10-3AC＋ 5.48472×
10-3AD－0.012228BC＋4.83437×10-3BD＋3.29375×10-3CD＋
2.40312× 10 -3A2＋ 3.89254× 10 -4B2－ 0.036843C2－
0.016888D2
由图 3各单因素对亮叶杨桐叶总类黄酮提取率的影
响可知，当提取时间超过 10min后提取率上升趋缓，这
与单因素试验结果相符，充分说明本实验中类黄酮的提
取是一个非常迅速的过程。吕丽爽等[8]在研究芦蒿中黄
酮类化合物提取时也曾出现这种现象。本实验的提取时
间如此之短可能是由于以下原因：①粉碎后，物料粒度
较细，表面积增大，且植物组织结构遭到了一定的破
坏；②乙醇是一种穿透细胞壁很强的溶剂；③物料中类
黄酮含量很高，提取时内外浓度差高，有利于缩短提
取时间。
提取温度对提取率的影响：随着提取温度升高，
分子运动速度加快，溶剂黏度降低，其渗透、溶解、
扩散速度加快，所以在不超过溶剂沸点的前提下，随
着提取温度升高提取率会逐渐上升。
9※工艺技术 食品科学 2010, Vol. 31, No. 22
液固比对提取率的影响：随着液固比的增大，可
降低提取液的浓度，有利于可溶成分从细胞内向细胞外
扩散，但当液固比超过 20 : 1 时，提取率无显著变化。
乙醇体积分数对提取率的影响：当乙醇体积分数高
于 40%时，随着乙醇体积分数的增大类黄酮的提取率增
加，当乙醇体积分数达到 60% 左右时，类黄酮在溶剂
中的溶解度最大、提取率最高，随着乙醇体积分数的
继续增加，类黄酮提取率下降，这可能是由于一些醇
溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，这些
成分与黄酮类化合物竞争与乙醇分子结合，导致类黄酮
的提取率下降。这与张德权等[9]报道的 60%左右体积分
数的醇类适于提取类黄酮苷类的结论一致。
进一步使用Design-Expert 7.0优化类黄酮提取条件，
经典型性分析获得的总类黄酮提取最适工艺条件为提取
时间 10min、乙醇体积分数 63.04%、水浴温度 70℃、
液固比 19.58，理论总黄酮得率为 99.64%。考虑到实际
操作的可行性和便利性将提取工艺条件修正为提取时间
10min、乙醇体积分数 63%、提取温度 70℃、料液比
20:1，经 3次实验确认，亮叶杨桐叶总类黄酮的实际得
率为(95.58± 0.49)%。
2.4 亮叶杨桐叶类黄酮抗肿瘤活性的研究
图 4 亮叶杨桐叶类黄酮对肺腺癌细胞 A549 增殖的抑制作用
Fig.4 Inhibitory effect of total flavonoids from the leaves of
Adinandra nitida on the proliferation of lung cancer A549 cells
60
50
40
30
20
10
0
24h
抑
制
率
/%
质量浓度 /(mg/L)
0 5 10 15 20
48h 72h
如图 4所示，亮叶杨桐叶类黄酮对肺腺癌细胞A549
具有一定的抑制作用，20mg/L亮叶杨桐叶类黄酮作用
72h后，对 A549细胞的抑制率达到 58.4%。且亮叶杨
桐叶类黄酮对A549细胞的抑制作用呈现显著的时间－效
应和剂量—效应关系。同一作用浓度下，随作用时间
的延长亮叶杨桐叶类黄酮抑制A549细胞的效果也越好；
而在作用时间相同的情况下，亮叶杨桐叶类黄酮浓度越
高则对A549细胞抑制率也越高。当作用时间为 72h时，
亮叶杨桐叶类黄酮对A549细胞的 IC50为 13.5μmol/L。
从细胞形态上观察，未添加亮叶杨桐叶类黄酮的对
照组细胞生长良好，细胞大小均匀，形态一致，胞质
丰富，死细胞较少。而在加入亮叶杨桐叶类黄酮化合
物 7 2 h 后，肿瘤细胞数量明显减少，细胞大小不一，
细胞核固缩，胞质减少，死细胞较多。表明亮叶杨桐
叶类黄酮对A549细胞具有一定的抑制作用。
文献资料[10-15]显示黄酮类化合物所具有的抗肿瘤活性
可能的作用机理包括抑制蛋白酶体、抑制脂肪酸合成、
抑制拓扑异构酶、抑制磷脂酰肌醇 3- 激酶、诱导细胞
周期阻滞、累积肿瘤抑制基因 p53及增强原癌基因 c-fos
和 c-myc的表达等。亮叶杨桐叶类黄酮抑制肺腺癌细胞
A549生长的具体生理机理有待于进一步研究。
图 3 单因素对提取率的影响
Fig.3 Single-factor investigations into the effects of various extraction
conditions on extraction rate of total flavonoids from the leaves of
Adinandra nitida
97.00
84.75
72.50
60.25
48.60
2
提
取
率
/%
提取时间 /min
10.0 17.5 25.0 32.5 40.0
103.2390
89.4289
75.6193
61.8096
48.0000
2
提
取
率
/%
提取温度 /℃
30 40 50 60 70
97.00
84.76
72.50
60.25
48.00
2
提
取
率
/%
液料比(mL/g)
10:1 15:1 20:1 25:1 30:1
2
乙醇体积分数/%
40 55 70 85 100
97.00
84.76
72.50
60.25
48.00
提
取
率
/%
A
B
C
D
2010, Vol. 31, No. 22 食品科学 ※工艺技术10
3 结 论
采用响应面试验设计，以粉碎的亮叶杨桐叶为原
料、乙醇 -水为溶剂，恒温振荡提取总类黄酮的最适工
艺条件为：提取时间 10min，乙醇体积分数 63%，提
取温度 70℃，料液比 1:20，总类黄酮得率为(95.58±
0.49)%。采用MTT法对亮叶杨桐叶中类黄酮物质抗肺腺
癌细胞 A549生长的活性进行了研究，结果显示亮叶杨
桐叶类黄酮对肺腺癌细胞 A549具有良好的抑制作用，
作用 72h时的 IC50为 13.5μmol/L，具体的抑制机理有待
于进一步研究。
参 考 文 献 ：
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《茶叶科学》征订征稿启事
《茶叶科学》——中文核心期刊，中国科学引文及中国学术期刊综合评价数据库来源期
刊，C A、C A B 等收录，影响因子等期刊评价指标列同类期刊第一。主要报道最新涉茶科技
成果，内容包括茶树栽培﹑育种﹑病虫害防治、茶叶加工﹑生化﹑机械﹑技术经济﹑茶饮料、
茶食品和保健品、茶的医用保健等。
《茶叶科学》自 2 00 8 年起改为双月刊，大 1 6 开本，每期定价 1 0 元，全年订价 6 0 元。
为简化手续，订刊只需在汇款单上写清收刊地址、收件人、订购数量等详细信息即可，并可
一次订购今后 1 ~ 3 年的期刊。款到即寄期刊及发票。免邮费。
征订方式：
①邮汇及寄稿：浙江省杭州市梅灵南路 9 号中国农业科学院茶叶研究所《茶叶科学》编
辑部，邮编：310008
②银行汇款：开户行：中国农业银行杭州市西湖支行，帐号：19-000101040005296，开
户单位：中国农业科学院茶叶研究所。汇款时请注明“茶叶科学”，并电子邮件告知详细联
系地址以及联系人。
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《茶叶科学》编辑部