全 文 ：收稿日期:2014-10-28; 修订日期:2015-03-27
基金项目:国家自然科学基金(No． 81203001;No． 81160558)
作者简介:杜迎翔(1966-)，男(汉族)，浙江宁波人，中国药科大学教授，博
士研究生导师，博士学位，主要从事药物分析相关研究工作．
双指标正交实验结合超高效液相色谱
测定优选胆木提取工艺
杜迎翔1，王 慧1，朱粉霞2，张志远3，翟小婷1，2
(1．中国药科大学，江苏 南京 210009;
2．江苏省中医药研究院 国家中医药管理局中药口服释药系统重点研究室，江苏 南京 210028;
3．海南医学院，海南 海口 570102)
摘要:目的 优选胆木的最佳回流提取工艺。方法 采用 L9(3)
4 正交试验设计法，考察乙醇浓度、料液比、提取时间、提取
次数 4 个因素的影响，用超高效液相色谱(UPLC)进行含量测定，以异长春花苷内酰胺和短小舌根草苷的含量为指标，加
权评分，优选胆木的最佳回流提取条件。结果 UPLC 方法学和正交试验结果表明，乙醇浓度在 80%，用 20 倍料液比提
取，每次提取 1 h，提取 3 次，为胆木的最佳提取工艺。结论 优选出的方法结果可靠、稳定可行，为胆木的进一步开发利用
提供参考。
关键词:胆木; 正交实验; 异长春花苷内酰胺; 短小舌根草苷; 超高效液相色谱
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2015． 06． 003
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2015)06-1288-03
Optimization of the Extraction Technology of Danmu by Synthetic Weighted Mark Meth-
od
DU Ying-xiang1，WANG Hui1，ZHU Fen-xia2，ZHANG Zhi-yuan3，ZHAI Xiao-ting1，2
(1． China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China;2． Key Laboratory of New Drug Delivery System
of Chinese Meteria Medica，Jiangsu Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210028，Chi-
na;3． Hainan Medicial University，Haikou 570102，China)
Abstract:Objective To study the optimum extraction process of Nauclea officinalis． Methods The influencing factors such as
the concentration of ethanol，extraction solvent ratio，extraction time and extraction times were optimized by orthogonal L9(3)
4 de-
sign experiment to screen out the best extraction conditions and the content of pumiloside and strictosamide were selected as quali-
ty index． Ｒesults The optimal procedure was set as follows:the concentration of ethanol is 80%;the extraction solvent ratio is 20
times;the extraction time is 1 hour;the extraction times is 3． Conclusion The technology is reasonable，stable and viable．
Key words:Nauclea officinalis; Orthogonal experiment; Pumiloside; Strictosamide; UPLC
胆木(Nauclea officinalis Pierre ex Pitard)，又名山熊胆、熊胆
树、乌檀，是茜草科植物胆木的枝、树皮，主要分布于我国海南、广
东、广西省区。其性味苦、寒，具有清热解毒、消肿止痛之功效。
民间常用于感冒发热、肺炎、肠炎、痢疾、湿疹、皮疹、脓疡等病的
治疗。胆木的主要成分为生物碱类物质，其所含的生物碱分为
两类［1］，为以异长春花苷内酰胺为代表的吲哚类生物碱和以短
小舌根草苷为代表的喹啉类生物碱［2 ～ 7］，这两种成分在胆木中含
量最高。目前，关于胆木提取工艺的研究报道仅有一篇［8］，且只
选用了单一成分异长春花苷内酰胺作为评价指标，难以全面反映
该药中活性成分的最佳提取工艺。
综合加权评分法是将多指标试验的结果，根据各项试验指标
在整个试验中的重要性，确定出其所占的权重，将多指标的试验
结果化为单指标的试验结果———综合加权评分值，然后按单指标
分析方法，对方案进行综合选优的一种方法。超高效液相色谱
(UPLC)是一种综合了小颗粒填料、非常低系统体积(死体积)及
快速检测手段等全新的检测技术，能显著改善分离度，具有分析
速度快、精密度高的特点。
本实验采用 L9(3)
4 正交设计法对胆木的回流提取工艺进行
研究，以乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数为考察因素，每
个因素选取 3 个水平，以异长春花苷内酰胺、短小舌根草苷 2 个
成分的含量作为评价指标，用 UPLC 进行含量测定，采用双指标
加权评分的方法优选出最佳回流提取工艺。
1 仪器与试剂
1． 1 仪器 Acquity UPLC (包括二元高压梯度泵、真空脱气机自
动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower 2 色谱工作站，
美国Waters公司);MT5 型分析天平(瑞士METTLEＲ TOLEDO公
司);Milli － Q 超纯水机(美国 millipore 公司);数显恒温水浴锅
(国华电器有限公司)。
1． 2 试剂 胆木药材(批次:110101)，由海南制药厂有限公司提
供;异常春花苷内酰胺(SS)和短小舌根草苷(PL)对照品为实验
室自制(纯度按 HPLC 面积归一化法测定均≥98%)［9］。乙腈
(色谱纯，德国 Merck公司);甲醇(色谱纯，山东禹王实业有限公
司化工分公司)。
2 方法与结果
2． 1 实验设计 采用正交设计法对胆木的最佳提取工艺进行优
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选。选取乙醇浓度(A)、乙醇用量(B)、提取时间(C)、提取次数
(D)为考察因素，每个因素选取 3 个水平，以异长春花苷内酰胺、
短小舌根草苷 2 个指标成分以及浸出物的含量作为评价指标，用
L9(3)
4 正交表进行实验。因素水平见表 1。
表 1 因素水平
水平
A
乙醇浓度 /%
B
乙醇用量 /倍
C
提取时间 /h
D
提取次数
1 60 12 1 1
2 70 16 1． 5 2
3 80 20 2 3
2． 2 指标成分的含量测定
2． 2． 1 混合对照品溶液的制备 精密称取异长春花苷内酰胺对
照品 4． 80mg，短小蛇根草苷对照品 0． 60mg，置于 10ml容量瓶，用
70%甲醇溶解并定容至刻度，0． 22μm 微孔滤膜过滤。即得混合
对照品溶液。
2． 2． 2 供试品溶液的制备 分别称取胆木药材 50g 9 份，按
L9(3)
4正交表进行正交实验，分别回流提取，滤过，合并滤液，测
量体积并记录。移取适量滤液，0． 22μm 微孔滤膜过滤，即得各
提取液的供试品溶液。
2． 2． 3 色谱条件 Phenomenex Kinetex C18 column (100 mm × 2． 1
mm，2． 6 μm);流动相为乙腈(A)－水(B)，梯度洗脱条件:0 min
～ 2 min，15 % ～19% A，2 min ～ 3 min，19 % ～21 % A，3 min ～ 5
min，21 % ～21 % A，5 min ～ 10 min，21 % ～38 % A，10 min ～ 12
min，38 % ～100 % A，12 min ～ 12． 5 min，100 % ～ 15 % A，12． 5
min ～ 13 min，15 % ～15 % A;流速:0． 3mL /min;柱温 35℃;进样
量 2 μl。混合对照品和胆木样品的色谱图见图 1。
1．短小舌根草苷 2．异长春花苷内酰胺
图 1 混合对照品(A)和样品(B)的色谱图
2． 3 方法学考察
2． 3． 1 线性关系考察 将“2． 2． 1”项下混合对照品溶液逐级稀
释成 2 倍、5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、100 倍，按“2． 2． 3”项下色谱
条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品的浓度(μg·ml －1)
为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。结果表明异长春花苷
内酰胺在 4． 8 ～ 480μg·ml －1与峰面积线性关系良好，回归方程
为:Y = 19063X + 83318，Ｒ2 = 0． 999;短小蛇根草苷在 0． 60 ～ 60μg
·ml －1与峰面积线性关系良好，回归方程为:Y = 37784X －
9997． 9，Ｒ2 = 0． 999。
2． 3． 2 仪器精密度 取混合对照品溶液，按“2． 2． 3”项下色谱条
件连续进样 6 次，测定峰面积。异长春花苷内酰胺和短小蛇根草
苷峰面积的 ＲSD 值分别为 0． 55%、0． 73%，表明仪器精密度良
好。
2． 3． 3 重复性 取 6 号供试品溶液 6 份，按“2． 2． 3”项下色谱条
件连续进样 6 次，测定峰面积。异长春花苷内酰胺和短小蛇根草
苷峰面积的 ＲSD 值分别为 0． 76%、0． 69%，表明仪器精密度良
好。
2． 3． 4 稳定性 取 6 号供试品溶液，分别在 0，2，4，6，8，10，12，24
h 按“2． 2． 3”项下色谱条件进行色谱分析。异长春花苷内酰胺和
短小蛇根草苷峰面积的 ＲSD值分别为 0． 87%、1． 65%，表明供试
品溶液在 24 h内稳定。
2． 3． 5 加样回收率 精密称取已知浓度的 6 号供试品溶液 6 份，
分别加入异长春花苷内酰胺和短小蛇根草苷对照品适量，并按
“2． 2． 3”项下色谱条件进行色谱分析。结果异长春花苷内酰胺
的平均回收率为 97． 08%，ＲSD 值为 2． 55%;短小蛇根草苷的平
均回收率为 104． 6%，ＲSD值为 3． 23%。
2． 4 浸出物含量测定 取“2． 2． 2”项下供试品溶液各 100ml，置
已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴上蒸干后，于 105℃烘箱干燥 3
h，置干燥器中冷却 30 min，迅速精密称定浸膏质量，并根据相应
供试品溶液的生药浓度计算浸膏得率。结果见表 2。
表 2 浸膏得率
编号 浸膏质量 /g 浸膏得率 /mg·g － 1
1 0． 2539 23． 10
2 0． 1073 30． 37
3 0． 0620 33． 67
4 0． 1006 31． 39
5 0． 2096 26． 41
6 0． 1010 35． 55
7 0． 1405 28． 52
8 0． 0863 36． 50
9 0． 1465 24． 61
2． 5 正交实验方案及结果 本次正交设计采用了双指标成分进
行分析测定，运用综合加权评分法对实验结果进行数据处理。设
定满分 100 分，其中异长春花苷内酰胺含量和短小舌根草苷含量
的权重系数分别为 0． 6 和 0． 4 ，在此基础上进行总加权评分，利
用综合评分值对实验结果进行评价(综合评分 =短小舌根草苷
质量分数 /最高短小舌根草苷质量分数 × 0． 4 × 100 +异长春花苷
内酰胺质量分数 /最高异长春花苷内酰胺质量分数 × 0． 6 × 100)。
结果见表 3 ～ 6。
以短小舌根草苷含量为评价指标时，用直观分析法分析各因
素的主次为:提取次数(D)＞乙醇浓度(A)＞提取时间(C)＞乙
醇用量(B)，最佳提取方案为 A3B3C1D3。以异长春花安内酰胺
含量为评价指标时，用直观分析法分析各因素的主次为:乙醇浓
度(A)＞提取次数(D)＞提取时间(C)＞乙醇用量(B)，最佳提
取方案为 A3B3C1D3。以综合评分为评价指标时，用直观分析法
分析各因素的主次为:提取次数(D)＞乙醇浓度(A)＞提取时间
(C)＞乙醇用量(B)，最佳提取方案为 A3B3C1D3。最终选择
A3B3C1D3，即乙醇浓度在 80%，用 20 倍料液比提取，每次提取 1
h，提取 3 次最佳。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2015 VOL． 26 NO． 6 时珍国医国药 2015 年第 26 卷第 6 期
表 3 正交实验结果及统计处理
实验
号
因素
A B C D
短小舌根
草苷
/mg·g － 1
异长春花
苷内酰胺
/mg·g － 1
综合
评分
1 1 1 1 1 0． 41 2． 67 56． 04
2 1 2 2 2 0． 48 3． 40 69． 19
3 1 3 3 3 0． 65 3． 30 76． 71
4 2 1 2 3 0． 69 3． 62 82． 96
5 2 2 3 1 0． 50 3． 10 66． 32
6 2 3 1 2 0． 59 4． 15 84． 66
7 3 1 3 2 0． 61 3． 86 81． 93
8 3 2 1 3 0． 77 4． 61 100． 00
9 3 3 2 1 0． 50 3． 48 71． 27
短小舌根草苷
K1 0． 51 0． 57 0． 59 0． 47
K2 0． 59 0． 58 0． 56 0． 56
K3 0． 63 0． 58 0． 59 0． 70
极差 0． 12 0． 011 0． 03 0． 23
异长春花苷内酰胺
K1 3． 02 3． 38 3． 81 3． 09
K2 3． 62 3． 60 3． 40 3． 70
K3 3． 99 3． 64 3． 42 3． 84
极差 0． 96 0． 26 0． 41 0． 75
综合评分
K1 67．31 73．64 80．23 64．54
K2 77．98 78．50 74．47 78．59
K3 84．40 77．55 74．99 86．56
极差 17．09 4．86 5．76 22．02
表 4 短小舌根草苷方差分析
方差来源 偏差平方和 自由度 F比 P值
A 0． 022 2 110 P ＜0． 01
C 0． 002 2 10 P ＞0． 05
D 0． 084 2 420 P ＜0． 01
误差 0． 0002 2
F0． 05(2，2)=19． 00，F0． 01(2，2)=99． 00
表 5 异长春花苷内酰胺方差分析
方差来源 偏差平方和 自由度 F比 P值
A 1． 415 2 12． 094 P ＜0． 1
C 0． 323 2 2． 761 P ＞0． 1
D 0． 975 2 8． 333 P ＞0． 1
误差 0． 12 2
F0． 1(2，2)=9． 00，F0． 05(2，2)=19． 00
表 6 综合评分方差分析
方差来源 偏差平方和 自由度 F比 P
A 533． 964 2 20． 047 P ＜0． 05
C 78． 748 2 2． 957 P ＞0． 05
D 739． 810 2 27． 776 P ＜0． 05
误差 26． 64 2
F0． 1(2，2)=9． 00，F0． 05(2，2)=19． 00
2． 6 验证实验 分别称取胆木药材 50g，共 3 份，用 80%乙醇
1000ml(20 倍)提取 3 次，每次 1 h。回流提取后过滤，合并滤液，
测量体积并记录。移取适量滤液，0． 22μm微孔滤膜过滤，用 UP-
LC测定含量。结果见表 7。
表 7 胆木提取工艺验证结果 mg·g － 1
序号 短小舌根草苷 异长春花苷内酰胺
1 0． 79 4． 81
2 0． 81 4． 92
3 0． 78 4． 76
结果显示，短小舌根草苷的平均含量为 0． 79mg /g，ＲSD 为
2． 14%(n = 3);异长春花苷内酰胺的平均含量为 4． 8mg /g，ＲSD
为 3． 20%(n = 3)。表明重复性较好，本研究确定的最佳提取工
艺切实可行。
3 讨论
3． 1 评价指标 胆木的主要活性成分为生物碱，其中含量最多的
是吲哚类生物碱和喹啉类生物碱。异常春花苷内酰胺是胆木中
含量最多的吲哚类生物碱，而短小舌根草苷是胆木中含量最多的
喹啉类生物碱。据文献报道，短小舌根草苷具有显著药理活
性［10，11］。用单一成分的含量为指标难以全面反映药材中各活性
成分的最佳提取工艺。用异长春花苷内酰胺和短小舌根草苷的
含量进行双指标综合评分，更能全面反映胆木药材的质量优劣。
3． 2 方法学考察 文章在用正交实验优选胆木提取工艺的同时，
也进行了方法学考察。方法学的结果表明，该方法在一定浓度范
围内有良好的线性关系，仪器精密度、重复性良好，药材提取液在
24h 内稳定，加样回收率良好。
3． 3 量取方法 采用正交方法提取中药后，如将各方法中的提取
液定容至相同体积存在诸多不便:①提取液体积较大，用常规的
容器难以定容;②提取液体积差异较大，最大的将近 3000ml，最
小的不足 800ml，若定容将造成溶剂浪费。有文献［12］采用如下方
法:先将提取液回收溶剂再定容至相同体积，再取等量定容后的
提取液进行稀释或者蒸干后复溶后进行测定。考虑到回收溶剂
的过程中，药液浓度过高，会有成分过饱和析出，而鉴于中药的特
殊性，析出后常常难以再复溶。因此，本文采取了提取后直接测
量体积再进行定量分析的方法。
3． 4 浸膏得率 浸出物是中药复方的药效物质基础，浸出物含量
的变化会影响有效成分的含量，并最终影响药物的临床疗效。但
考虑到浸膏物中除了药物有效成分外，还含有一定杂质，不能完
全反映出有效成分的含量。故本文将浸膏得率作为参考指标，与
综合评分的结果进行比较分析。结果显示，不同提取方法的浸膏
得率与综合评分结果是一致的。
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