全 文 ：工 艺 技 术 Vol . 33 , No . 05 , 2012
2012年第5期
[6] 肖杭，黎云祥，蔡凌云，等. 超声辅助法提取白簕茎皮总黄
酮的工艺研究[J]. 光谱实验室，2010，27（1）：197-201.
[7] 陈群. 荷叶黄酮超声波辅助提取工艺研究[J]. 食品工业，2010
（3）：50-52.
[8] 姜立春，黄成思，杨澈，等. 川佛手总黄酮提取及抗氧化性
研究[J]. 江苏农业科学，2010（3）：340-342.
[9] 吴立军. 天然药物化学[M]. 第五版.北京：人民卫生出版社，
2007：169-170.
山黄皮（Clausena indica（Datz）.Oliv.）俗称鸡皮 果，主产于我国广西西南部、云南南部、广东新会及
越南北部和菲律宾[1]。山黄皮营养价值高，果实总酸
度为2.28%，含总糖9.8%，蛋白质1.39%，维生素C
74mg/100g，总固形物17.5%，氨基酸总量1710mg/100g，
此外还含有丰富的铁、钙等各种营养元素[2]。广西山
黄皮资源丰富，产品出口东南亚及港澳地区，成为著
名的龙州三宝（枧木砧板、山黄皮、桄榔粉）之一，是
李昌宝1，2，游向荣1，*，孙 健1，李 丽1，张娥珍1，王振兴1，邱文武3，王文林3
（1.广西农业科学院农产品加工研究所，广西南宁 530007；
2.广西作物遗传改良生物技术重点实验室，广西南宁 530007；
3.广西亚热带作物研究所试验站，广西龙州 532415）
摘 要：采用超声强化提取山黄皮果中的总黄酮，通过正交实验方法确定山黄皮果总黄酮优化的提取工艺，并测定其
对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）和羟自由基（·OH）的清除效果。 结果发现，在本实验条件下，超声强化
提取山黄皮果总黄酮的优化提取工艺条件为提取温度70℃、液料比40∶1（v/m）、乙醇浓度60%（v/v）、提取时间60min；在
优化条件下，山黄皮果总黄酮得率为3.82%±0.02%；山黄皮果总黄酮对DPPH·和·OH均有较强的清除能力。 研究可为
山黄皮果开发利用提供参考。
关键词：山黄皮果，总黄酮，超声波提取，抗氧化活性
Study on ultrasonic extraction of flavonoids from
Clausena indica（Datz）.Oliv. and its antioxidative activity
LI Chang-bao1，2，YOU Xiang-rong1，*，SUN Jian1，LI Li1，ZHANG E-zhen1，WANG Zhen-xing1，
QIU Wen-wu3，WANG Wen-lin3
（1.Institute of Agro-food Science & Technology，Guangxi Academy of Agricultrual Sciences，Nanning 530007，China；
2.Guangxi Crop Genetic Improvement Laboratory，Nanning 530007，China；
3.Guangxi Subtropical Crops Research Institute Experimental Station，Longzhou 532415，China）
Abstract：The optimum conditions for extracting flavonoids in Clausena indica（Datz）.Oliv by ultrasonic were
determined by using the orthogonal experimental design. Meanwhile，the flavonoids effect on removal of·OH
and DPPH·was investigated. The result showed that the optimal technological parameters were as follows：the
extracting temperature was 70℃，the ratio of solvent and material was 40∶1（v/m），the concentration of solvent
was 60%（v/v），and the extracting time was 60min. Under the optimum conditions，the total extracting rate was
as high as 3.82%±0.02%. The flavonoids from Clausena indica（Datz）.Oliv showed good effect on removal of
·OH and DPPH·. This study provided application and development of Clausena indica（Datz）.Oliv fruit.
Key words：Clausena indica（Datz）.Oliv fruit；total flavonoids；ultrasonic extraction；antioxidative activity
中图分类号：TS255.1 文献标识码：B 文 章 编 号：1002-0306（2012）05-0265-04
收稿日期：2011－05－26 * 通讯联系人
作者简介：李昌宝（1981-），男，硕士，研究方向：农产品加工与综合
利用。
基金项目：广西农业科学院科技发展基金（2011JM21）；广西农业科学
院科技发展基金（201006）。
超声强化提取山黄皮果总黄酮
及其抗氧化活性的研究
!
!
!
!
##############################################
265
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2012.05.001
Science and Technology of Food Industry 工 艺 技 术
2012年第5期
一种具有开发应用前景的资源。黄酮类化合物由于
具有活泼的羟基氢而具有抗氧化性，是许多中草药
的主要有效成分之一。此类化合物能够抑制脂质过
氧化作用（LPO）、血小板凝聚、毛细管渗透性、脆性，
以及降低环氧合酶和脂肪氧合酶等的活性[3-4]。其在
医药领域，在延缓衰老、防治心脑血管疾病等方面具
有积极作用。常见的黄酮类物质提取方法有碱性水
提取法、醇提取法和其它有机溶剂提取法等，但这些
方法存在提取温度高、用时长等缺点，使黄酮类物质
因为离子化、氧化和水解而损失[5]。超声强化提取是
一种操作简单，效率较高的技术，采用超声波强化从
植物中提取活性物质可减少溶剂用量和提取的时
间，降低提取温度，有利于提取热敏感物质和不稳定
的物质[6-7]。近年来，山黄皮果、叶中总黄酮的提取已
有报道[8-9]，但对其抗氧化活性未见涉及。本实验采用
超声强化提取山黄皮果中黄酮类化合物，以总黄酮
得率为考察指标，通过单因素实验和正交实验的方
法对提取工艺条件进行研究，确定其优化提取工艺，
并对山黄皮果总黄酮的抗氧化性进行测定。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
山黄皮果 采摘于广西龙州广西亚热带作物研
究所实验站，挑选颜色（黄色）、成熟度（9成熟）一致，
无病虫害的果实作为原料，果实可溶性固形物含量
17%±0.2%；芦丁（生化试剂，纯度≥98%）、亚硝酸
钠、硝酸铝、氢氧化钠、95%乙醇 均为分析纯。
BILON-2008低温超声波萃取仪 上海比朗仪
器有限公司；FW 800型高速万能粉碎机 天津市泰
斯特仪器有限公司；UV-3200 PCS型紫外可见分光
光度计 上海美普达仪器有限公司；101-2型电热恒
温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械厂；AR124CN型
电子天平 奥豪斯仪器有限公司；DKS-12型不锈钢
新型电热恒温水浴锅 杭州蓝天化验仪器厂。
1.2 实验方法
1.2.1 工艺流程 山黄皮果→去核→60℃干燥至水分含
量3.37%±0.2%→粉碎→过60目筛→按一定液料比加入乙醇
溶剂→超声波处理→过滤→定容→测定吸光值
1.2.2 回归方程的建立 采用亚硝酸钠-硝酸铝比
色法，称取芦丁标准品0.1g，用30%乙醇溶解并定容
至500mL，分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、4.5mL芦丁
待测液于10mL刻度具塞试管中，加入5%亚硝酸钠
0.3mL后放置6min，加入10%硝酸铝0.3mL，再放置
6min，加入4%氢氧化钠4mL，最后用30%乙醇溶液补
充到10mL，静置15min，510nm处测吸光度，并建立回
归方程：C=0.1375×A-0.0007，R2=0.9997。
1.2.3 总黄酮含量测定 称取1g山黄皮果粉末，用
95%乙醇溶解浸提24h后，经超声波辅助提取，过滤
并浓缩后，用30%乙醇定容至50mL，吸取2mL于10mL
具塞试管中，然后按照1.2.2测定吸光值。通过回归方
程计算得到总黄酮含量。
1.2.4 超声提取工艺条件 准确称取一定量的山黄
皮果干粉，在不同乙醇浓度、提取温度、液料比和提
取时间条件下在超声波仪中进行提取。将提取液过
滤、定容，测定吸光度，计算总黄酮含量。以每g干粉
所提取的总黄酮（以芦丁计）的g数表示总黄酮得率。
在单因素实验基础上，选取提取时间、温度、液料比、
乙醇浓度4个因素，每个因素3个水平，总黄酮得率为
考察指标，进行L9（34）正交实验，优化总黄酮提取的
工艺条件。各因素与水平设计见表1。
1.2.5 DPPH自由基清除率的测定 参考Larrauri和
Yokozawa等[10-11]的测定方法，在此基础上进行了修改，
分别取2mL浓度为25、50、100、200、300μg/mL的待测
液体于具塞试管中，加入2×10-4mol/L的DPPH溶液2mL，
摇匀，30min后，在515nm处测定其吸光度值Ai；同时测
定2mL DPPH溶液与2mL 70%乙醇混合后的吸光度值
Ac和2mL待测液与2mL 70%乙醇混合后的吸光度值Aj，
均以70%乙醇作参比。根据下式计算清除率：
清除率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%
式中Ac：DPPH与溶剂混合液的吸光值；Ai：DPPH
与样液反应后的吸光值；Aj：样液与溶剂混合液的吸
光值。以抗坏血酸（VC）作阳性对照。
1.2.6 羟自由基（·OH）清除率的测定 本实验在
Smironff[12]等报道的方法的基础上进行了改进，在具
塞试管中依次加入9mmol/L FeSO4溶液2mL、9mmol/L
水杨酸-乙醇溶液2mL、浓度为25、50、100、200、
300μg/mL的样液2mL和8.8mmol/L H2O2 2mL，摇匀，
于37℃水浴中反应30min，在510nm下测定吸光度值
AX。并按相同方法，测定不加样液的溶液的吸光度
A0，不加H2O2溶液的吸光度AX0，均以蒸馏水为参比。
清除率计算公式如下：
清除率（％）=[A0-（AX-AX0）]/A0×100%
式中：A0：空白对照液的吸光度；AX：加入样液后
的吸光度；AX0：不加H2O2样液的吸光度。以抗坏血酸
（VC）作阳性对照。
1.2.7 数据处理 运用SAS软件进行处理。
2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 乙醇浓度对山黄皮果总黄酮得率的影响 在
液料比40∶1（v/m）、温度50℃、时间60min条件下，分别
选取不同体积分数的乙醇溶液对材料进行超声提
取，然后测定总黄酮含量，结果如图1所示。
单因素方差分析得，F=330.05，p<0.01，表明乙醇
浓度对山黄皮果总黄酮得率影响极显著。从图1可
知，随着乙醇浓度的增加，总黄酮得率呈先增加后减
少的趋势。当乙醇浓度为60%时，总黄酮得率达到最
大值，之后随着乙醇浓度的增加，黄酮类化合物得率
呈下降趋势。原因可能是乙醇浓度增高后，使一些醇
溶性杂质和亲脂性色素等成分溶出量增加，这些成
表1 因素水平表
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments
水平
因素
A 时间
（min）
B 温度
（℃）
C 液料比
（v/m）
D 乙醇浓度
（%）
1 30 50 30∶1 45
2 45 60 40∶1 60
3 60 70 50∶1 75
266
工 艺 技 术 Vol . 33 , No . 05 , 2012
2012年第5期
分与黄酮类化合物竞争同乙醇水分子结合，从而导
致黄酮类化合物的提取量下降[13-14]。
2.1.2 超声处理时间对山黄皮果总黄酮得率的影响 在
温度50℃、乙醇浓度60%、液料比40∶1（v/m）条件下，
分别超声强化处理15、30、45、60、75min，然后测定其
总黄酮得率，结果如图2所示。
单因素方差分析得F=29.56，p<0.01，表明超声强
化处理时间对山黄皮果总黄酮得率影响极显著。从
图2可以看出，总黄酮得率随处理时间的延长而逐渐
升高，但45min后总黄酮得率变化不大。这是因为用
超声提取45min，总黄酮的浸出已经很充分；而当时
间超过45min后，随着提取时间的延长，得率反而越
低，这可能是由于超声的作用时间太长而破坏其中
的有效成分。
2.1.3 液料比对山黄皮果总黄酮得率的影响 在温
度50℃、乙醇浓度60%、处理时间为45min条件下，分
别选取液料比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1进行提取，
然后测定总黄酮含量，结果如图3所示。
单因素方差分析得F=33.34，p<0.01，表明液料比
对山黄皮果总黄酮得率影响极显著。由图3可知，随
着液料比的增加总黄酮得率逐渐增加，当液料比达
到40∶1后得率变化不大，由于液料比越大，溶剂的用
量就会增加，导致提取成本增高，而且增加除去溶剂
的难度，因此选取液料比40∶1为最佳液料比。
2.1.4 提取温度对山黄皮果总黄酮得率的影响 在
乙醇体积分数60%、超声处理时间45min、液料比40∶1，
不同温度条件下进行提取，然后测定总黄酮含量，结
果如图4所示。
单因素方差分析得F=5.83，p<0.05，表明提取温
度对山黄皮果总黄酮得率影响显著。由图4可知，随
着提取温度的升高总黄酮提取量逐渐增加，当提取
温度达到60℃后得率变化不大。从节约能耗和黄酮
得率等角度考虑，选取60℃为最佳提取温度。
2.2 正交实验结果
在单因素实验的基础上，选用L9（34）正交表进行
实验方案设计，其因素水平设置见表1，实验结果见
表2。
图1 乙醇浓度对山黄皮果总黄酮得率的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of
flavonoids extraction from fruit of Clausena indica（Datz）.Oliv
乙醇浓度（%）
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
总
黄
酮
得
率
（
%）
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
表2 正交实验结果表
Table 2 Results of orthogonal test
实验号 A B C D 总黄酮得率（%）
1 1 1 1 1 3.55
2 1 2 2 2 3.75
3 1 3 3 3 3.77
4 2 1 2 3 3.68
5 2 2 3 1 3.79
6 2 3 1 2 3.75
7 3 1 3 2 3.70
8 3 2 1 3 3.74
9 3 3 2 1 3.81
k1 3.69 3.64 3.68 3.72
k2 3.74 3.76 3.75 3.73
k3 3.75 3.78 3.75 3.73
R 0.05 0.13 0.08 0.01
图2 超声处理时间对山黄皮果总黄酮得率的影响
Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of
flavonoids extraction from fruit of Clausena indica（Datz）.Oliv
超声处理时间（min）
4.25
4.00
3.75
3.50
3.25
3.00
2.75
总
黄
酮
得
率
（
%）
0 15 30 45 60 75 90
图3 液料比对山黄皮果总黄酮的影响
Fig.3 Effect of different liquid to solid ratio on the extraction rate
of flavonoids extraction from fruit of Clausena indica（Datz）.Oliv
液料比（v/m）
4.0
3.5
3.0
2.5
总
黄
酮
得
率
（
%）
0 20∶1 40∶1 60∶1
图4 提取温度对山黄皮果总黄酮得率的影响
Fig.4 Effect of temperature on the extraction rate of flavonoids
extraction from fruit of Clausena indica（Datz）.Oliv
提取温度（℃）
4.2
4.0
3.8
3.6
3.4
3.2
总
黄
酮
得
率
（
%）
20 30 40 50 60 70 80 90
表3 正交设计方差分析结果
Table 3 Analysis of variances of orthogonal design
变异来源 自由度 均方 F P 显著性
A 2 0.002 1.16 0.342
B 2 0.026 15.36 0.017 显著
C 2 0.018 10.45 0.032 显著
D 2 0.001 0.47 0.531
误差 2 0.002
267
Science and Technology of Food Industry 工 艺 技 术
2012年第5期
由表2可以看出，影响山黄皮果总黄酮得率的因
素主次顺序为：提取温度（B）＞液料比（C）＞时间（A）＞
乙醇浓度（D）。
由表2可知，超声波提取山黄皮果总黄酮的最佳组
合为A3B3C2D2，即提取时间60min、提取温度70℃、液料
比40∶1、乙醇体积分数60%。对最佳工艺条件A3B3C2D2
进行3次平行实验，结果山黄皮总黄酮的得率为3.82%±
0.02%，比梁云贞[9]报道的微波方法提取山黄皮果黄
酮类化合物得率3.621%高，可见，超声强化提取山黄
皮果中的黄酮类物质效果优于微波提取法。
由表3方差分析看出，在超声波提取山黄皮果总
黄酮正交实验中所选择的因素和水平范围内，提取温
度和液料比都达到显著水平（P<0.05），而其它各因素
影响不显著。
2.3 山黄皮果总黄酮抗氧化活性实验结果
2.3.1 山黄皮黄酮对DPPH自由基清除作用 以抗
坏血酸（VC）作对照，测定了山黄皮果总黄酮清除DPPH
自由基的能力，结果见图5。
统计分析，T=6.94，p=0.0023<0.01，山黄皮和VC
清除DPPH·效果差异显著。由图5可知，山黄皮果总
黄酮和VC对DPPH·的清除能力随着浓度的增大而增
强，当浓度大于100μg/mL时，两者的提高速率变缓，
山黄皮果总黄酮的清除率高于VC，说明山黄皮果的
黄酮提取物对DPPH·具有较强的清除作用。
2.3.2 山黄皮果总黄酮对OH自由基清除作用 以
抗坏血酸（VC）作对照，测定山黄皮果黄酮清除羟自
由基的能力，结果见图6。
统计分析，T=5.05，p=0.0073<0.01，山黄皮果和VC
清除·OH效果差异显著。由图6可知，山黄皮果总黄
酮提取物及抗坏血酸（VC）两者对·OH的清除能力随
其质量浓度的增加而增大。在25～300μg/mL浓度范围
内，山黄皮果总黄酮提取物对·OH的清除能力比抗坏
血酸（VC）强。
3 结论
采用超声波强化处理技术提取山黄皮果的总黄
酮，通过单因素实验和正交实验得出最佳工艺条件
为超声提取时间60min、提取温度70℃、液料比（v/m）
40∶1、乙醇体积分数60%；在此工艺条件下，山黄皮果
的总黄酮得率为3.82%±0.02%。山黄皮果的总黄酮对
羟自由基（·OH）和1，1-二苯基-2-苦苯肼自由基
（DPPH·）均有较好的清除效果，是一种有效的外源
性抗氧化剂，其清除机理有待进一步研究。
参考文献
[1] 黄峰，何铣扬，雷艳梅． 极具发展前景的山黄皮果[J]． 中国
热带农业，2005（4）：30-31．
[2] 黄峰， 何铣扬． 广西山黄皮生产发展面临的问题及对策[J]．
广西热带农业，2006（4）：15-16．
[3] 唐传核，彭志英 ． 类黄酮的最新研究进展（I）-抗氧化研究
[J]．中国食品添加剂，2001（5）：12-16．
[4] 唐传核，彭志英． 类黄酮的最新研究进展（Ⅱ）-生理功能[J]．
中国食品添加剂，2002（1）：5-10．
[5] 于晶，郝再彬，苍晶，等． 黄酮类化合物的活性研究进展[J]．
东北农业大学学报，2008，39（12）：125-130．
[6] 李巧玲． 黄酮类化合物提取分离工艺的研究进展[J]． 山西食
品工业，2003，12（4）：6-7．
[7] Kamaljit Vilkhu， Raymond Mawson， Lloyd Simons，et al.
Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction
in the food industry-A review[J]. Innovative Food Science &
Emerging Technologies，2008，9（2）：161-169.
[8] 梁云贞，彭金云，李怡，等． 微波辅助提取山黄皮果中的黄
酮类物质[J]． 安徽农业科学，2010，38（14）：7269-7271．
[9] 梁云贞，彭金云，李怡，等． 微波辅助提取山黄皮叶黄酮类
物质的工艺研究[J]． 广东农业科学，2010（8）：153-155．
[10] Larrauri JA， Sanchez-Moreno C， Saura-Calixto F. Effect of
temperature on the free radical scavenging capacity of extracts
from red and white grape pomace peels[J]. Agric Food Chem，
1998，46（7）：2694-2697.
[11] Yokozawa T， Dong E， Natagawa T， et al. In vitro and in
vivo studies on the radical-scavenging activity of tea[J]. Agric
Food Chem，1998，46（6）：2143-2150.
[12] Smironff N， Cumbes QJ. Hyroxyl radical scavenging activity
of compatible solutes[J]. Phytochemistry，1989，28（3）：1057-1060.
[13] 华景清，蔡健． 苦瓜总黄酮提取工艺[J]． 食品与发酵工业，
2004，30（6）：131-134．
[14] 单宇，王鸣，冯煦，等． 小麦麸皮中总黄酮的最佳提取工艺
研究[J]． 中药材，2005，28（3）：223-225．
图5 山黄皮果总黄酮对DPPH·的清除效果
Fig.5 Scavenging effect of flavonoids extraction from fruit of
Clausena indica（Datz）.Oliv on DPPH·
浓度（μg/mL）
100
90
80
70
60
50
40
30
DP
PH
·
清
除
率
（
%）
0 100 200 300
山黄皮果总黄酮
VC
图6 山黄皮果总黄酮对·OH的清除效果
Fig.6 Scavenging effect of flavonoids extraction from fruit of
Clausena indica（Datz）.Oliv on·OH
浓度（μg/mL）
100
90
80
70
60
50
40
30
20
OH
·
清
除
率
（
%）
0 50 100 150 200 250 300
山黄皮果总黄酮
VC
268