全 文 ：105※工艺技术 食品科学 2009, Vol. 30, No. 14
亮叶杨桐叶类黄酮的提取及其抗氧化活性研究
袁尔东 1，王菊芳 2，刘本国 3，宁正祥 1
(1. 华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640；2. 华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510006；
3. 河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003)
摘 要：采用水提法从亮叶杨桐叶中提取类黄酮物质，通过响应面实验，确定其最适提取工艺条件为：沸水提取
36min、液料比 20:1。在此条件下，总类黄酮得率 8.20%，在粗提物中山茶苷A含量达 59.3%。采用不同方法测
定了该类黄酮提取物的抗氧化活性，结果表明其对DPPH自由基和超氧阴离子均有较好的清除效果，呈明显的剂量 -
效应关系，同时其还原力与浓度也呈现良好的线性关系(R2 = 0.9895)。
关键词：亮叶杨桐；类黄酮；提取；抗氧化
Extraction and Antioxidant Activity of Flavonoids from Adinandra nitida Leaves
YUAN Er-dong1，WANG Ju-fang2，LIU Ben-guo3，NING Zheng-xiang1
(1. College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China；
2. School of Biological Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China；
3. School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)
Abstract ：Cheap and easily available Adinandra nitida leaves contain more than 20% flavonoid compounds that have numerous
biological functions such as antioxidation, reducing blood lipid, lowering blood pressure, antimicrobial action, etc. Hot water was
adopted to extract flavonoids from Adinandra nitida leaves in the present study. The extraction technique was optimized using
response analysis methodology and antioxidant activities of the flavonoids extracted from Adinandra nitida leaves were evaluated
by measuring DPPH and superoxide anion radical scavenging activity and reducing power. The optimal extraction conditions
were as follows: extraction duration 36 min, water temperature 100 ℃, and ratio of water to material 20:1, and under such conditions
the predicted and actual values (an average of three repeats) of flavonoids yield were 8.24% and 8.20%, suggesting that the
validity of established regression model was good. HPLC Analysis indicated that the flavonoid extract contained 59.3%
camellianin A. The flavonoid extract could significantly scavenge DPPH and superoxide anion free radicals in a dose-dependent
manner, meanwhile a linear correlation between its concentration and reducing power was also observed (R2 = 0.9895).
Key words：Adinandra nitida；flavonoid；extraction；antioxidant activity
中图分类号：R151.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)14-0105-05
收稿日期：2008-11-19
作者简介：袁尔东(1975－)，女，讲师，博士，研究方向为食品化学及食品生物技术。E-mail：erdyuan@scut.edu .cn
亮叶杨桐(Adinandra nitida)为茶科(Theaceae)杨桐属
(Adinandra)植物，主要分布于我国的广西、广东、贵
州等省区，在华南民间广泛饮用的代茶——石崖茶(石芽
茶)就是以其鲜嫩叶为原料制成的。石崖茶具有消炎解
毒、降压、退热、止血、杀菌、镇痛等多种功能，
民间常用它来防治各种炎症、无名肿痛及外伤等疾病，
均有明显的效果且无任何副作用[1]。目前，在广西等地
已有较大面积亮叶杨桐的人工种植基地，但对其的开发
利用仍还限于初级茶叶加工。近年的研究显示，亮叶
杨桐叶中的类黄酮含量超过 20%[2]，包括山茶苷 A、山
茶苷 B 和芹菜素等，其中以山茶苷 A 的含量为最高[3 ]。
药理学研究表明，类黄酮具有显著的抗氧化、降血脂、
降血压、抗菌等作用。因此，研究从价廉易得的亮叶
杨桐叶中制备高附加值的类黄酮产品，具有广阔的开发
应用前景。本实验研究亮叶杨桐叶中类黄酮的提取及其
抗氧化活性，以期为亮叶杨桐的深度开发和利用提供有
益的参考。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
亮叶杨桐叶(含水量 9.7%)产于广西省平乐县， 2006
年秋采摘。
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二苯基苦味肼基(DPPH) Sigma公司；吩嗪硫酸甲
酯(PMS)、还原型辅酶 I(NADH)、氯化硝基四氮唑蓝
(NBT) 上海生工生物工程技术有限公司。
高效液相色谱仪 美国Waters公司。
1.2 方法
1.2.1 亮叶杨桐叶中类黄酮提取工艺的优化
1.2.1.1 亮叶杨桐叶中类黄酮的提取
称取一定量的亮叶杨桐叶，加入一定体积的水，
保温提取一段时间后趁热过滤，将滤液于 2℃下静置 24h
后，滤出沉淀，干燥得到亮叶杨桐叶类黄酮提取物。
1.2.1.2 响应面试验
选取温度、时间、液料比影响类黄酮提取效果的
主要因素，以类黄酮得率为指标，采用 Design Expert
7.0中的响应面试验设计法(response surface method，
RSM)，进行温度、时间、液料比三因素共 20 个实验
点的试验，以优化提取工艺条件。
1.2.1.3 类黄酮得率的计算
由于国内外均无山茶苷A的商业标准品，本研究采
用经高速逆流色谱分离后再冷冻干燥得到的自制山茶苷
A 作为标准品(经 HPLC、UV、IR、MS、NMR 鉴定
为纯度极高的单一成分)。
取山茶苷A标样 11.4mg溶于一定量的甲醇中，用
甲醇定容至 100ml，混合均匀，得山茶苷A的标准溶液。
分别取上述山茶苷 A 标准溶液 0、0 .25、0 . 5、1、2、
4ml于 6个 10ml容量瓶中，用体积分数 50%的甲醇溶液
定容，混合均匀后，测定其在 330nm波长处的吸光度，
以含山茶苷A标准溶液 0ml的试液为空白参比。以吸光
度为横坐标、山茶苷 A 浓度为纵坐标(μg/ml)，绘制标
准曲线。
准确称取一定量的类黄酮提取物，定容于一定体积
的甲醇中，混合均匀，于波长 33 0n m 处测定吸光度。
在山茶苷 A 浓度 - 吸光度标准曲线上查出相应的浓度，
计算亮叶杨桐叶提取物中类黄酮含量X(%)。类黄酮得率
按以下公式计算：

B×X
类黄酮得率(%)=————× 100

A
式中：A为亮叶杨桐叶的质量(g)；B为类黄酮提取
物的质量(g )；X 为提取物中类黄酮含量(%)。
1.2.2 提取物中山茶苷 A含量的测定
1.2.2.1 色谱条件
色谱柱：Diamonsil(r) C18(4.6× 250mm，5μm)；
流动相：甲醇:水 =1:1(V/V)；流速：1.0ml/min；检测
波长：2 6 5 n m；进样量：1 0μl。
1.2.2.2 山茶苷A浓度 -峰面积标准曲线的绘制
准确称取山茶苷 A标准品 25mg，溶解于适量甲醇
中，再定容至 25ml。分别取上述溶液 0.5、1、2、5、
8ml用甲醇定容至 10ml，得到不同浓度标准溶液。取上
述标准溶液过 0.45μm滤膜后进行HPLC分析，绘制色
谱峰面积 - 山茶苷 A 浓度标准曲线。
1.2.2.3 山茶苷 A含量的测定
准确称取一定量的提取物样品，充分溶解于甲醇
中，定容过 0 .45μm 滤膜，进行 HPLC 分析，依据标
准曲线计算其中山茶苷 A 含量。
1.2.3 亮叶杨桐叶类黄酮提取物的抗氧化活性测定
1.2.3.1 DPPH自由基清除率的测定
参照 Heo的方法[ 4]，分别吸取浓度为 0.05、0.1、
0.3、0.5、0.8、1.0mg/ml提取物样品的乙醇溶液 2ml，
加入 2× 10-4mol/L的DPPH乙醇溶液 2ml，摇匀后，在
室温下黑暗处放置 30min。以无水乙醇调零，测定517nm
处的吸光度(A 样品)。同时，测定样品溶液 2.0ml与乙醇
2.0ml混合液在 517nm处的吸光度(A空白)，再测定 2.0ml
DPPH溶液与 2.0 ml乙醇在 517nm处的吸光度(A对照)。同
一实验重复 3 次。

A样品－A空白
DPPH自由基清除率(%)=(1－——————)× 100

A对照
1.2.3.2 超氧阴离子自由基清除率的测定
参照 Candan的方法[5]，分别吸取浓度为 1、2、3、
4、5mg/ml提取物样品的乙醇溶液 0.1ml，与 1ml含 557
μmol/L的NADH缓冲溶液(Tris-HCl，16mmol/L，pH8.0)，
1ml含 45μmol/L的 PMS缓冲溶液(Tris-HCl，16mmol/L，
pH8.0)，1ml含 108μmol/L的 NBT的缓冲溶液(Tris-HCl，
16mmol/L，pH8.0)相混合，在 25℃ 放置 5min后，以
Tris-HCl缓冲液(16mmol/L，pH8.0)调零，测定波长560nm
处的吸光度( A 样品)，样品浓度为零时测得的吸光度为
A 对照。同一实验重复 3 次。

A样品－A对照
超氧阴离子自由基清除率(%)=(1－——————)×100

A对照
1.2.3.3 还原力的测定
参照 Ardes ta ni的方法[ 6]，1ml 浓度分别为 0 .1、
0.3、0.5、0.8、1.0mg/ml的提取样品液加入 2.5ml 磷酸
缓冲液(pH6.6，0.2mol/L)及2.5ml质量分数1%的K3Fe(CN)6，
于 50℃水浴中反应 20min后迅速冷却，并加入 2.5ml质
量分数 10%的三氯乙酸(TCA)溶液，以 3000r/min离心
10min后取上清液 2.5ml，并加入 2.5ml蒸馏水及 0.5ml质
量分数为 0.1%的 FeCl3溶液，混合均匀，于 10min后，
测定波长 700nm的吸光度。反应物的吸光度越大表示还
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原力越强。同一实验重复 3 次。
2 结果与分析
2.1 亮叶杨桐叶类黄酮测定方法的比较
采用 AlCl3显色法，以芦丁为标准样来测定亮叶杨
桐叶中总类黄酮含量[ 1 , 7 - 9]，基于类黄酮能和 A l 3 +相螯
合，生成黄色的显色物(在 410～430nm的范围内有吸收
峰)[10]，但在本研究中，山茶苷A的溶液在加入Al3+后，
紫外吸收光谱并未像芦丁那样发生红移现象(图 1)，这说
明山茶苷A与Al3+不发生螯合作用。根据Khokhar等[11]
的报道，满足下列条件之一的类黄酮才能螯合金属离
子：① 有如 3-4，7-8这样的邻双羟基结构；② 3-OH
和 4位上的羰基同时存在；③ 5-OH和 4位上的羰基同
时存在。然而对于亮叶杨桐叶中的最主要类黄酮——山
茶苷 A，其结构上无相邻的双羟基，5位上的羟基又被
糖基所取代，不满足上述任何条件，从而不具有螯合
Al3+、生产黄色显色物的能力。因此，采用 AlCl3显色
法可能无法反映亮叶杨桐叶中类黄酮含量。
图 1 芦丁、山茶苷A与Al3+螯合的紫外图谱比较
Fig.1 UV absorption spectra of rutin and camellianin A as well as
their separate chelate complex with Al3+
本研究采用经高速逆流色谱分离后再冷冻干燥的山
茶苷A晶体作为标准品，采用紫外分光光度法测定类黄
酮含量。虽然山茶苷 A、山茶苷 B、芹菜素在 2 6 0、
330nm处均有最大吸收，但由于蛋白、酚酸、核酸等
在 2 6 0 n m 附近具有吸收，因此将检测波长确定在
330nm。
2.2 亮叶杨桐叶类黄酮提取工艺条件的优化
编号 A提取时间(min) B液料比(V/m) C提取温度(℃) 类黄酮得率(%)
1 30 15 80 3.48
2 40 10 100 6.89
3 30 20 90 3.93
4 40 20 100 8.21
5 30 10 90 5.21
6 30 15 90 4.85
7 30 15 90 4.79
8 30 15 90 4.9
9 30 15 90 4.85
10 20 10 100 6.22
11 20 20 80 2.87
12 20 10 80 3.67
13 30 15 90 5.18
14 30 15 100 8.04
15 30 15 90 4.8
16 20 20 100 7.74
17 40 10 80 2.77
18 40 15 90 4.12
19 20 15 90 4.87
20 40 20 80 3.78
表1 类黄酮提取响应面试验方案及结果
Table 1 Response surface analysis central composite design
arrangement and the experimental data
项目 平方和 自由度 均方 F值 Prob> F
模型 46.41 9 5.16 18.02 < 0.0001
A 0.02 1 0.02 0.06 0.8179
B 0.31 1 0.31 1.09 0.3201
C 42.15 1 42.15 147.25 < 0.0001
AB 0.32 1 0.32 1.13 0.3124
AC 0.16 1 0.16 0.56 0.4724
BC 0.86 1 0.86 3.02 0.1128
A2 0.27 1 0.27 0.95 0.3519
B2 0.16 1 0.16 0.55 0.4740
C2 2.48 1 2.48 8.67 0.0147
残差 2.86 10 0.29
总差 49.27 19
表2 类黄酮提取响应面试验结果的方差分析
Table 2 Analysis of variance for the flavonoid yield with various
extraction conditions
Design-Expert 7.0软件给出的类黄酮最适提取条件
为：提取时间 36min、液料比 20、提取温度 100℃，其
理论类黄酮得率为 8.24%。经过三次验证实验，在该提
取条件下，亮叶杨桐叶类黄酮的实际得率为 8.20%。
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
258
A
波长(nm)
I.芦丁；II .芦丁 +Al 3+。
220 300 400 500
273.4
360.6
417.8
Ⅱ
Ⅰ
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
A
波长(nm)
I.山茶苷 A；II.山茶苷 A+Al 3+。
220 300 400 500
263
Ⅱ
Ⅰ
262.4
328.8
328.2
影响亮叶杨桐叶类黄酮提取效果的因素包括提取温
度、提取时间和液料比等，根据前期单因素试验结
果，以类黄酮得率为指标，采用 Design-Expert 7.0软
件设计如表 1所示的响应面试验方案。表 2为响应面试
验结果的方差分析，其中提取温度对类黄酮得率有显著
影响，而在试验设定的范围内提取时间和液料比的影响
并不明显。
2009, Vol. 30, No. 14 食品科学 ※工艺技术108
将亮叶杨桐叶类黄酮提取物进行 HPLC分析，图 2
为其色谱图，经测定其主要成分—— 山茶苷 A 的含量达
到 59.3%。
2.3 亮叶杨桐叶类黄酮提取物的抗氧化活性分析
2.3.1 亮叶杨桐叶类黄酮提取物对DPPH自由基的清除
能力
研究表明，自由基与机体的许多功能障碍和疾病的
发生有关。因此，研究自由基的检测方法并探讨物质
对自由基的清除作用具有重要意义。DPPH(二苯代苦味
酰自由基)分析法被广泛用于清除自由基物质性质的研
究，D P PH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其在
517nm附近有强吸收(呈深紫色)。当自由基清除剂存在
时，DPPH的孤对电子被配对，其 517nm吸收消失或减
弱，通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂
的活性[ 1 2 ]。
如图 3所示，随着亮叶杨桐叶类黄酮提取物浓度的
上升，其DPPH自由基清除率也迅速上升，二者呈现良
好的线性关系(R2=0.9967)。提取物浓度为 1mg/ml时，其
对DPPH自由基的清除率达到 77.5%。因此，亮叶杨桐
叶类黄酮提取物具有较好的清除 D PPH 自由基的活性
(IC50=0.62mg/ml)。
2.3.2 亮叶杨桐叶类黄酮提取物对超氧阴离子自由基
的清除能力
超氧阴离子自由基是形成最早的、最重要的、与
人类关系最密切的自由基之一，可通过减低或抑制酶的
活性而影响代谢，造成氧中毒。如图 4 所示，亮叶杨
桐叶类黄酮提取物具有一定的清除超氧阴离子自由基的
活性，清除效果随浓度的增大而增加，当浓度为 5mg/ml
时其清除率为 24.58%。
2.3.3 亮叶杨桐叶类黄酮提取物的还原力
食用抗氧化剂抗氧化活性的测定，主要基于不同抗
氧化防御体系机理，及活性氧和羟自由基的减少、脂
质过氧化的抑制、金属离子的螯合。在大多数情况，
抗氧化作用与氧化链式反应的阶段无关，大多数非酶抗
氧化作用(自由基的清除、脂质过氧化的抑制等)受氧化
还原反应的调节，因此本研究考察亮叶杨桐叶类黄酮提
取物对铁离子的还原力(700nm波长处的吸光度越大表明
还原力越强)。如图 5 所示，亮叶杨桐叶类黄酮提取物
的还原力随浓度的上升而线性上升(R2=0.9895)。
图2 山茶苷A标准品(A)和亮叶杨桐叶类黄酮提取物(B)的高效液相色
谱图
Fig.2 HPLC chromatograms of standard camellianin A and
flavonoid extract of Adinandra nitida leaves
0.6
0.4
0.2
0
A
U
时间(min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
12.22
6.12
8.57
B
图3 亮叶杨桐叶类黄酮提取物对DPPH自由基的清除率
Fig.3 Relationship between DPPH free radical scavenging activity
and concentration of flavonoid extract of Adinandra nitida leaves
100
80
60
40
20
0
清
除
率
(%
)
浓度(mg/ml)
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
图4 亮叶杨桐叶类黄酮提取物对超氧阴离子自由基的清除能力
Fig.4 Relationship between superoxide anion free radical
scavenging activity and concentration of flavonoid extract of
Adinandra nitida leaves
30
25
20
15
10
5
0
清
除
率
(%
)
浓度(mg/ml)
0 1 2 3 4 5
图5 亮叶杨桐叶类黄酮提取物的还原力
Fig.5 Relationship between reducing power and concentration of
flavonoid extract of Adinandra nitida leaves
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
吸
光
度
增
加
量
浓度(mg/ml)
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
0.3
0.2
0.1
0
A
U
时间(min)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
12.28
A
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3 结 论
根据响应面试验结果，确定亮叶杨桐叶类黄酮的最
佳提取工艺条件为：沸水提取 36min、液料比 20:1，在
该条件下类黄酮得率为 8.20%，提取物中山茶苷A含量
为 59.3%。抗氧化实验显示，亮叶杨桐叶类黄酮提取物
具有较强的自由基清除能力和还原力。
参考文献：
[1] 陈美珍, 余杰, 佘纲哲, 等. 野生石芽茶营养成分与药用成分的分析
[J]. 天然产物研究与开发, 1996, 8(1): 84-86.
[2] 刘本国. 亮叶杨桐叶中类黄酮的提取、鉴定与修饰[D]. 广州: 华南
理工大学, 2007.
[3] 刘本国, 战宇, 许克勇, 等. 液质联用鉴定亮叶杨桐叶中的类黄酮化
合物[J]. 食品研究与开发, 2007, 28(3): 118-120.
[4] HEO S J, PARK E J, LEE K W, et al. Antioxidant activities of enzy-
matic extracts from brown seaweeds[J]. Bioresource Technology, 2005,
96: 1613-1623.
[5] CANDAN F, UNLU M, TEPE B, et al. Antioxidant and antimicrobial
activity of the essential oil and methanol extracts of Achillea millefolium
subsp. millefolium Afan. (Asteraceae)[J]. J Ethnopharmacol, 2003, 87:
215-220.
[6] ARDESTANI A, YAZDANPARAST R. Antioxidant and free radical
scavenging potential of Achillea santolina extracts[J]. Food Chemistry,
2007, 104: 21-29.
[7] 袁萍, 王国亮, 钱少华, 等. 石崖茶活性成分分析[J]. 食品科学, 1999,
20(8): 75.
[8] 陈粤, 佘纲哲, 陈鸿霖. 亮叶杨桐黄酮提取物抗肿瘤活性及其对小
鼠 p53基因表达活性的影响[J]. 天然产物研究与开发, 1998, 10(3):
52-56.
[9] 余杰, 陈美珍. 亮叶杨桐中类黄酮提取及其抗氧化、抑菌作用的研
究[J]. 汕头大学学报:自然科学版, 1997, 12(2): 52-58.
[10] CORREIA H, GONZALEZ-PARAMAS A, AMARAL M T, et al.
Characterisation of polyphenols by HPLC-PAD-ESI/MS and antioxi-
dant activity in Equisetum telmateia[J]. Phytochemical Analysis. 2005,
16(5): 380-387.
[11] KHOKHAR S, OWUSU APENTEN R K. Iron binding characteristics
of phenolic compounds: some tentative structure-activity relations[J].
Food Chemistry, 2003, 81(1): 133-140.
[12] SRIVASTAVA A, HARISH S R, SHIVANANDPPA T. Antioxidant
activity of the roots of Decalepis hamiltonii (Wight & Arn)[J]. LWT-
Food Science and Technology, 2006, 39(10): 1059-1065.