全 文 ：ChineseJournalofNewDrugs2009, 18(22)
2151　　
中国新药杂志 2009年第 18卷第 22期
[基金项目 ] 　教育部科学技术研究重点项目(208051);江苏省中医药局科研项目计划(HZ07069);江苏省普通高校研究生科研创新计划项目
(2007238)
[作者简介 ] 　单进军 ,男 ,博士 ,助理研究员。联系电话:(025)85811146, E-mail:dfsj@163.com。
[通讯作者 ] 　狄留庆 ,男 ,教授 ,主要从事中药新型给药系统的研究。联系电话:(025)85811071, E-mail:diliuqing@yahoo.com.cn。
·实验研究·
祖师麻甲素在 Caco-2细胞模型中的吸收机制研究
单进军 1 ,沙先谊2 ,方晓玲 2 ,吴　皓 3 ,狄留庆3
(1南京中医药大学第一临床医学院 ,南京 210046;2复旦大学药学院 ,上海 200433;
3南京中医药大学中医药研究院 ,江苏省中药炮制重点实验室 ,南京 210029)
　　[摘要 ] 　目的:研究祖师麻甲素在 Caco-2细胞模型中的吸收特性 ,为其及祖师麻给药途径的选择
和剂型的合理设计提供依据 。方法:采用 Caco-2细胞单层模型研究祖师麻甲素的摄取和跨膜转运 ,采
用 HPLC法检测药物浓度 ,计算其表观渗透系数 ,考察时间 、温度 、pH值 、药物浓度以及 P-gp抑制剂对
祖师麻甲素吸收的影响 。结果:祖师麻甲素以被动扩散为主要方式被细胞摄取和转运 。药物的摄取与
时间 、温度和浓度呈正相关 ,不受媒介 pH值的影响 。祖师麻甲素从 Basolateral-Apical方向转运要稍快
于相反方向 。随着药物浓度的增加 ,比值呈降低趋势 , 但变化不大 。 P-gp抑制剂维拉帕米对祖师麻甲
素的转运无显著性影响 。结论:祖师麻甲素是以被动扩散为主要方式被小肠上皮细胞摄取和转运 ,此
过程不受 P-gp的外排作用 。
[关键词 ] 　祖师麻甲素;Caco-2细胞;吸收
[中图分类号 ] R965　　[文献标志码 ] A　　[文章编号 ] 1003-3734(2009)22-2151-04
MechanismofdaphnetinabsorptionacrossCaco-2 monolayermodel
SHANJin-jun1 , SHAXian-yi2 , FANGXiao-ling2 , WUHao3 , DILiu-qing3
(1 TheFirstMedicineColege, NanjingUniversityofChineseMedicine, Nanjing210046, China;2 Schoolof
Pharmacy, FudanUniversity, Shanghai200433, China;3 NanjingUniversityofChineseMedicine, Jiangsu
ProvincialKeyLaboratoryforChineseDrugsProcesing, Nanjing210029 , China)
[ Abstract] 　Objective:ToinvestigatetheintestinalabsorptionofdaphnetinandthemechanismusingCa-
co-2 monolayermodel.Methods:TheCaco-2 celmonolayermodelwasusedtostudythebi-directionaltrans-
portofdaphnetinandtheefectsoftime, temperature, pH, drugconcentrationandP-gpinhibitoronthedaph-
netinabsorption.DrugconcentrationwasmeasuredbyHPLCandtheapparentpermeabilitycoeficients(Papp)
werecalculated.Results:Theuptakeandabsorptionofdaphnetinwerepassivedifusionasthedominant
process.ThedaphnetinuptakeandabsorptionwasnotcontroledbypH, butpositivelycorelatedtouptaketime
andtemperature.Pappofbasolateraltoapicalwasslightlyhigherthanthatofapicaltobasolateral.Theinhibitor
ofP-gp, verapamil, didnotsignificantlyenhancetheuptakeamountofdaphnetin.Conclusion:Thepassivedif-
fusionisthemajortransportofdaphnetinuptakeandabsorptionbyCaco-2monolayer.P-gphasnoefluxefects
ontheuptakeandtransepithelialtransportofdaphnetin.
[ Keywords] 　daphnetin;Caco-2cel;absorption
　　祖师麻系瑞香科植物黄瑞香 Daphnegiraldi Nifshe、陕西瑞香 DaphnetanguticeMaxim.或凹叶瑞
ChineseJournalofNewDrugs2009, 18(22)
2152　
中国新药杂志 2009年第 18卷第 22期
香 DaphneretusaHemsi.的干燥茎皮及根皮 ,具有祛
风湿 ,活血止痛的功效 ,用于风湿痹痛 、关节炎 、类风
湿性关节炎。研究表明祖师麻甲素(daphnetin,又称
瑞香素)有较好的抗炎镇痛作用 [ 1] ,是祖师麻治疗
类风湿关节炎的主要活性成分。目前有关祖师麻甲
素的研究主要集中在药理方面 ,有关其体内过程的
研究报道很少 。
Caco-2细胞模型被认为是进行药物吸收研
究最好的体外模型之一 ,与药物体内吸收有良好
的相关性 ,其结果的重现性也很理想 ,因此被国
外广泛采用 [ 2-3] 。祖师麻甲素在 Caco-2细胞模
型中的吸收特性作者尚未见国内外文献报道 , 本
实验旨在运用 Caco-2细胞模型研究祖师麻甲素
的吸收机制 ,探讨时间 、温度 、pH值 、药物浓度等
对祖师麻甲素转运的影响 ,以期通过与在体模型
实验数据 [ 4]相结合阐明祖师麻甲素的吸收特性 ,
为其及祖师麻给药途径的选择及剂型的合理设
计提供生物药剂学基础 。
材　　料
Agilent1100型高效液相色谱仪 , HP1100型二
极管阵列检测器 , AgilentChemStation色谱工作站
(美国 Agilent公司);跨膜电阻仪 , Milicel膜(Mili-
pore,美国)。
祖师麻甲素对照品购于中国药品与生物制品检
定所 (HPLC检测纯度大于 98%, 批号:0900 -
200102)。
甲醇为色谱纯 (江苏汉邦科技有限公司);
DMSO、冰醋酸为分析纯 (中国医药 (集团)上海
化学试剂公司);DMEM培养基(Dulbecco smod-
ifiedEagle smedium)、胎牛血清(fetalbovineser-
um)、非必需氨基酸(nonessentialaminoacids)、青
链霉素 、0.25%胰蛋白酶 -0.02%EDTA消化液和
Hanks缓冲溶液 (HBSS)均购自 Gibco公司;3H
甘露醇(9.25 ×106Bq, Sigma);水为三蒸水 。 Ca-
co-2细胞株 ,购自美国 ATCC(AmericanTypeCulture
Colection)。
方　　法
1　Caco-2细胞模型的建立
应用 DMEM培养液 (高糖):包括 10%胎牛
血清 、1%非必须氨基酸 、1%丙酮酸钠 、1%谷氨
酞胺和 1%青链霉素 。细胞培养在 75 cm2卡氏
培养瓶 ,置于 37℃培养箱中 , 通入 5% CO2(相
对湿度 90%)。 2d换 1次培养液 ,每 5d按 1∶3
的比例传代 。将细胞按 50 00 0· cm-2接种到 35
mm培养皿中 ,接种后每 2 d换液 1次 , 1周后每
日换液 ,培养至 15 d用于药物的细胞摄取实验 。
将细胞按 50 000·cm-2接种到 Milicel膜上 , 接
种后每 2 d换液 1次 , 1周后每日换液 , 培养至
21d,满足跨膜电阻 >600 Ψ·cm-2和 3H甘露醇
表观渗透系数 Papp<1 ×10-6 cm·s-1的膜用于
药物转运实验 。
2　祖师麻甲素溶液配制
精密称取祖师麻甲素对照品适量 , DMSO溶解
制成祖师麻甲素浓溶液 ,实验前用相应 pH值的
PBS+缓冲液稀释至所需浓度 ,其中最终 DMSO浓度
低于 1%。
3　祖师麻甲素细胞摄取试验
将培养 15d的 Caco-2细胞与 37 ℃ PBS+缓
冲溶液在培养箱中共浴 20 min, 吸去缓冲溶液 。
用 PBS+缓冲溶液冲洗细胞单分子层表面的杂
质 。加入含祖师麻甲素的 HBSS溶液 0.4 mL,分
别考察时间 、药物浓度 、pH值 、温度 、P-糖蛋白
(P-glycoprotein, P-gp)抑制剂对祖师麻甲素细胞
摄取的影响 ,试验结束后冲洗细胞单分子层 。细
胞刮取器刮下细胞 ,用 0.1 mol·L-1HCl1 mL冲
洗细胞到 Eppendorf管中 ,超声粉碎细胞 ,一部分
测定祖师麻甲素含量 ,一部分用考马思亮蓝法测
定细胞蛋白含量 。
4　祖师麻甲素细胞转运试验
用 pH6.0 PBS+溶液配制浓度为 1, 2.5, 5μg·
mL-1的祖师麻甲素溶液 ,经过滤除菌 ,取符合转运
条件且细胞生长形态完好的 Milicel膜 , 用空白
pH7.4PBS+溶液 37℃共浴 20min, HBSS溶液冲洗
3遍 。对于从 Apical(肠腔侧 )到 Basolateral(基底
侧)转运:将药物溶液 0.4mL加到 Apical作为供给
池 ,同时 Basolateral侧加入空白 pH7.4 HBSS0.6
mL作为接收池;对于从 Basolateral到 Apical转运:
将药物溶液 0.6mL加到 Basolateral侧作为供给池 ,
空白 HBSS溶液 0.4mL加到 Apical侧作为接受池 。
将 Milicel膜置转速为 50 r·min-1的 37 ℃恒温振
荡水槽中 ,分别在 15 , 30, 45, 60, 90, 120min吸取接
受液 0.3mL,同时补加 37℃空白 pH7.4 PBS+溶液
0.3mL。
5　样品分析
ChineseJournalofNewDrugs2009, 18(22)
2153　　
中国新药杂志 2009年第 18卷第 22期
色谱条件:YMCODSC18色谱柱(150mm×
4.6mm, 5 μm);流动相为甲醇 -0.5%醋酸(25∶
75);检测波长 327nm;流速 1mL·min-1;柱温 30
℃;进样量 20 μL。在此色谱条件下进行祖师麻
甲素含量测定方法学考察 。取摄取或转运样品
高速离心 15min(10 000 r·min-1), 取上清液 20
μL进样 。
6　数据分析
表观渗透系数 Papp的计算:Papp=(dQ/dt)/
(ACo),其中 dQ/dt为单位时间药物转运量 (μg·
min-1);A为转运膜的面积 ,此时 A为 0.6 cm2;C0
为祖师麻甲素的初始浓度(μg·mL-1)。
结　　果
1　祖师麻甲素含量分析方法的建立
本实验色谱条件下 ,瑞香素的保留时间为 10.7
min,峰形较好 。在空白 PBS+溶液测定的标准曲线
为(Y=0.115 7X-1.549 4, r=0.999 4)。线性范
围为 0.039-5.04μg·mL-1 ,检测限为 4ng,在线性
范围内方法回收率为 95.3% ～ 104.1%;相对标准
偏差小于 5%。
2　祖师麻甲素细胞摄取与时间的关系
图 1表示 Caco-2细胞对 2.5μg·mL-1祖师麻甲
素的摄取一开始(0到 15min内)较快 ,在 15min至
120min内随摄取时间的延长而呈线性增加(R2 =
0.995 3),因此在以下药物摄取试验中 ,摄取时间定
为 120min。
图 1　不同时间 Caco-2细胞对祖师麻甲素摄取
实验(n=3, x±s)
3　祖师麻甲素细胞摄取与介质 pH值的关系
分别在 pH值为 6.0 , 7.0 , 7.4, 8.5的 PBS+
介质条件下 , 测定 Caco-2细胞对 2.5μg·mL-1祖
师麻甲素的摄取 ,细胞摄取量分别为 (2.28 ±0.
245), (2.24 ±0.492), (1.97±0.090), (2.04
±0.100)μg·mg-1 (protein)。采用双侧 t检验
表明 ,各 pH值下细胞对祖师麻甲素的摄取量无
统计学意义 (P>0.05)。由此可知祖师麻甲素
细胞摄取不受介质 pH值的影响 ,因此在本实验
介质的 pH值控制在 7.0。
4　祖师麻甲素细胞摄取与温度的关系
分别考察了 4 ℃, 25 ℃, 37 ℃条件下 Caco-2
细胞对 2.5μg·mL-1祖师麻甲素的摄取 ,细胞摄
取量分别 为 (0.542 ±0.121), (0.714 ±0.
177), (1.79 ±0.097)μg·mg-1 (protein)。结果
表明药物的细胞摄取受温度的影响 ,随着温度的
升高 ,摄取量增加 。
5　祖师麻甲素细胞摄取与浓度的关系
测定 Caco-2细胞对 1 ～ 5 μg·mL-1祖师麻甲素
的摄取 ,结果见图 2,药物摄取量随浓度的增加而呈
线性增加。
图 2　不同药物浓度下 Caco-2细胞对祖师麻
甲素摄取实验(n=3 , x±s)
6　祖师麻甲素双向转运 Papp值及 P-gp抑制剂对其
转运的影响
表 1　不同浓度及 P-gp抑制剂对祖师麻甲素双向
转运的影响 n=3, x±s
祖师麻溶液浓度
/μg·mL-1
Papp×106 /cm· s-1
AP-BL BL-AP
BL-AP
/AP-BL比值
1 6.99±0.78 12.47±2.37 1.8
2.5 19.88±1.07 29.60±2.84 1.5
5 27.14±0.37 32.01±1.85 1.2
2.5μg·mL-1 +维拉帕米
(50μmol·L-1)
20.32±1.74 27.56±2.47 1.4
ChineseJournalofNewDrugs2009, 18(22)
2154　
中国新药杂志 2009年第 18卷第 22期
　　测定了祖师麻甲素在 1 ～ 5 μg·mL-1吸收和
分泌时的表观渗透系数 ,结果见表 1。结果表明 ,
祖师麻甲素从 Basolateral-Apical方向转运要稍快
于相反方向 ,且具有统计学意义(P<0.05)。随
着药物浓度的增加 ,比值呈降低趋势 ,但变化不
大 。考察 P-gp抑制剂维拉帕米对祖师麻甲素细
胞摄取的影响 ,表明抑制剂维拉帕米对药物的双
向转运未有显著影响 。
讨　　论
Caco-2细胞来源于人类结肠癌细胞 ,其结构和
生化特点类似于人类小肠上皮细胞 ,含有与小肠刷
状缘上皮相关的酶 ,能够在细胞水平提供关于药物
分子通过小肠黏膜的吸收 、代谢转运信息 。本实验
采用 Caco-2细胞模型研究了祖师麻甲素的摄取 、转
运及其影响因素 。研究表明 ,祖师麻甲素的摄取不
受溶液的 pH值的影响;药物的摄取随着温度的升
高而显著增加 。药物摄取量随浓度的增加而呈线性
增加 ,表明祖师麻甲素的跨细胞膜转运主要是被动
扩散 ,这也与我们之前在体试验结果一致[ 4] 。不同
浓度下祖师麻甲素在 Caco-2细胞模型的表观渗透
系数 Papp均大于 10-6cm·s-1 ,说明祖师麻甲素具有
良好的吸收能力。
P-gp是一种多药耐药基因(MDR1)调控的外排
蛋白 ,主要功能是外排各种外来异物 ,保护机体不受
外来异物的侵扰 [ 5] 。 Gregory等从分子生物学的角
度发现祖师麻甲素不受 P-gp介导的多药耐药的调
控 [ 6] 。Caco-2细胞中存在比较丰富的 P-gp表达。
本实验结果从另一方面证明了祖师麻甲素在跨膜转
运中未受到 P-gp的介导 ,而是以被动扩散为主要方
式被细胞摄取 。
在进行祖师麻甲素吸收特征研究的同时 ,我们
发现 AP侧溶液 HPLC图谱中除了祖师麻甲素色谱
峰外仍有 2个特征色谱峰(如图 3 ～ 5)。
图 3　空白 PBS+缓冲液色谱图
　　由于祖师麻甲素含有 2个酚羟基 ,而 Caco-2细
胞中存在一定量的代谢酶如葡萄糖醛酸转移酶 、硫
酸转移酶等 ,我们推测祖师麻甲素在这些代谢酶的
作用下发生了Ⅱ相代谢反应 ,部分转化成极性较大
的代谢产物;由于极性的增大 ,导致这些代谢产物未
能透过细胞膜而留在肠腔侧 ,具体代谢产物及代谢
途径正在进一步研究中。
[ 　参　考　文　献　]
[ 1] 　高钦 ,单进军 ,许惠琴,等.瑞香素对佐剂性关节炎大鼠滑膜组
织的影响 [ J].中国新药杂志 , 2007, 16(24):2021-2023.
[ 2] 　YEES.InvitropermeabilityacrossCaco-2cels(colonic)canpre-
dictinvivo(smalintestinal)absorption[ J] .PharmRes, 1997, 14
(6):763-766.
[ 3] 　ANNETTEB, SIBYLLEH, KAYOSHIS, etal.Celculturesastools
inbiopharmacy[J] .EurJPharmSci, 2000, 11(Suppl2):51-60.
[ 4] 　钱桂英 , 单进军 , 狄留庆 ,等.瑞香素大鼠在体肠吸收动力学
的研究 [ J] .南京中医药大学学报(自然科学版), 2007, 23
(3):177-178.
[ 5] 　STOUCHTR, GUDMUNDSSONO.Progressinunderstandingthe
structure-activityrelationshipsofP-glycoprotein[J].AdvDrugDe-
livRev, 2002, 54(3):315-328.
[ 6] 　GREGORYJF, BERNADETTESC, DENISEAE.Daphnetinin-
duceddiferentiationofhumanrenalcarcinomacelsanditsme-
diationbyp38 mitogen-activatedproteinkinase[ J] .Biochem
Pharmacol, 2004, 67(9):1779-1788.
编辑:周卓 /接受日期:2009-01-20