全 文 ： 2012, Vol. 33, No. 12 食品科学 ※分析检测228
蚕蛹蛋白及其水解产物中氨基酸组成分析
吕汶骏 1，赵钟兴 1 , *，廖丹葵 1，孙建华 1，黄科林 2，孙果宋 2，吴志洪 2，童张法 1
(1.广西大学化学化工学院，广西石油资源加工与过程强化重点实验室，广西 南宁 530004；
2.广西化工研究院，广西 南宁 530004)
摘 要：采用 FMOC-OPA 柱前衍生化 -高效液相色谱法测定蚕蛹蛋白及水解液氨基酸含量，同时测定血管紧
张素转化酶(ACE)抑制活性，研究蚕蛹蛋白水解后氨基酸组成的改变及对 ACE 抑制活性的影响。结果表明：
水解液 10kD以下组分(SN2)中疏水性氨基酸含量为 49.15%，显著高于 10kD以上组分(SN1)中的 40.55%及蚕蛹
蛋白中的 45 .21%，其中对 AC E 抑制活性影响较大的脯氨酸、芳香族氨基酸含量为 7 .75% 和 19 .20%，高于
SN1中的 5.62%和 13.59%及蚕蛹蛋白中的 7.42%和 15.81%，并且 SN2中 ACE抑制率为 47.6%显著高于 SN1和
蚕蛹蛋白中的抑制率，表明水解后疏水性氨基酸组成的改变与 A CE 抑制活性的变化趋势相同，且 A CE 抑制
活性主要集中于 SN 2。
关键词：蚕蛹；水解液；氨基酸；高效液相谱；A C E 抑制活性
Amino Acid Compositions of Silkworm Pupa Protein and Its Hydrolysates
LU
..
Wen-jun1，ZHAO Zhong-xing1,*，LIAO Dan-kui1，SUN Jian-hua1，HUANG Ke-lin2，SUN Guo-song2，
WU Zhi-hong2，TONG Zhang-fa1
(1. Guangxi Key Laboratory of Petrochemical Resources Processing and Process Intensification Technology,
School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China ；
2. Guangxi Research Institute of Chemical Industry, Nanning 530004, China)
Abstract ：The amino acid compositions of silkworm pupa protein and its hydrolysates prepared with neutral protease were
determined by reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) with precolumn derivatization. Meanwhile,
their ACE inhibitory activity was also tested. The results indicated that the content of hydrophobic amino acids in the
hydrolysate ultrafiltration fraction SN2 (＜ 10 kD) was 49.15% compared to 40.55% for the hydrolysate ultrafiltration fraction
SN1 (＞ 10 kD) and 45.21% for silkworm pupa protein. The contents of proline and aromatic amino acids (Trp, Phe and Tyr),
which had great effect on ACE inhibitory activity, were 7.42% and 15.81%, respectively. Moreover, the ACE inhibitory rate of
SN2 was 47.6%, which was remarkably higher than that of SN1 and silkworm pupa protein, suggesting that the change trends of
hydrophobic amino acid composition and ACE inhibitory activity are the same and that the ACE inhibitory activity is mostly
concentrated on SN2.
Key words：silkworm pupa；hydrolysate；amino acid；high performance liquid chromatography (HPLC)；ACE
inhibitory activity
中图分类号：Q566.3 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2012)12-0228-05
收稿日期：2012-01-06
基金项目：广西自然科学基金项目(2010GXNSFA013058)；广西研究生教育创新计划项目(105930901005)；
广西大学科研基金项目(XGL090021)
作者简介：吕汶骏(1988—)，男，硕士研究生，研究方向为生物化工。E-mail：luyou4488@163.com
*通信作者：赵钟兴(1979—)，男，讲师，博士研究生，研究方向为生物化工。E-mail：zzxx@gxu.edu.cn
蚕蛹(silkworm pupa)为蚕蛾科昆虫家蚕蛾的蛹，全
国养蚕地区均产，其不仅是一种营养丰富的美食，还
具有很高的药用价值，中医上称其有和脾胃、祛风湿
长阳气之功效[1]。在现代，蚕蛹被医学证明具有促进肝
细胞再生和脂肪代谢、保护肝脏、延缓衰老、提高智
力、保护视力、增强免疫机能、降血糖、治疗冠状
动脉供血不足及抗癌等药理作用[2-4]。运用生物工程和酶
解技术从蚕蛹中提取出来的蛋白质水解产物含有丰富的
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蛋白质和多种氨基酸，不仅对白血病、骨髓衰竭、高
血压、肿瘤等疾病有治疗或辅助治疗的效果[5]，还可开
发成各类型的蚕蛹复合氨基酸营养保健产品，经常服用
不但能补充氨基酸提高身体机能，还具有降血脂、增强
免疫力、改善心血管功能和预防心血管疾病等功效[ 6 ]。
而蚕蛹蛋白水解产物的降血压[7]、抗氧化[8]、抗疲劳[9]等
功能更使其成为分离制备生物活性肽和研制功能性食
品、药品的优质原料，具有很高的营养、药用开发价
值和市场前景。
由于蚕蛹蛋白为部分可溶蛋白，蛋白水解后氨基
酸组成会发生相应的改变，这不仅影响水解液的营养
价值，还间接反映水解前后降血压等功能活性的变
化。虽然已有文献测定了蚕蛹蛋白 [ 1 0 ]、柞蚕蛹蜕[ 1 1 ]、
蚕丝蛋白[1 2]等相关产品的氨基酸含量，但对于蚕蛹蛋
白水解前后氨基酸组成的变化及对降血压活性的影响未
见全面分析。广西目前是全国最大蚕茧生产基地，蚕
蛹作为蚕茧生产的主要副产物产量大，本实验利用广
西本地缫丝后蚕蛹，研究蚕蛹蛋白水解前后氨基酸组
成与降血压活性之间的变化关系，采用柱前衍生化 -高
效液相色谱法[10,13]测定蚕蛹蛋白及不同分子质量水解产
物的氨基酸含量，分析水解前后及不同分子质量大小
水解产物的氨基酸组成变化特点，并对其降血压活性
进行验证，为广西地区蚕蛹蛋白深加工应用提供理论
数 据 。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
蚕蛹蛋白(蚕蛹购于宜州市嘉联缫丝厂) 自制；中
性蛋白酶 广西南宁庞博生物有限公司惠赠；18种氨基
酸标准品、血管紧张素转化酶(ACE)、马尿酰组胺酰亮
胺酸(HHL) 德国Sigma公司；9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)
上海Medpep有限公司；3-巯基丙酸(3-MPA) 英国
A lf a A e s a r 公司；甲醇、乙腈、四氢呋喃、三氟乙
酸(均为色谱纯) 天津四友色谱试剂厂；其他药品均为
分析纯。
1100、1200高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限
公司；510pH计 新加坡 Eutech有限公司；WH21型
涡旋混合器 上海沪西分析仪器厂；101AS22型电热
恒温干燥箱 上海实验仪器有限公司；HH-S2恒温水
浴锅 金坛市医疗仪器厂；冷冻干燥机 美国Labconco
公司。
1.2 氨基酸含量测定
1.2.1 蚕蛹蛋白酶解
在温控 50℃、pH7.0和反应时间 3h条件下中性蛋白
酶可控酶解蚕蛹蛋白[14]，反应后取离心上清液超滤，分
为 10kD以上(SN1)及 10kD以下(SN2)两个组分，分别冷冻
干燥保存。
1.2.2 样品配制
精确称取适量蚕蛹蛋白、SN 1、SN 2，置于安瓿瓶
中并加入 6mol/L HCl溶液，于 110℃水解 24h后抽真空
赶酸，移入 25mL容量瓶中定容，4℃保存；另取适量
样品加入 6mol/L NaOH溶液水解，用 1mol/L HCl溶液
中和定容至 25mL，4℃保存。
1.2.3 标准氨基酸混合液配制
精确称取18种标准氨基酸各25mg，用0.1mol/L HCl
溶液溶解定容至 25mL，配成标准氨基酸混合溶液，4℃
保存。
1.2.4 衍生化
精确称取OPA 270mg，以 2mL无水乙醇溶解，加
入 100μL 3-MPA后用 0.2mol/L硼酸缓冲液(pH10.8)定容
至 50mL配制为衍生剂 A；精确称取 FMOC 10mg，用
乙腈定容至 10mL配制为衍生剂B；两种衍生剂均冷冻避
光保存。
精确移取经 0.22μm膜过滤的 20μL氨基酸标准液或
样品液于离心管中，先加入衍生化试剂A 70μL，涡旋
混合器上混匀反应 30s；再加入衍生化试剂B 10μL，混
匀反应 2mi n，取适量进样分析。
1.2.5 色谱条件
使用Agilent 1100色谱系统。流动相A为 0.02mol/L
醋酸钠缓冲液(含 0.3‰三乙胺、0.5%四氢呋喃，pH10.3，
0.45μm过滤)、流动相B为色谱级甲醇、流动相C为色
谱级乙腈；色谱柱为Hypersil ODS C18色谱柱(4.0mm×
250mm，5μm)；检测器为二极管阵列检测器；柱温 35
℃；检测波长 0～34min为 338nm，34min后为 262nm；
梯度洗脱流速见表 1。
时间 /min
流动相体积配比 /%
流速 /(mL/min)
A相 B相 C相
0.0 100.0 0.0 0.0 0.6
4.0 98.0 1.0 1.0 0.6
10.0 92.0 4.0 4.0 0.8
35.0 55.0 25.0 20.0 1.0
40.0 55.0 25.0 20.0 1.0
表 1 梯度洗脱条件
Table 1 Gradient elution conditions
1.2.6 样品的定性与定量
在 1.2.5节的色谱条件下，取不同进样量的标准氨
基酸混合溶液进样分析，得到各氨基酸与其峰面积之间
的线性回归方程，即氨基酸标准曲线。样品中氨基酸
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种类根据标准品和样品液中各峰保留时间是否相似确
定，而各氨基酸浓度则根据其峰面积与氨基酸标准曲线
计算得出。
1.3 ACE抑制活性测定
1.3.1 抑制率测定
采用高效液相色谱法[15]测定ACE抑制活性：即取适
量样品、BBS缓冲液(pH10.3)和一定酶活的ACE溶液加
入离心管中，在 37℃条件下反应 10min；再加入定量
HHL反应 1h后以适量 1.0mol/L HCl溶液中止反应。反
应液 0.22μL 滤膜过滤，同时以不加样品为平行空白，
按 1.3.2节色谱条件进样分析。根据空白和样品反应液马
尿酸峰面积的不同，计算 A C E 抑制率。

A－B
ACE抑制率 /%=———× 100

A
式中：A为空白反应液中马尿酸的峰面积；B为样
品反应液中马尿酸的峰面积。
1.3.2 色谱条件
使用Agilent 1200色谱系统。流动相A为甲醇溶液
(15%甲醇 -85%超纯水，含 1‰三氟乙酸)；色谱柱为
Hypersil ODS C18色谱柱(4.0mm× 250mm，5μm)；检测
器为二极管阵列检测器；检测波长为 228nm；流速 1mL/
m i n。
2 结果与分析
2.1 标准氨基酸混合样品的标准曲线
将 18种氨基酸混合标准溶液衍生化后，按 1.2.5节
的色谱条件进样分析，由图 1可知各氨基酸得到了较好
的分离。
标准氨基酸混合溶液取不同进样量进样分析，以各
氨基酸的进样量为横坐标、峰面积为纵坐标做氨基酸标
准曲线。氨基酸标准曲线及相关结果见表 2。
氨基 保留时 回归 相关系 线性范 相对标准
酸 间 /min 方程 数 R2 围 /μg 偏差 /%
Asp 2.5 y＝ 3553.5x＋ 77.9 0.9960 0.0676～0.2704 5.54
Glu 3.2 y＝ 4469.8x＋ 22.1 0.9944 0.0786～0.3146 3.29
Ser 8.2 y＝ 3481.2x＋ 45.4 0.9992 0.0848～0.3392 6.01
His 10.2 y＝ 1968.6x－ 31.6 0.9970 0.0896～0.3584 3.02
Gly 10.7 y＝ 3818.9x－ 79.0 0.9978 0.0960～0.3840 4.52
Thr 11.3 y＝ 3690.3x－ 48.2 0.9959 0.0816～0.3264 3.95
Ala 13.9 y＝ 4423.7x－ 47.7 0.9932 0.0816～0.3264 1.46
Arg 14.6 y＝ 1928.2x－ 19.4 0.9935 0.0960～0.3840 4.15
Tyr 17.8 y＝ 1810.2x－ 32.2 0.9947 0.0976～0.3904 4.05
Cys 19.8 y＝ 2966.3x－ 16.0 0.9958 0.0784～0.3136 3.14
Val 21.0 y＝ 3232.3x－ 33.1 0.9941 0.0880～0.3520 4.12
Met 21.6 y＝ 2452.3x－ 20.0 0.9972 0.0848～0.3392 2.45
Trp 24.1 y＝ 1451.8x－ 4.8 0.9998 0.1024～0.4096 4.92
Phe 24.6 y＝ 2088.7x－ 7.8 0.9973 0.1040～0.4160 4.13
Ile 25.1 y＝ 2864.1x－ 39.5 0.9959 0.0994～0.3776 4.97
Leu 27.1 y＝ 2730.7x－ 32.2 0.9945 0.0912～0.3648 4.91
Lys 33.0 y＝ 1583.4x－ 1.9 0.9969 0.0928～0.3712 3.41
Pro 37.1 y＝ 6525.2x－ 429.6 0.9937 0.0912～0.3648 5.11
表 2 氨基酸的保留时间、线性范围、回归方程、相关系数及
精密度 (n＝ 5)
Table 2 Retention times, liner ranges, regression equations, correlation
coefficients and precision for the determination of amino acids
2.2 样品氨基酸分析
将蚕蛹蛋白、SN1及 SN2进样液相色谱分析，结果
见图 2 。
1. Asp；2. Glu；3. Ser；4. His；5. Gly；6. Thr；7. Ala；
8 . Arg；9 . Tyr；10 . Cys；11 . Val；12 . Met；13 . Trp；
1 4 . Phe；1 5 . I le；1 6 . L e u；1 7 . L ys；1 8 . P ro。下同。
图 1 标准氨基酸混合液高效液相色谱图
Fig.1 HPLC profile of mixed amino acids standards
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将图 2中的各氨基酸峰面积代入到表 2线性关系中，
获得蚕蛹蛋白、SN1及 SN2的氨基酸组成关系见表 3。
氨基酸
含量 /(mg/g)
蚕蛹蛋白 SN1 SN2
Asp 61.21 77.89 75.92
Glu 35.78 47.77 54.30
Ser 16.83 13.92 20.41
His 19.36 18.08 28.78
Gly 17.39 16.81 21.22
Thr 21.88 23.13 25.18
Ala 31.55 30.48 42.56
Arg 27.59 28.66 37.03
Tyr 21.94 21.96 50.63
Cys 24.02 25.95 34.22
Val 29.66 30.45 49.83
Met 14.74 14.04 20.47
Trp 51.72 41.53 69.43
Phe 27.42 25.66 48.01
Ile 22.07 21.78 33.62
Leu 37.87 36.97 62.72
Lys 83.32 89.05 120.67
Pro 43.61 33.60 66.81
总量 587.96 597.72 861.81
表 3 蚕蛹蛋白、SN 1 及 SN 2 氨基酸组成
Table 3 Amino acid compositions of silkworm pupa protein,
SN1 and SN2
表 3表明，蚕蛹蛋白、SN 1及 SN 2均含有 18种以
上的氨基酸，且 8种必需氨基酸分别占总量的 49.09%、
47.28%、49.89%，必需氨基酸与非必需氨基酸之比各为
96.43%、89.68%、99.56%，高于WHO/FAO提出的必
需氨基酸占总氨基酸 40%、必需氨基酸与非必需氨基酸
之比为 60%的参考蛋白模式，表明该酶解过程即能保证
水解产物的高营养价值又不会造成氨基酸被破坏。
此外，SN 2中疏水性氨基酸含量为 49.15%，高于
蚕蛹蛋白的 45.21%及 SN1的 40.55%。其中脯氨酸含量
为 7.75%，高于蚕蛹蛋白的 7.42%及 SN1的 5.62%；芳
香族氨基酸(Trp、Phe、Tyr)含量为 19.20%，高于蚕蛹
蛋白的 15.81%及 SN1的 13.59%，与相关研究得到的序
列上存在疏水性氨基酸残基[1 6-17 ]或羧基端存在脯氨酸、
芳香族氨基酸残基的多肽具有较高ACE抑制活性[18-19]的
结论相符。因此推断蚕蛹蛋白酶解后产物具有ACE抑制
活性，并且主要的抑制活性集中在 SN 2 组分中。
2.3 样品ACE抑制活性测定
取适量蚕蛹蛋白、SN1、SN2与 BBS溶液混合，在
ACE、HHL加入量一致的条件下配制为 200μL蛋白质量
浓度 0.2mg/mL的反应液，进样测定ACE抑制率，具体
结果见表 4。
样品 蛋白质量浓度 /(mg/mL) 抑制率 /%
蚕蛹蛋白 0.20 0.0
SN1 0.20 19.9
SN2 0.20 47.6
表 4 蚕蛹蛋白、SN1 及 SN2 组分 ACE 抑制活性
Table 4 ACE inhibitory activities of silkworm pupa protein,
SN1 and SN2
表 4表明，SN2的ACE抑制率为 47.6%，显著高于
SN1和蚕蛹蛋白的抑制率，验证了 2.2节的推论，即水
解后疏水性氨基酸组成的改变与ACE抑制活性的变化趋
势相同，且 A CE 抑制活性主要集中于 SN 2。
3 结 论
采用OPA-FMOC高效液相色谱法能较好的测定蚕蛹
蛋白、SN1及 SN2的氨基酸含量。结果表明 3种组分氨
基酸品种齐全，必需氨基酸和 18种氨基酸的配比含量均
符合 FAO/WHO所提出的参考蛋白模式，同时验证了水
解后疏水性氨基酸组成的改变可反映ACE抑制活性相应
的变化。SN2的ACE抑制率为 47.6%，其中疏水性氨基
酸、芳香族氨基酸(Trp、Phe、Tyr)和脯氨酸(Pro)含量
各占总氨基酸含量的 49.15%、19.20%和 7.75%。蚕蛹
蛋白水解物不仅营养价值高，更具有较高的ACE抑制活
性，可作为功能性食品、药品的添加物及进一步分离
纯化的原料，有很高的开发价值与广阔前景。
参 考 文 献 ：
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图 2 蚕蛹蛋白 (A)、SN1(B)和 SN2(C)中氨基酸的高效液相色谱图
Fig.2 HPLC profiles of amino acids in silkworm pupa protein,
SN1 and SN2
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