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微波辅助提取黄皮叶黄酮类化合物及其种类初步鉴别



全 文 :南 方 农 业 学 报
收稿日期:2012-08-01
基金项目:广东省教育部产学研结合项目(2011B090400121)
作者简介:张福平(1966-),高级实验师,主要从事园艺教学与研究工作,E-mail:hsfpzh@126.com
0 引言
【研究意义】黄皮[Clausenalansium(Lour.)Skeels]
为芸香科黄皮属常绿果树,原产于我国南方,在广东、
广西、福建和台湾种植较多,在美国、澳大利亚及东南
亚也有栽培(张福平和林晓萍,2009;赵丰丽等,2009;
赵青等,2010)。黄皮的果、叶、根、种子等均可入药,其
果实酸甜可口,风味独特,具有较高营养价值及保健
作用,有健脾开胃、祛痰化气、润肺止咳、去疳消积等
功效;黄皮叶性味属辛凉,有利湿、退黄、舒肝、健脾之
功效,民间常用于治疗急性黄疸型肝炎、感冒、胃痛、
微波辅助提取黄皮叶黄酮类化合物
及其种类初步鉴别
张福平1,刘晓珍1,汤艳姬1,陈焕彬2,吴远清2
(1韩山师范学院生物系,广东 潮州 521041;2潮州市新星农业开发有限公司,广东 潮州 515632)
摘要:【目的】研究黄皮叶黄酮类化合物的提取工艺条件及鉴别其黄酮种类,为黄皮叶的开发利用提供依据。【方
法】采用微波辅助提取黄皮叶黄酮类化合物,通过单因素试验及正交试验优化乙醇浓度、浸提温度、微波功率和微波
时间等提取参数,同时还对黄皮叶黄酮类化合物进行初步鉴别。【结果】对黄皮叶黄酮类化合物提取率影响较大的因
素是乙醇浓度和浸提温度,其最佳提取工艺为:乙醇浓度75%、固液比1∶20、浸提温度55℃、浸提时间1.5h、微波功率
160W、微波时间40s,该提取工艺条件下,黄皮叶总黄酮类化合物提取率达3.28%,比常规方法高0.27%(绝对值)。通
过颜色反应鉴别,初步确定黄皮叶提取液中黄酮的种类主要为双氢黄酮、查尔酮和黄酮醇等。【结论】以微波辅助提取
黄皮叶黄酮类化合物具有操作简单、成本低、用时短、稳定性好等特点,值得开发利用。
关键词:黄皮叶;黄酮类化合物;微波辅助提取;鉴别
中图分类号:R284.2 文献标志码:A 文章编号:2095-1191(2013)01-0126-05
DOI:10.3969/j:issn.2095-1191.2013.1.126
南方农业学报 JOURNAL OF SOUTHERN AGRICULTURE 2013,44(1):126-130
ISSN 2095-1191;CODEN NNXAAB http://www.nfnyxb.com
Microwave-assisted extraction and primary identification of
flavonoids from Clausena lansium leaves
ZHANGFu-ping1,LIUXiao-zhen1,TANGYan-ji1,CHENHuan-bin2,WUYuan-qing2
(1Department of Biology,Hanshan Normal University,Chaozhou,Guangdong 521041,China;2Chaozhou Xinxing
Agricultural Development Company Limited,Chaozhou,Guangdong 515632,China)
Abstract:【Objective】This research studied the extraction conditions and primary identification of flavonoids from the
Clausena lansium leaves in order to provide basis for the development and utilization of Clausena lansium leaves. 【Method】
Using the microwave-assisted extraction method, the flavonoids from Clausena lansium leaves were extracted, and relevant
parameters, including ethanol concentration, extraction temperature, microwave power, and extraction time, were tested
through the single factor experiment and orthogonal test. At the same time, flavonoids from Clausena lansium leaves were
preliminarily identified. 【Result】The extraction rate of flavonoids from Clausena lansium leaves was mainly affected by the
ethanol concentration and extraction temperature, and the optimum extraction condition was 75%ethanol concentration, 1∶20
solid-to-liquid ratio, 55℃ extraction temperature, 1.5 h extraction time, 160 W microwave powers, and 40 s microwave
time. Under the given optimal extraction condition, the total flavonoids extraction rate reached 3.28%, which was 0.27%
(absolute value) higher than traditional extraction methods. Through the color reaction identification, the liquid extractions
of flavonoids in Clausena lansium leaves were mainly identified as flavanone, chalcone, flavonol, etc. 【Conclusion】Ex-
traction of flavonoids from Clausena lansium leaves by the microwave-assisted method was easy to operate, money-saving,
time-saving, and stable, so the method was worthy of development and utilization.
Key words: Clausena lansium leaves; flavonoids; microwave-assisted extraction; identification
疝气及牛臌胀、猪哮喘等,黄皮叶还有降血脂的作用
(覃国忠和廖曼云,1987)。【前人研究进展】近年来,
已有研究表明,从植物体分离获得的黄酮类化合物具
有抗肿瘤、抗衰老、镇痛、调节免疫、防治心脑血管疾
病、降血糖等多种药理作用(曹纬国等,2003)。有关黄
皮黄酮类化合物方面的研究,梁云贞等(2010)通过单
因素试验和正交试验对微波辅助提取山黄皮叶黄酮
类化合物的工艺条件进行探讨,发现其最佳工艺条件
为:乙醇体积分数70%,料液比1∶35,微波功率240 W,
微波处理时间60 s,在此条件下,提取所得的山黄皮叶
黄酮类化合物含量为3.90%。苏秀芳等(2011)采用超
声波辅助法提取山黄皮果仁中的黄酮类化合物,结果
表明其最佳工艺为:温度70℃,60%乙醇,料液比1∶16,
微波功率440 W,提取时间10 min。周燕芳(2012)使用
超声波法提取黄皮叶中的黄酮,并用单因素试验和正
交设计优化提取工艺,结果显示,与浸提法相比,超声
波法能提高黄酮的提取率、缩短处理时间。李昌宝等
(2012)研究表明,超声强化提取山黄皮果总黄酮的优
化提取工艺条件为:提取温度70℃、液料比40∶1、乙醇
浓度60%、提取时间60 min,在优化条件下山黄皮果总
黄酮提取率为(3.82±0.02)%。【本研究切入点】微波辅
助提取是近年发展起来的一种快速、高效的新方法,
已广泛应用于天然产物有效成分的提取。梁云贞等
(2010)和苏秀芳等(2010)分别将微波辅助提取应用
到山黄皮和细叶黄皮叶黄酮类化合物的提取中,根据
中国植物物种信息数据库所显示,山黄皮(Clausena
indica)与细叶黄皮[Clausenaanisum-olens(Blanco)
Merr.]实为同一种植物,但与本研究所选用的黄皮是
不同植物,且目前有关黄皮叶黄酮种类鉴别方面的研
究尚未见报道。【拟解决的关键问题】采用微波辅助方
法提取黄皮叶黄酮类化合物,并通过单因素试验和正
交试验优化乙醇浓度、浸提温度、微波功率和微波时
间等提取参数,力求提取工艺简单快捷,同时还对黄
皮叶黄酮类化合物进行初步鉴别,以期为黄皮叶的开
发利用提供依据。
1 材料与方法
1. 1试验材料
新鲜黄皮叶于2012年5月12日上午10:30时采自
潮州市新星农业开发有限公司,采摘时挑选5年以上
树龄的成熟叶,采后将黄皮叶送往实验室,洗净后及
时烘干(60℃)粉碎,过筛(筛孔直径0.42 mm),然后用
石油醚脱色,经真空抽滤后得到黄皮叶样品,密封贮
藏于干燥箱中备用。新鲜猪油为市售;氢氧化钠、亚硝
酸钠、石油醚、硝酸铝、芦丁、无水乙醇、邻苯三酚、
Tris-HCl缓冲液、盐酸、抗坏血酸、铁氰化钾、三氯乙
酸、氯化铁、三氯甲烷、冰乙酸、碘化钾、可溶性淀粉、
硫代硫酸钠等均为国产分析纯。主要仪器设备有:
101-A数显式电热恒温干燥箱(上海阳光实验仪器有
限公司)、JJ-2组织捣碎机(江苏金坛市亿通电子有限
公司)、HH-8数显恒温水浴锅(江苏金坛市亿通电子有
限公司)、ESJ120-4电子天平(沈阳龙腾电子有限公
司)、WD800G微波炉(格兰仕微波炉电器有限公司)、
WFJ7200可见分光光度计[尤尼柯(上海)仪器有限公
司]、ZXZ-1旋片真空泵(浙江黄岩求精真空泵厂)及
RE-52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。
1. 2试验方法
1. 2. 1黄皮叶黄酮类化合物的测定 标准曲线的绘
制参考张福平等(2011)的方法。取定容好的提取液
1 mL置于50 mL容量瓶中,按绘制标准曲线的操作方
法测定系列样品的吸光值,然后通过总黄酮提取率的
公式计算黄皮叶总黄酮类化合物的提取率。
总黄酮提取率(%)= C×D×V
m×B×1000
×100
式中:V为提取液定容体积(mL),B为吸取测定体
积(mL),C为线性方程计算出的总黄酮浓度(g/L),D
为测定时定容体积(mL),m为称取的样品质量(g)。
1. 2. 2微波辅助提取条件的优化 在单因素试验
中,分别探讨乙醇浓度(35%、45%、55%、65%和75%)、
固液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30)、浸提温度(35、
45、55、65和75℃)、浸提时间(0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h)、
微波功率(160、320、480、640和800 W)、微波时间(20、
30、40、50、60 s)等对黄皮叶黄酮类化合物提取率的影
响。再根据单因素试验结果,选取乙醇浓度、固液比、
微波功率和浸提时间为考察对象,进行L9(34)正交试
验(刘魁英,2000)。正交试验因素水平如表1所示。
1. 2. 3验证试验 在最佳工艺条件下进行3次平行
试验,探究黄皮叶黄酮类化合物在此工艺条件下的提
取率稳定性。同时,对比常规提取法(乙醇浸提法)与
微波辅助提取法的提取率,进一步验证微波辅助提取
黄皮叶中黄酮化合物的优越性。
1. 2. 4黄皮叶黄酮类化合物的鉴别 在最佳工艺条
件下对黄皮叶黄酮类化合物进行提取,将滤液用旋转
蒸发器进行浓缩,使滤液中含有较高的黄酮类化合物
表 1 正交试验因素水平
Tab.1 Theleveloforthogonalexperimentalfactors
1 55 160 20 45
2 65 320 30 55
3 75 480 40 65
水平
Level
A:乙醇
浓度(%)
Ethanol
concentration
B:微波
功率(W)
Microwave
power
C:微波
时间(s)
Microwave
time
D:浸提
温度(℃)
Extraction
temperature
因素Factor
张福平等:微波辅助提取黄皮叶黄酮类化合物及其种类初步鉴别 127· ·
南 方 农 业 学 报
以便于鉴别,然后利用盐酸—镁粉法、盐酸—锌粉法、
氢氧化钠法和硼酸法对提取液中的黄酮类化合物进
行定性鉴别(中国科学院上海药物研究所植物化学研
究室,1981)。
2 结果与分析
2. 1标准曲线及回归方程
以芦丁浓度(g/L)为横坐标、吸光值为纵坐标,绘
制标准曲线(图1),且得到回归方程:y=30.766x+0.0144,
R2=0.9965。从图1中可以看出,芦丁浓度与吸光值具有
良好的相关性。
2. 2单因素试验结果
2. 2. 1乙醇浓度 由图2可知,随着乙醇浓度的增
加,黄皮叶黄酮类化合物提取率也随之增加。当乙醇浓
度达到55%~75%时,黄皮叶黄酮类化合物提取率相对
较高;此后随着乙醇浓度的继续增加,提取率反而降低。
因此,将提取剂乙醇浓度的较优水平定为55%~75%。
2. 2. 2固液比 由图3可知,随着固液比的增加,黄
皮黄酮类化合物提取率逐渐升高,固液比达到1∶20时
提取率最高;此后随着固液比的继续增加,其提取率
趋于稳定,变化不明显,故固液比以1∶20为宜,且不把
固液比作为正交试验考虑的因素。
2. 2. 3浸提温度 由图4可知,随着浸提温度的升
高,黄皮叶黄酮类化合物的提取率呈不断增加的趋势,
但浸提温度超过65℃后,提取率逐渐下降。可能是由
于有效成分受热被破坏,导致提取率下降,因此,黄皮
叶黄酮类化合物的浸提温度选择55~75℃较适宜。
2. 2. 4浸提时间 由图5可知,随着浸提时间的延
长,黄皮黄酮类化合物的提取率逐渐增加,但浸提时
间超过1.5 h后提取率略有下降。这是因为随着浸提时
间的推移,有效成分的溶出量逐渐增大,提取率增加,
但长时间的加热提取,会导致部分有效成分分解,而
致使黄酮类化合物提取率下降(张福平和林晓萍,
2009)。故将黄皮叶黄酮类化合物的最佳浸提时间定
为1.5 h,也不把浸提时间作为正交试验考虑的因素。
图 1 芦丁标准曲线
Fig.1 Standardcurveofrutin
图 2 乙醇浓度对黄皮叶黄酮类化合物提取效果的影响
Fig.2 Concentration of alcohol in fluen cing the effect of ex-
traction
图 3 固液比对黄皮叶黄酮类化合物提取效果的影响
Fig.3 Ratioofsolidtoliquidinfluencingtheeffectofextraction
图 4 浸提温度对黄皮叶黄酮类化合物提取效果的影响
Fig.4 Temperature of extraction in fluencing the effect of ex-
traction
图 5 浸提时间对黄皮叶黄酮类化合物提取效果的影响
Fig.5 Extractiontimeinfluencingtheeffectofextraction
128· ·
2. 2. 5微波功率 在160~320 W内,随着微波功率
的上升,黄皮叶黄酮类化合物的提取率逐渐增加;但
微波功率超过320 W后,提取率开始下降(图6),是由
于微波功率过高,料液中的黄酮类物质被破坏,导致
黄酮提取率下降(张福平等,2011),故黄皮叶总黄酮
提取的微波功率以160~480 W为宜。
2. 2. 6微波时间 由图7可知,微波时间对黄皮叶黄
酮类化合物提取率的影响与微波功率的相似,即短时
间的微波处理对黄酮类化合物的提取有促进作用。当
微波时间为30 s时,黄皮叶黄酮提取率达到最大值,但
超过30 s后,提取率显著下降。因此,黄皮叶黄酮类化
合物提取的微波时间以20~40 s为宜。
2. 3正交试验结果
由表2可知,各因素对黄皮叶黄酮类化合物提取
率的影响主次顺序为:A>D>B>C,即乙醇浓度>浸提
温度>微波功率>微波时间。由表3可知,乙醇浓度和浸
提温度达到显著差异,其中,乙醇浓度对黄皮叶黄酮
类化合物提取率的影响最大,其次是浸提温度,微波
功率和微波时间的影响较小,因此,确定黄皮叶黄酮
类化合物的最佳提取工艺为A3B1C3D2,即乙醇浓度
75%、微波功率160 W、微波时间40 s、浸提温度55℃。
2. 4验证试验结果
在最佳提取工艺条件下,进行3次平行试验,取其
平均值,结果得到微波辅助提取黄皮叶黄酮类化合物
的平均提取率为3.28%,提取效果具有较好的稳定性。
而常规提取方法(乙醇浓度75%、浸提温度55℃、固液
比1∶20、浸提时间1.5 h)的黄皮叶黄铜类化合物提取率
仅为3.01%,即优化后的微波辅助提取率比常规提取
方法高出0.27%(绝对值)。说明以微波辅助提取黄皮
叶黄酮类化合物具有明显的优越性。
2. 5黄皮叶黄酮类化合物的初步鉴别
提取液的颜色反应鉴别结果表明,盐酸—镁粉反
应颜色呈橙红色,说明提取液含有双氢黄酮;将盐
酸—锌粉加到提取液中无反应,说明提取液中含有查
尔酮或异黄酮;NaOH溶液反应呈深黄色,说明提取液
中含有黄酮醇;硼酸法反应呈浅黄色,也说明提取液
含有黄酮醇等。通过以上颜色鉴别,说明黄皮叶中的
确含有双氢黄酮、查尔酮、黄酮醇等黄酮类化合物。
3 讨论
微波辅助提取是近年发展起来的一种快速、高效
的新方法,已广泛应用于天然产物有效成分的提取。
微波辅助提取法是利用微波能破坏植物细胞的细胞
壁和细胞膜,从而达到提取细胞内有效成分的目的,
这与超声波所起的作用是相似的。此外,微波还能快
速加热整个提取体系,极大缩短提取时间,尤其在天
然产物的提取中较超声波辅助提取更具优势。微波辅
助提取的仪器设备比较简单廉价,适用面广,能极大
提高提取物中黄酮类化合物含量,且溶剂损耗较少。
表 2 L9(34)正交试验结果
Tab.2 Theresultsandanalysisoforthogonaltest
提取率(%)
Extractionrate
序号
Serialnumber
表 3 方差分析结果
Tab.3 Varianceanalysis
A 1.3898 2 0.6949 210.576 *
B 0.0266 2 0.0133 4.030
C(误差) 0.0066 2 0.0033 1.000
D 0.1524 2 0.0762 23.091 *
方差来源
Variance
source
离均差平方和
Squaresofdeviation
fromaverage
自由度
Degreeof
freedom
均方
Mean
square
F 显著性
Significant
F0.05(2,2)=19.00
图 6 微波功率对黄皮叶黄酮类化合物提取效果的影响
Fig.6 Microwavepowerinfluencingthe ffectofex raction
图 7 微波时间对黄皮叶黄酮类化合物对提取效果的影响
Fig.7 Microwavetimeinfluencingtheeffectofextraction
因素Factor
A B C D
1 1 1 1 1 1.64
2 1 2 2 2 1.93
3 1 3 3 3 1.75
4 2 1 2 3 2.55
5 2 2 3 1 2.29
6 2 3 1 2 2.59
7 3 1 3 2 3.28
8 3 2 1 3 2.86
9 3 3 2 1 2.69
k1 5.32 7.47 7.09 6.62
k2 7.43 7.08 7.17 7.80
k3 8.83 7.03 7.32 7.16
K1 1.77 2.49 2.36 2.21
K2 2.48 2.36 2.39 2.60
K3 2.94 2.34 2.44 2.39
R 1.17 0.15 0.08 0.39
张福平等:微波辅助提取黄皮叶黄酮类化合物及其种类初步鉴别 129· ·
南 方 农 业 学 报
总之,将微波辅助提取技术应用于黄酮类化合物提取
具有提取时间短、耗能低、效率高、不破坏有效成分等
特点(苏秀芳等,2010)。
本研究探索了乙醇浓度、固液比、浸提温度、浸提
时间、微波功率、微波时间等6个单因素对黄皮叶黄酮
类化合物提取率的影响,并选择乙醇浓度、浸提温度、
微波功率、微波时间4个因素进行了L9(34)正交试验,
结果表明,对黄皮叶黄酮类化合物提取率影响较大的
因素是乙醇浓度和浸提温度,达到显著差异,其他因
素影响相对较小。主要是由于黄酮类化合物溶于有机
溶剂,同时在分子中引入羟基(-OH)会使其极性增
大,在极性溶剂中的溶解度也相应增大,因此,微波辅
助提取黄皮叶黄酮类化合物时,可先使黄皮叶样品充
分吸收水分,以获得最佳提取效果。
4 结论
本研究结果表明,微波辅助提取黄皮叶黄酮类化
合物的最佳取工艺为:乙醇浓度75%、固液比1∶20、浸
提温度55℃、浸提时间1.5 h、微波功率160 W、微波时
间40 s,该提取工艺条件下,总黄酮类化合物提取率达
3.28%。说明以微波辅助提取黄皮叶黄酮类化合物具
有操作简单、成本低、用时短、稳定性好等特点,值得
开发利用。
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(责任编辑 兰宗宝)
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