全 文 ：蟠桃根腐病拮抗酵母菌的筛选与鉴定
张 建 ,李宝坤 ,毛晓英　(石河子大学食品学院 ,新疆石河子 832003)
摘要　[目的 ]筛选能有效防治蟠桃根腐病的生防菌株。 [方法]采用离体和活体法从果皮 、叶子及根际土壤中进行拮抗酵母菌的初筛
和复筛 ,对筛选出的蟠桃根腐病拮抗菌 L8进行形态学观察和生理生化鉴定。 [结果]从叶子中分离获得的L8对蟠桃根腐病有较强的拮
抗作用 ,在离体条件下抑菌圈直径可达到 17.2mm,在活体条件下蟠桃果实伤口腐烂率仅为 11.11%。形态学观察、生理生化试验发现
L8与德巴利酵母属酵母的形态学特征和生理生化性状相似 ,初步认为蟠桃根腐病拮抗菌L8为德巴利酵母属酵母。 [结论]蟠桃根腐病
拮抗菌 L8可作为有价值的拮抗菌进行下一步试验。
关键词　蟠桃;根腐病;拮抗;酵母菌;鉴定
中图分类号　S476+.1　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)35-15557-02
ScreeningandIdentificationofAntagonistsYeastagainstRootRotofFlatPeach
ZHANGJianetal　(ColegeofFood, ShiheziUniversity, Shihezi, Xinjiang832003)
Abstract　[ Objective] Theresearchaimedtoscreenyeaststrainsagainstrootrotofflatpeach.[ Method] Theprimaryandsecondaryscreen-
ingswereconductedontheantagonisticyeastfromfruit, leafandtheirrhizospheresoilsbyinvitroandinvivomethods, andmorphologicalob-
servationandphysiologicalandbiochemicalidentificationwereconductedontheselectedantagonisticyeastL8 againstrootrotofflatpeach.
[ Result] TheL8separatedfromleafhadstrongerantagonisticactiononrootrotofflatpeach;andinhibitionzonereached17.2mmunderin
vitrocondition.Therotrateoffruitinvivoonlyreached11.11%.ItwaspreliminarilythoughtthatantagonisticyeastL8againstrootrotofflat
peachbelongedtoDebaryomyces.[ Conclusion] TheantagonisticyeastL8againstrootrotofflatpeachbelongedtoDebaryomycesandhadstrong
antagonisticactiononthepathogenofrootrot.
Keywords　Flatpeach;Rootrot;Antagonism;Yeast;Identification
基金项目　石河子大学自然科学与技术创新项目(ZRKX2005076);石
河子大学 “ 263”青年骨干教师资助项目(SP04015)。
作者简介　张建(1979-), 男 ,陕西渭南人 ,在读博士 , 讲师 ,从事食品
微生物研究。
收稿日期　 2008-10-13
　　新疆素有 “瓜果之乡 ”的美称 ,蟠桃作为新疆的特色水果
之一 ,其香味浓郁 、爽口甘甜 、质地酥脆 ,赢得了国内外消费
者的注目和青睐。但蟠桃产季比较集中 ,前后销售近 1个月
的时间 ,在常温下难以贮藏 ,而且蟠桃采前所带病原菌较多 ,
所以在贮运销售过程中腐烂现象日趋严重 ,给瓜农和经销商
造成了巨大的经济损失 [ 1-3] 。目前 ,化学农药仍是作为防治
病害的主要措施 ,虽然效果较好 ,但易造成残留污染 ,诱发病
原菌抗药性的产生 ,为害非靶标生物等 ,不利于农业的可持
续发展。筛选和应用安全有效的生物菌剂已成为无公害蔬
菜生产的迫切需求。试验以新疆蟠桃为主要研究对象 ,对蟠
桃根腐病进行了拮抗菌的分离筛选和鉴定研究 。
1　材料与方法
1.1　蟠桃采后病原菌的分离 、纯化　按照柯赫氏法则 ,从具
有典型根腐病蟠桃果实病健交界处切取边长 5 mm的组织
块 ,在浓度 0.1%升汞中浸 30 s,无菌水清洗 3次 ,将组织块
放在 PDA平板上 , 28 ℃培养 48 h,从菌落边缘取边长 2 mm
菌丝块转接 PDA平板 ,重复操作 ,将分离到的病原菌进行多
次纯化培养 [ 4] 。
1.2　拮抗菌酵母的分离和纯化　从新疆石河子 143团蟠桃
园采回无病虫危害 、无伤口的蟠桃果实 、叶片和土样若干 。
分别取果皮组织 、叶片和土样 ,每份称取 10 g,加入到装有 90
ml豆芽汁葡萄糖液体培养基的锥形瓶中 ,同时加入 3 000单
位的链霉素 , 25 ℃下 120 r/min振荡培养 48 h,用无菌吸管吸
取 1.0 ml菌液 ,用浓度梯度法稀释成 10-1 ～ 10-7的浓度 ,将
10
-5 、10-6 、10-7浓度菌液分别取 0.1 ml涂布于倒有豆芽汁
葡萄糖琼脂培养基的平皿上 ,每稀释度重复 3次 ,置于 25 ℃
恒温培养箱中培养 48h,挑取培养特征相异的单个菌落进行
平皿划线纯化 [ 5] 。
1.3　拮抗菌酵母的筛选
1.3.1　离体筛选。离体筛选分 2步进行 ,先用琼脂块平板
法体外筛选 ,选出对根腐病表现抑制作用的菌株;然后把有
抑菌圈的菌株活化培养后分别用无菌水配成 106、107和 108
CFU/ml3种浓度 ,分别与 105、104和 103 spores/ml3种浓度
的蟠桃根腐病原菌等体积(0.1 ml)混合培养于含 20 ml豆芽
汁葡萄糖琼脂培养基的玻璃平皿上 ,每处理 3个重复 , 28 ℃
恒温培养 4 d,观察菌落生长情况 ,选出能完全抑制 3种浓度
蟠桃根腐病原菌生长的酵母菌菌株。
1.3.2　活体筛选。蟠桃果实用浓度 2%的次氯酸钠溶液消
毒 2 min,自来水冲洗干净 ,晾干。在蟠桃上打孔(4 mm×3
mm),每处理 3个蟠桃 ,每个蟠桃 3个孔 ,重复 3次 ,无菌水处
理作对照。取经过活化培养的酵母菌菌株 ,血球记数板法用
无菌水配成浓度为 1.6×108 CFU/ml的酵母菌悬浮液 ,取 20
μl注入孔内 , 2 h后注入 20 μl浓度为 2.5×105 spores/ml的
蟠桃根腐病原菌悬浮液 ,室温(25 ～ 27 ℃)贮藏 , 5 d后观察
记录腐烂率 ,并进行统计分析 ,选出对蟠桃采后病害有较好
拮抗作用的酵母菌株。
1.3.3　抗菌活性菌株的鉴定。对于筛选出的拮抗酵母菌株
根据其形态学特征和生理特性进行鉴定 [ 6] 。
2　结果与分析
2.1　离体筛选　经琼脂块法与体外筛选法 ,从 103株果实 、
叶片和土样酵母菌株中筛选得到 10株对蟠桃根腐病原菌有
较好拮抗作用的菌株(表 1)。
　　由表 1可知 ,蟠桃根腐病原菌浓度为 1.5×106 spores/ml
时 , 25 ℃恒温培养 48 h能看到明显的抑菌圈;蟠桃根腐病原
菌浓度为 1.5×105 spores/ml时 , 25℃恒温培养 48 h尚不能
看到明显的抑菌圈。从蟠桃叶片表面附生微生物群体中分
离的菌株 L8抑菌能力最强 ,抑菌圈直径达到 17.2 mm。相
同培养条件下培养至 72 h,蟠桃根腐病原菌浓度为低浓度
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2008, 36(35):15557-15558, 15570 责任编辑　张彩丽　责任校对　吴晓燕
(1.5×105 spores/ml)时的抑菌圈比相应的浓度为(1.5×106
spores/ml)时的抑菌圈小 ,且随着观察时间的推移 ,抑菌圈的
直径有明显缩小的趋势。
表 1　10株酵母菌对蟠桃根腐病原菌的抑菌圈大小
　　Table1　Diameterofbacteriostaticringof10yeaststorootrotof
flatpeach mm
菌株编号
Straincode
1.5×106 spores/ml病原菌
48h 72h
1.5×105 spores/ml
病原菌(72h)
L8 17.2 16.6 13.8
L12 14.3 13.9 12.7
L13 13.5 13.5 9.2
L19 13.3 10.5 12.6
F20 13.0 12.6 7.8
F22 12.6 9.7 9.5
F23 12.1 13.5 7.9
S17 11.9 11.3 10.3
S19 10.8 11.8 7.5
S20 9.6 9.2 8.8
　注:L表示来自叶片, F表示来自果实 , S表示来自土壤。
　Note:L, FandSstandforcomingfromleaves, fruitandsoil, respectively.
2.2　酶母菌混菌培养法离体筛选　3种浓度的酵母菌和 3
种浓度的蟠桃根腐病原菌等体积混菌试验表明 , 10株酵母菌
中有 6株酵母菌 ,浓度为 106、107和 108 CFU/ml3种浓度时 ,
能完全抑制 105、104 、103 spores/ml3种浓度的蟠桃根腐病原
菌;其他 4株酵母菌菌株不同程度地表现为不能抑制蟠桃根
腐病原菌的生长(表 2)。
表 2　混菌 4d后酵母菌株和根腐病原菌菌落生长情况
　　Table2　Colonygrowthofyeaststrainandroot-rotpathogenat
4daftermixing
菌株编号
Straincode
菌株浓度∥CFU/ml
Strain
concentration
根腐霉浓度∥spores/ml
Concentrationofroot-rotmildew
10
3
10
4
10
5
L8 107 ++/- ++/- ++/-
10
6 ++/- ++/- ++/-
10
5 ++/- ++/- ++/+
L12 107 +/+ ++/+ +/+
10
6 ++/+ +/++ +/+
10
5 ++/- ++/- +/+
L13 107 ++/- ++/- ++/-
10
6 -/++ +/+ +/+
10
5 -/++ -/++ +/+
L19 107 +/+ -/++ +/+
10
6 -/++ ++/- +/+
105 ++/- ++/- +/+
F20 107 -/++ -/++ -/++
106 -/++ -/++ -/++
105 -/++ -/++ -/++
F23 107 -/++ +/++ -/++
10
6 -/++ -/++ +/++
10
5 -/++ -/++ +/++
　注:“/”前表示酵母菌生长情况 , “ /”后表示根腐病原菌生长情况;“ ++”
表示 1/3以上面积 , “ +”表示少于 1/3面积, “ -”表示不见生长。
　Note:Symbolbefore“/” standsforthegrowthsituationofyeast, symbolaf-
ter“ /” standsforthegrowthsituationofroot-rotpathogen.“ ++”
standsforareamorethan1/3;“ +” standsforarealessthan1/3;
“ -”standsfornogrowth.
2.3　活体筛选　蟠桃接种酵母菌和根腐霉 10 d后 , 6株酵
母菌株处理的蟠桃果实都表现出不同程度地抑制蟠桃根腐
病原菌的发生 ,伤口腐烂率均低于对照 ,结果见表 3。
表 3　蟠桃接种酵母菌和根腐霉培养 10d后伤口腐烂率
　　Table3　Wounddecayrateofflatpeachat10dafterincubating
yeastandroot-rotmildew %
处理
Treatment
伤口腐烂率
Wounddecayrate
处理
Treatment
伤口腐烂率
Wounddecayrate
水 Water(CK) 66.67a L12 28.78ab
F23 44.45a L13 22.22ab
F20 35.53ab L8 11.11b
L19 33.33ab
　注:不同小写字母表示在 0.05水平有差异。
　Note:Diferentlowercasesmeandiferencesat0.05level.
　　由表 3可知 ,对照伤口腐烂率为 66.67%;平板离体抑菌
能力最强的菌株 L8,活体筛选试验条件下抑菌能力也较强 ,
其 10d后伤口腐烂率仅为 11.11%。同时可以看出从叶片
上分离的酵母菌比从果实上分离的酵母菌培养 10 d后伤口
腐烂率低。
2.4　抗菌活性菌株的鉴定　筛选出的 L8拮抗酵母菌株的
形态学特征见表 4。生理生化试验结果表明 ,抗菌活性菌株
可以发酵葡萄糖 、乳糖 、麦芽糖 、蔗糖 ,不能发酵尿素 。由此
可初步判定 L8号酵母菌为德巴利酵母属酵母。
表 4　L8的形态特征
Table4　MorphologicalcharacterofL8
形态
Morphology
特征
Character
形态
Morphology
特征
Character
细胞形态 椭圆形 菌落形态 表面和边缘光滑 ,
生长速度 较快 菌落突起,单个分
繁殖方式 单端芽殖 散 ,呈微红色
液体培养特征 有膜醭 ,沉淀物致密 假菌丝 无
孢子 有 感官 有酒香味
3　结论与讨论
酵母菌作为果蔬生物防治拮抗菌的最大优点是它能在
较干燥的果蔬表面生存 ,能迅速利用营养进行繁殖 ,且受杀
虫剂的影响小 [ 7] 。酵母菌不产生抗菌素 ,可以避免病菌对抗
菌素产生抗性而降低生物防治的抑病效果 [ 8] 。该试验筛选
出的酵母菌菌株 L8能够显著抑制蟠桃采后根腐病的发生 ,
抑制率达到 17.2%,可作为有价值的拮抗菌进行下一步
试验。
一般认为从果实蔬菜表面或叶片等上面分离获得的拮
抗菌较好 ,一方面拮抗菌适应果蔬表面的微生态环境;另一
方面它一般对人 、畜无毒 。试验从蟠桃的叶叶片上分离得到
1株酵母菌株 L8,能够使采后蟠桃果实的腐烂率降低为
11.11%,经过初步鉴定认为 L8为德巴利酵母属酵母。不
过 ,拮抗菌的分离和筛选也不是教条的 , Filnow等从空气 、海
水 、大蒜等上面分离筛选到了能有效防治苹果灰霉病的酵母
菌 [ 9] ,因此 ,只要有抑菌效果且无害的拮抗菌 ,都可用于采后
生物防治 ,试验的后期工作一部分重点也应该放在不同来源
的拮抗菌筛选当中。
(下转第 15570页)
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表 1　不同光源下动物毛纤维的偏振光图谱特征
Table1　Characteristicsofthepolarizedlightmapofanimalfiberunderdiferentlightsources
动物名称及毛发部位Animalnameandhairsite
透射光一、三象限Thefirstandthirdquadrantsoftransmitedlight
透射光二、四象限Thesecondandfourthquadrantsoftransmittedlight
反射光一、三象限Thefirstandthirdquadrantsofreflectedlight
反射光二、四象限Thesecondandfourthquadrantsofreflectedlight
华南虎头部毛发 髓质为紫红色连续型 ,皮质层的彩色干涉条纹由内向外分别是黄色、浅绿色、桃红色、紫红色
髓质为紫红色连续型 ,皮质层的彩色干涉条纹由内向外分别是黄白色、紫红色
髓质部分颜色较透射光下变淡 , 为棕黄色;皮质层的干涉条纹颜色暗淡 ,分别为黄色、浅绿色、桃红色
髓质部分颜色较透射光下变淡 ,为棕黄色;皮质层的干涉条纹颜色更加暗淡 ,分别为浅黄色、浅桃红色
华南虎背部毛发 髓质为紫红色连续型 ,皮质层的彩色干涉条纹由内向外由绿色渐变到红色
髓质为紫红色连续型 ,皮质层的彩色干涉条纹由内向外分别是黄、紫红、浅黄
髓质部分颜色较透射光下变淡 , 为浅橘黄色;皮质层的干涉条纹颜色暗淡 ,由浅绿渐变到桃红
髓质部分颜色较透射光下变淡 ,为浅橘黄色;皮质层的干涉条纹颜色暗淡 ,分别为深橘、浅黄、深桃红
华南虎尾部毛发 髓质为紫红色连续型 ,皮质层的彩色干涉条纹由内向外分别是粉红、浅黄、紫红
髓质为紫红色连续型 ,皮质层的彩色干涉条纹由内向外分别是浅黄、桃红
髓质部分颜色较透射光下变淡 , 为浅黄色;皮质层的干涉条纹颜色暗淡 ,分别为桃红、浅橘黄
髓质部分颜色较透射光下变淡 ,为浅黄色;皮质层的干涉条纹颜色更加暗淡 ,分别为桃红、浅黄
东北虎头部毛发 髓质为紫红色连续型 ,皮质层的彩色干涉条纹由内向外由黄色渐变到紫红色
髓质为紫红色连续型 ,皮质层的彩色干涉条纹由内向外由黄白色渐变到紫红色
髓质部分颜色较透射光下变淡 , 为浅黄色;皮质层的干涉条纹颜色暗淡 ,由橘黄色渐变到黄色
髓质部分颜色较透射光下变淡 ,为浅橘黄色;皮质层的干涉条纹颜色更加暗淡,基本上为浅橘黄色
东北虎背部毛发 髓质为紫红色连续型 ,皮质层的彩色干涉条纹由内向外分别为浅绿、黄、桃红、紫红
髓质为紫红色连续型 ,皮质层的彩色干涉条纹由内向外由黄色渐变到紫红色
髓质部分颜色较透射光下变淡 , 为黄色;皮质层的干涉条纹颜色暗淡 ,由黄色渐变到红色
髓质部分颜色较透射光下变淡 ,为黄色;皮质层的干涉条纹颜色更加暗淡 ,由黄色渐变到紫红色
东北虎尾部毛发 髓质为深桃红色连续型,皮质层的彩色干涉条纹由内向外分别为橘红、绿、浅桃红
髓质为深桃红色连续型 ,皮质层的彩色干涉条纹由内向外分别为橘红、浅黄
髓质部分颜色较透射光下变淡 , 为浅黄色;皮质层的干涉条纹颜色暗淡 ,由橘黄色渐变到黄色
髓质部分颜色较透射光下变淡 ,为浅橘黄色;皮质层的干涉条纹颜色更加暗淡,为浅橘黄色
条纹的差异以及髓质层和皮质层的宽窄变化仍存在差异 ,推
测可能是不同部位毛发的粗细 、形态上的不同以及毛发的髓
质层和皮质层发达程度不同造成的 ,同时 ,也说明利用毛发
区分不同亚种(种)动物时需对应比较相同部位的毛发。
(3)通过对不同亚种动物相同部位毛纤维形成的图谱对
比发现 ,髓质层的颜色变化不是很大 ,但是髓质层所占的比
例以及皮质层的彩色干涉条纹之间的差异很大 ,这种差异应
该是亚种之间的差异 ,在亚种的区别上具有一定的价值。
(4)偏振光能将纤维结构的某些特征转换成彩色干涉条
纹 ,很好地反映出检材的差异 ,并且随着偏振角度的改变 ,检
材的色反差也会发生变化。利用偏振光观察动物毛发的特
点是不损坏检材 、快速省时 、检材用量少 、易学易掌握 ,很适
合基层刑事技术检验部门和侦查破案工作的需要。如果能
进一步深入研究 ,积累更多的资料 ,将会更好地应用于野生
动物案件的侦办 ,从而有力地打击违法犯罪分子 ,更好地保
护野生动物。
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